一种高效的易成花荔枝新种质育种方法与流程

本发明属于荔枝遗传育种技术领域，具体涉及一种高效的易成花荔枝新种质育种方法。

背景技术：

荔枝(litchichinensissonn.)为无患子科荔枝属植物，起源于中国，因果实形、色、香、味俱佳和营养丰富而誉称“岭南果王”驰名中外。以往生产经验表明低温是荔枝完成成花诱导所需的关键外界环境因子，还发现极少数的荔枝品种(如“三月红”、“褐毛荔”)仅需要较短时间的低温就能够完成成花诱导，容易成花，一般在2月左右开花，因而称为易成花荔枝品种；而大多数的荔枝品种(如“桂味”、“糯米糍”、“紫良喜”)必须经过整个冬天的低温才能完成成花诱导，难成花，一般在4月左右开花，因而称为难成花荔枝品种。研究调查发现易成花荔枝品种主要起源于我国荔枝产区的北方地区(如云南等地)，而难成花荔枝品种主要起源于荔枝产区的南方地区(如海南等地)。由于两者开花时间不同(相差两个月左右)，因此在自然界中人类未干预情况下两者存在生殖隔离。以往生产经验还表明：冬天低温不足是荔枝不能稳定成花的主要原因，特别对于难成花荔枝品种来说更是如此；还有荔枝的花期和熟期是相关联的，一般而言易成花荔枝品种是早熟荔枝品种，而难成花荔枝品种是晚熟荔枝品种，当然荔枝的熟期也与果实发育的快慢有关。

在荔枝生产中，每年由于成花不稳定所造成的产量没保障是广大果农长期以来面临的一个主要难题。其中一个主要原因在于荔枝的栽培品种结构不合理：难成花荔枝品种所占比例过高，而易成花荔枝品种所占比例偏少，产量受冬天低温不足影响很大。在荔枝生产中另一个主要难题是易、难成花荔枝品种栽培结构的不合理，加上荔枝采后保鲜难等难题，也导致了荔枝在6、7月份集中上市，常造成价格低廉，广大果农即使丰产年也不丰收，削弱了其栽培荔枝的积极性，严重制约着荔枝经济效益的提高。造成以上现象的一个主要原因在于目前可满足商品性栽培的优质易成花荔枝品种稀少。目前虽有少数的易成花荔枝品种(如“三月红”)，但由于其品质差而被逐渐淘汰掉。难成花荔枝品种(如“桂味”和“糯米糍”)，虽然成花受冬天低温不足影响很大，但是由于其高品质而受到广大消费者的亲睐，逐渐得到大面积推广，可是每年的产量得不到保障，如2017年由于受冬天低温不足的影响(暖冬)，产量减产80％左右。因此，在荔枝采后保鲜难题尚未取得突破的情况下，选育易成花优质荔枝品种，为易、难成花荔枝品种栽培结构的优化调整提供品种支撑，保证产量，拉长鲜果供应期，成为解决以上问题的一个重要途径。

发明人通过人工设施栽培在夏季对荔枝开展反季节低温诱导实验，有力证明了低温是诱导荔枝成花的关键环境因子，对荔枝的叶片和顶芽开展局部低温诱导实验，证明了荔枝的叶片是感受低温诱导信号的关键器官，为此发明人对低温处理0h、8h、32h、9d、27d、47d和61d的叶片开展rna-seq和小rna高通量深度测序。其中通过rna-seq筛选到一个荔枝成花关键基因lcft1，进一步研究证明低温是通过诱导荔枝叶片中lcft1基因的表达进而导致其成花(相关结果以promoterdifferenceoflcft1isaleadingcauseofnaturalvariationoffloweringtimingindifferentlitchicultivars(litchichinensissonn.)发表在plantscience,2015,241:128-137)。进一步研究发现，荔枝lcft1基因启动子存在两个类型，分别命名为“eft”型启动子和“dft”型启动子(注：“eft”为“easy-floweringtype”首字母缩写；“dft”为“difficult-floweringtype”首字母缩写)，进而导致3种lcft1基因型荔枝，分别为纯合“eft”型荔枝、纯合“dft”型荔枝以及两者的杂合型荔枝。同时研究还发现含有“eft”型启动子的荔枝容易成花即使遇到暖冬的年份，如易成花荔枝品种(如“三月红”、“褐毛荔”、“桂早荔”等)都是纯合“eft”型荔枝或为杂合型荔枝，它们只需要较短时间的低温就能够完成成花诱导，因而易成花，一般在2月左右开花。而难成花荔枝品种(如“马贵荔”、“桂味”、“糯米糍”、“紫良喜”等)都是纯合“dft”型荔枝，它们必须经过整个冬天的低温才能够完成成花诱导，需低温量多，因而难成花，一般在4月左右开花。申请者基于以上研究结果发明一种高效的易成花荔枝新种质育种方法。本方法通过荔枝人工杂交育种手段来实施，主要涉及到亲本的选着，即父母本必须有一方为纯合“eft”型荔枝，本发明还基于lcft1基因启动子的差异开发一种鉴定纯合“eft”型荔枝的分子标记。

