本发明涉及娃儿藤碱脱氢衍生物在抗植物烟草花叶病毒病方面的应用。
背景技术：
1935年，第一个菲并吲哚里西啶生物碱——娃儿藤碱(tylophorine)被分离鉴定出来(indianj.med.res.，1935，22，433-441)，由于其独特的化学结构、显著的生物活性，受到国内外化学家的广泛关注。本课题组首次发现该类生物碱对危害极大的烟草花叶病毒(tmv)具有非常好的抑制活性，并以此为基础开展了广泛的结构修饰和改造，优化出了高效的植物病毒病防治药剂nk-007。虽然菲并吲哚里西啶生物碱具有非常好的生物活性，但是也存在中枢神经系统毒性较大、水溶性差、对光和热不稳定的缺点，影响它的实际应用。我们研究发现娃儿藤碱在光照下主要是发生两步脱氢反应，生成两种脱氢产物。我们首次对这两种脱氢产物在抗植物烟草花叶病毒方面的应用进行了研究，发现其具有优异的抗tmv活性。
技术实现要素：
本发明的内容是关于如下结构所示的一类娃儿藤碱脱氢衍生物i，具体包括化合物1和化合物2，在抗烟草花叶病毒病方面的应用。
本发明中的娃儿藤碱脱氢衍生物可以按以下方法制备：
本发明通式i所述的娃儿藤碱脱氢衍生物(化合物1)，可以通过方法一制备：中间体首先在微博辅助下进行甲酰化反应得到中间体2，然后通过bischler-napieralski反应得到化合物1，
本发明通式i所述的娃儿藤碱脱氢衍生物(化合物2)可以通过方法二制备：娃儿藤碱的氯仿溶液在光照下发生脱氢反应得到化合物2，
本发明所述的娃儿藤碱脱氢衍生物具有优异的抗植物病毒活性，部分化合物的抗tmv活性优于商品化品种病毒唑，可有效的防治烟草，水稻，辣椒，番茄，甘薯，瓜类，玉米等植物的病毒病，尤其适合防治烟草花叶病毒病。
本化合物能够作为抗烟草花叶病毒制剂直接使用，也可以加载体使用，还可以作为抗烟草花叶病毒剂和其他的抗烟草花叶病毒制剂，如苯并噻二唑(bth)，噻酰菌胺(tdl)，4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸(tdla)，d或l-β-氨基丁二酸，病毒唑，宁南霉素，联三唑类化合物xy-13和xy-30，病毒a，水杨酸，氨基寡糖，多聚寡糖形成互作组合物使用。这些组合物表现出增强或者叠加作用。
具体实施方式
实施例19-脱氢娃儿藤碱盐酸盐(化合物1)的合成(方法一)
35ml的微波反应器中加入中间体10.2g(0.52mmol)，甲酸乙酯20ml，设定t＝100℃，p＝100w，pmax＝250psi，反应1h。减压脱溶，二氯甲烷稀释，3mol/l的盐酸洗涤，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，常压柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝40∶1)，脱溶得中间体2白色固体0.2g，收率95％。
50ml的反应瓶中加入中间体20.2g(0.49mmol)，无水甲苯20ml，室温搅拌下加入三氯氧磷0.75g(4.89mmol)，加热回流反应1h，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤，得橙黄色固体0.2g，收率95％，熔点：255-256℃；1hnmr(300mhz，cdcl3)δ11.07(s，1h)，8.05(s，1h)，7.59(s，1h)，7.45(s，1h)，7.16(s，1h)，5.34-5.04(m，1h)，4.42-4.29(m，1h)，4.20(s，6h)，4.09(s，6h)，3.96-3.82(m，1h)，3.78-3.60(m，1h)，3.11-2.89(m，1h)，2.70-2.52(m，1h)，2.46-2.29(m，1h)，2.22-2.00(m，2h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ160.7，151.8，149.6，148.8，148.4，133.3，129.0，122.8，122.1，120.8，117.2，104.0，103.9，102.0，101.4，58.1，57.2，55.5，55.4，55.2，53.6，30.7，29.1，22.2；hrms(esi)calcdforc24h26no4(m+h)+392.1856，found392.1861.
实施例29，13a，14-脱氢娃儿藤碱盐酸盐(化合物2)的合成(方法二)
在干净透明的100ml的圆底烧瓶中加入娃儿藤碱39.3mg(0.1mmol)，氯仿50ml，用氩气置换体系中的空气三次。在太阳光直射的条件下室温搅拌反应，直至转化完全。减压脱溶，用碱性氧化铝柱进行常压柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝40∶1洗脱)，得到黄绿色固体。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ10.42(s，1h)，9.05(s，1h)，8.00(s，2h)，7.59(s，2h)，5.02-4.87(m，2h)，4.12-3.98(m，12h)，3.58-3.48(m，3h)，2.63-2.53(m，2h).13cnmr(100mhz，dmso)δ152.7，150.6，149.8，149.4，149.1，138.2，137.9，127.5，123.9，123.2，119.3，118.5，116.2，106.1，104.6，104.4，104.3，57.9，56.3，56.1，56.0，55.9，30.9，21.9.hrms(esi)calcdforc24h24no4(m-cl)+390.1700，found390.1705.
实施例3：常规活体生测法测抗烟草花叶病毒的活性
1、病毒提纯及浓度测定：
病毒提纯及浓度测定参照南开大学元素所生测室编制的烟草花叶病毒sop规范执行。病毒粗提液经2次聚乙二醇离心处理后，测定浓度，4℃冷藏备用。
2、化合物溶液配制：
称量后，原药加入dmf溶解，制得1×105μg/ml母液，后用含1‰吐温80水溶液稀释至所需浓度。
3、活体保护作用：
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1‰吐温80水溶液对照。24h后，叶面撒布金刚砂(500目)，用毛笔蘸取病毒液(病毒浓度10μg/ml)，在全叶面沿支脉方向轻擦2次，叶片下方用手掌支撑，接种后用流水冲洗。3d后记录病斑数，计算防效。
4、活体治疗作用：
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，用毛笔全叶接种病毒，病毒浓度为10μg/ml，接种后用流水冲洗。叶面收干后，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1‰吐温80水溶液对照。3d后记录病斑数，计算防效。
5、活体钝化作用：
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，将药剂与等体积的病毒汁液混合钝化30min后，摩擦接种，病毒浓度20μg/ml，接种后即用流水冲洗，重复3次，设1‰吐温80水溶液对照。3d后数病斑数，计算结果。
6、离体作用：
摩擦接种珊西烟适龄叶片，病毒浓度10μg/ml，接种后用流水冲洗。收干后剪下，沿叶中脉对剖，左右半叶分别浸于1‰吐温水及药剂中，30min后取出，于适宜光照温度下保湿培养，每3片叶为1次重复，重复3次。3d后记录病斑数，计算防效。
抑制率(％)＝[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]×100％
表1娃儿藤碱脱氢衍生物的抗tmv活性
从表1可以看出，这两类娃儿藤碱脱氢衍生物都具有很好的抗tmv活性，优于商品化品种病毒唑。其中化合物1的抗tmv活性与娃儿藤碱相当，而化合物2的抗tmv活性达到了nk-007的水平。因此这两类娃儿藤碱脱氢衍生物具有极大的开发价值。