一种甘蓝型油菜显性核不育恢复系的选育方法与流程

本发明涉及甘蓝型油菜育种领域，具体涉及一种甘蓝型油菜显性核不育恢复系的选育方法。

背景技术：

甘蓝型油菜显性核不育三系包括纯合两型系、临保系和恢复系，其中，恢复系的基因型为rfrf，表现为可育，没有可以用于选择的表现性状。

在常规杂交育种中，获得稳定遗传的后代或株系一般要经过5～8代性状选择。传统的甘蓝型油菜恢复系的选育从回交一代开始，选株自交，同时以显性核不育纯合型不育株为母本，对所选单株进行测交，才能最终获得基因型为rfrf的恢复系，但是，该方法选育周期长，选育难度大，每个生长周期能保留的株系数量有限。

中国发明专利zl89109310.9中公开了一种甘蓝型油菜核雄性不育三系制种方法(参见图1)，其提出甘蓝型油菜显性核不育性受2对显性基因ms和rf互作控制，ms为显性不育基因，rf为显性上位基因，rf能抑制ms不育基因的表达，从而恢复可育。在此基础上，其提供了恢复系的选育方法，用不同品种的自交系与核不育株进行测交，若测交一代全可育，则该测交父本自交系为恢复系。利用该方法所选育出的恢复系，一般要经过5～8代的自交才能稳定，选育周期长、难度大，每个生长周期能保留的株系数量有限。

目前，甘蓝型油菜显性核不育恢复系资源较为匮乏，所以，快速、高效地选育高度纯合的显性核不育恢复系，对甘蓝型油菜杂交种的选育非常重要。

单倍体加倍植物每对染色体上的成对基因都是纯合的，自交产生后代不会发生性状分离，目前，主要通过花药培养或小孢子培养获得单倍体植株，但是，在花药培养的过程中，花粉粒、花粉愈伤组织、花药壁细胞等均有可能进行增殖，最终获得的愈伤组织或胚状体就不可能是纯粹的配子体起源，所得的再生植株也就不可能一定是单倍体植株。

小孢子具有单细胞、单倍性、较高分化同步化、分散性好的特点，并且，在培养时不易受到花药壁、花丝等体细胞的影响而产生真正的单倍体植株，进而加倍成为双单倍体，因此，小孢子培养技术能有效地解决花药培养带来的问题，花药培养逐渐被小孢子培养所替代。

小孢子培养是研究花粉细胞分化条件、胚胎发生和形态建成机理的一种较为理想的方法，因此，该技术一直受到各国油菜育种家的普遍青睐。但是，甘蓝型油菜小孢子的胚状体再生频率受诸多方面因素的影响，再生频率仍然较低。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜显性核不育恢复系的选育方法，通过甘蓝型油菜小孢子培养技术，能够快速获得基因型为msmsrfrf，且遗传背景纯合的恢复系，该方法操作简单、可行性高，选育周期短、效率高，可获得大量的dh系，能够在甘蓝型油菜显性核不育杂交育种中得到良好应用。

本发明的技术构思为：

以优良的纯合型不育株为母本，以恢复系为父本，杂交获得基因型为msmsrfrf的f1代，f1代的小孢子的基因型为msrf和msrf，然后以甘蓝型油菜小孢子培养技术对f1代植株的游离小孢子进行诱导培养，以获得大量的dh株系；将诱导成功的dh株系移栽到田间，在花期，将加倍成功的可育dh系套袋自交，可育的dh系即为基因型为msmsrfrf的显性核不育恢复系。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种甘蓝型油菜显性核不育恢复系的选育方法，包括以下步骤：

1)获得杂交f1代

以基因型为msmsrfrf的纯合两型系不育株为母本，以基因型为msmsrfrf的显性核不育恢复系为父本，杂交，获得基因型为msmsrfrf的f1代种子；

2)小孢子培养

以f1代植株为供体，取长度为3～4mm的花蕾，消毒清洗，加入b5培养液研磨、离心，分离出游离小孢子，f1代小孢子的基因型有msrf和msrf两种，在含秋水仙碱的nln-13培养液中对小孢子进行暗培养，温度32℃～35℃，培养时间36h～48h，离心，去上清液，将沉淀的小孢子转移到新鲜的nln-13培养液中，22℃～25℃继续暗培养，待肉眼可见颗粒状的胚状体后，在摇床上继续培养1-2周，得到子叶型胚状体；

将子叶型胚状体转移到固体b5培养基上，光照培养，诱导产生幼苗，扩繁拷贝幼苗，分别得到基因型为msmsrfrf和msmsrfrf的dh系植株，其中，基因型为msmsrfrf的dh系不育，基因型为msmsrfrf的dh系可育；

3)自交

将扩繁得到的dh系幼苗移栽到田间，在花期，筛选出雄性可育的dh株系，套袋自交，获得显性核不育恢复系种子。

进一步，步骤1)中，所述的纯合两型系不育株为hy15a，作为父本的显性核不育恢复系为hf06。

进一步，步骤3)中，对dh幼苗，无需等到花期，利用分子标记手段进行检测，筛选出基因型为msmsrfrf的植株，获得显性核不育恢复系。

优选地，所述秋水仙碱的浓度为50-70mg/l。

本发明对甘蓝型油菜f1代植株的游离小孢子进行分离，通过小孢子培养技术获得胚状体和再生植株，再生植株为单倍体，经染色体加倍后产生纯合二倍体单株，这种二倍体单株的各种遗传性状已纯合，多代自交不会发生性状分离，因此，可以快速使性状纯合，显著缩短了育种年限，加速育种进程。