技术实现要素：

本发明首次根据荔枝lcft1基因启动子存在两个类型，即“eft”型启动子和“dft”型启动子，且含“eft”型启动子的荔枝容易成花，发明一种高效的易成花荔枝新种质育种方法。本方法具有育种效率高、选育目标性状明确等优点，有助于建立易成花荔枝新种质的育种体系，应用于荔枝的杂交育种实践中，具有广泛的应用前景。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种高效的易成花荔枝新种质育种方法的发明原理在于：低温能够诱导荔枝叶片中开花基因lcft1的表达进而导致其成花，荔枝lcft1基因启动子存在两个类型(即“eft”型和“dft”型)，进而导致3种lcft1基因型荔枝，分别为纯合“eft”型荔枝、纯合“dft”型荔枝以及两者的杂合型荔枝，进一步研究发现含“eft”型启动子的荔枝容易成花。申请者基于以上研究结果发明一种高效的易成花荔枝新种质育种方法，本方法通过荔枝人工杂交育种手段来实施，主要涉及到亲本的选着，即父母本必须至少有一方为纯合“eft”型荔枝，以确定杂交后代中百分之百的含有lcft1基因“eft”型启动子。

一种高效的易成花荔枝新种质育种方法，具体步骤如下：

(1)一种高效的易成花荔枝新种质育种方法通过人工杂交育种手段来实施。

(2)本方法在通过人工杂交育种手段实施中，父母本必须至少有一方为纯合“eft”型荔枝。

(3)本方法提供纯合“eft”型荔枝的鉴定方法。根据lcft1基因“eft”型启动子的特异性设计一对上下游引物eft-f：5’-atgattaaggtttcaaatatatctatacat-3’和eft-r：5’-ggtgctacttttattttctgaatttaa-3’，pcr扩增的目的条带大小为262bp，用于检测lcft1基因“eft”型启动子。根据lcft1基因“dft”型启动子的特异性设计一对上下游引物dft-f：5’-tgatcaaagaacatataatatttgggcg-3’和dft-r：5’-taaataaaaatactcattatatatgagc-3’，pcr扩增的目的条带大小为202bp，用于检测lcft1基因“dft”型启动子。具体鉴定方法为：以待检测的荔枝dna样品为模板进行pcr扩增，如果引物eft-f和eft-r扩增到262bp大小的目的条带，引物dft-f和dft-r扩增不到202bp大小的目的条带，则表明待检测荔枝样品为纯合“eft”型荔枝，可作为荔枝杂交实验中亲本一方。

(4)本发明还提供一种检测纯合“eft”型荔枝的pcr试剂盒，所述的pcr检测试剂盒反应体系共25μl，具体组成如下：dna模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，2×taqpcrmastermix(tiangen)12.5μl，水9.5μl。

(5)人工采集父本花粉。确定杂交实验所需的父本荔枝品种后，在父本雄花盛花期采集发育成熟而未开裂的花药，然后用硅胶干燥剂干燥12个小时左右使花药开裂，再用筛子过筛收集花药于保存管中，短时间保存(一个星期左右)可存放于4℃冰箱，长时间保存需液氮中超低温保存。