本发明在诱导时加入秋水仙碱，用浓度为50-70mg/l的秋水仙碱处理小孢子后，产胚率为1.98-3.56/蕾，产胚率提高，随秋水仙碱浓度的增加，产胚率呈下降趋势，浓度过高时，便无法得到胚状体。可见，利用本发明的秋水仙碱的浓度，能显著提高产胚率，相对较高浓度的秋水仙碱处理分离小孢子不利于提高产胚率。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

利用本发明，获得的dh恢复系，由单倍体直接加倍而成，遗传背景完全纯合，不需要测交鉴定，可以直接利用该dh恢复系进行油菜杂交育种。

利用传统方法选育显性核不育恢复系时，需要通过不少于5个生长周期的强迫自交，获得的恢复系也只能是比较纯合，难以完全纯合，而且自交系数量有限，而利用本发明，只通过一个生长周期，恢复系的基因型就能达到完全纯合，大大缩短育种周期，而且能获得大量的恢复系。

附图说明

图1为现有技术中的显性核不育杂交种的生产模式。

图2为本发明的甘蓝型油菜小孢子培养选育恢复系的示意图。

图3-图6为本发明从小孢子到发育成植株的全过程，其中，图3为小孢子，图4为胚状体，图5为诱导成苗，图6为幼苗。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例一种甘蓝型油菜显性核不育恢复系的选育方法

1.f1代的获得

以基因型为msmsrfrf的纯合两型系hy15ab不育株为母本，以基因型为msmsrfrf的显性核不育恢复系hf06为父本，杂交，获得基因型为msmsrfrf的f1代种子。

hy15ab是上海市农业科学院周熙荣研究员于2010年选育的一种新的显性核不育纯合两型系，其获得过程及特征如下：

以双低油菜品种“沪油15”为轮回亲本，分别与显性核不育双低纯合两型“48ab”的不育株和双低恢复系“pg-华”杂交，并进行2次回交，然后通过复交将显性核不育的ms不育基因和rf恢复基因导入到同一群体，再经过自交、兄妹交和测交等育种手段，选育农艺性状与双低油菜品种“沪油15”接近的双低纯合两型系“hy15ab”。

该纯合两型系内可育株的基因型为msmsrfrf，不育株的基因型为msmsrfrf，两者各占50％。不育株花药空瘪，无花粉，套袋自交不结实，且不育性稳定，不受环境条件的影响，该纯合两型系的可育株含油量43.2％，芥酸含量0.6％，硫苷含量14.2％，农艺性状优良。

hf06是上海市农业科学院周熙荣等选育的显性核不育恢复系，其获得过程及特征如下：

以上海市农业科学院作物育种栽培研究所选育的“pg华”为母本，以抗倒伏、耐落粒的双低品种“沪油17”为父本进行杂交，然后以“沪油17”为轮回亲本进行回交。从bc1代开始选株自交，同时以显性核不育纯合型不育株为母本，对所选单株进行测交，最终获得基因型为msmsrfrf的恢复系“hf06”，与显性核不育系(ms-rfrf)杂交，其后代基因型为ms-rfrf，全部为可育。

“hf06”恢复系含油率为44.4％，芥酸含量为0.0％，硫代葡萄糖苷含量为9.7μmol/g，抗倒性较强、耐落粒，该恢复系的低世代株系农艺性状出现分离，经过5个生长周期的自交，其农艺性状才基本稳定。

2.小孢子培养

以f1代植株为供体(hy15a×hf06)，在花蕾期，每次从油菜花序上取长度为3～4mm的花蕾，表面消毒后用无菌水清洗3次；加入b5培养液研磨，用40μm尼龙网过滤，滤液经过100rpm离心5-8min，吸去上清液后，再向离心管中加含秋水仙碱的nln-13培养液密封(参见图3)，置于32℃的恒温箱中暗培养48h，离心，吸去上清液，加入nln-13培养液分装到培养皿中，密封，置于25℃的恒温箱中暗培养，当肉眼可见到胚状体后转到摇床上继续培养1-2周，得到子叶型胚状体，参见图4；

将胚状体转移到固体b5培养基上，在25℃的光照培养室中培养、诱导形成幼苗(参见图5-图6)，并将不同基因型的幼苗扩繁多个拷贝，以保证每个基因型都能存活；

将幼苗移栽到田间，在花期，将可育dh株系套袋自交，获得一批显性核不育恢复系。

3.结果及数据

在油菜花期，对供体材料f1(hy15a×hf06)进行小孢子培养，获得了1407个胚状体，经过诱导培养获得了862个单株，经花期鉴定，623个dh系表现为可育，对这些可育的dh系进行自交，筛选出农艺性状和品质性状优的株系，命名为恢复系hf10，其含油量为42.9％。

4.利用恢复系hf10配置杂交种的区试表现

利用获得的恢复系hf10配置了杂交组合“核杂22号”，在上海市区试中，平均亩产161.11公斤，比对照沪油21增产14.00％，增产达显著水平；产油量77.48公斤，增12.14％。