(6)母本花穗人工套袋隔离花粉。确定杂交实验所需的母本荔枝品种后，在母本雌花盛开期去除花穗上少量的雄花和已经开放的雌花，然后套袋隔离外界花粉。

(7)人工授粉。等到母本雌花开放之后，摘下花粉隔离袋取出事先准备好的父本花粉，用细毛笔沾取花粉涂抹雌花进行人工授粉，授粉结束后再套上花粉隔离袋一个星期左右，在摘袋之后同时减去未经授粉的雌花和未开放的花蕾，只保留授过粉的雌花。

(8)在授粉工作结束之后一定加强授粉母本树的水肥和病虫害管理，等到杂交果实成熟后收集杂交种子，进行催芽定值。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的高效的易成花荔枝新种质育种方法具有效率高、选育目标性状明确以及可在幼苗阶段早期鉴定易成花性状等优点，对于木本果树的荔枝来说，在杂交育种上具有重要的意义，可显著缩短育种周期，大大节省人力、物力及土地，有助于建立易成花荔枝的分子标记辅助育种体系，便于快速、高通量的应用于荔枝杂交育种实践中，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为荔枝lcft1基因“eft”型和“dft”型启动子序列比对图；

其中，‘e’为荔枝lcft1基因“eft”型启动子序列；‘d’为荔枝lcft1基因“dft”型启动子序列；横线标注部分为所述分子标记lced1上下游引物lced1-f和lced1-r所在位置；方框为lcft1基因开放阅读框(orf)起始密码子atg。

图2为纯合“eft”型荔枝种质资源的分子鉴定；

其中，m：dl2000marker；1-88为收集的88份不同荔枝种质资源，如“三月红”、“褐毛荔”、“妃子笑”、“兰竹”、“桂早荔”、“马贵荔”、“桂味”、“糯米糍”、“紫良喜”等。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：

1.一种高效的易成花荔枝新种质育种方法的发明原理

低温能够诱导荔枝叶片中开花关键基因lcft1的表达进而导致其成花，荔枝lcft1基因启动子存在两个类型(即“eft”型和“dft”型)，进而导致3种lcft1基因型荔枝，分别为纯合“eft”型荔枝、纯合“dft”型荔枝以及两者的杂合型荔枝，进一步研究发现含“eft”型启动子的荔枝容易成花。

基于以上研究结果发明一种高效的易成花荔枝新种质育种方法，本方法通过荔枝人工杂交育种手段来实施，主要涉及到亲本的选着，即父母本必须至少有一方为纯合“eft”型荔枝，以确定杂交后代中百分之百的含有lcft1基因“eft”型启动子。

2.纯合“eft”型荔枝种质资源的鉴定，具体步骤如下：

(1)收集88份不同荔枝种质资源(如：“三月红”、“褐毛荔”、“妃子笑”、“兰竹”、“桂早荔”、“马贵荔”、“桂味”、“糯米糍”、“紫良喜”等)，并提取它们的dna，具体步骤如下：

(a)将叶片材料洗净放入液氮冷冻的研钵中，加少许不溶性的pvp，加液氮研磨成粉末；

(b)取0.5g粉末转移至10ml离心管中并加入3ml65℃水浴的ctab提取液，剧烈震荡，65℃水浴30-60min，每隔10min轻轻震荡一次；

(c)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(v/v/v：25：24：1)轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min；

(d)取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇(v/v：24：1)轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min；

(e)取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇(v/v：24：1)，轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min，取上清，加入2/3v预冷的异丙醇轻柔颠倒混匀，-20℃沉淀dna30min；

(f)12000rpm离心20min，弃上清，加70％乙醇洗涤沉淀2次；

(g)加100-300μlte缓冲液，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，紫外分光光度计检测其浓度与纯度，最终将dna稀释到50ng/μl，放入-20℃冰箱备用。

(2)如图1所示，根据lcft1基因“eft”型启动子的特异性设计一对上下游引物eft-f：5’-atgattaaggtttcaaatatatctatacat-3’和eft-r：5’-ggtgctacttttattttctgaatttaa-3’，pcr扩增的目的条带大小为262bp，用于检测lcft1基因“eft”型启动子。

根据lcft1基因“dft”型启动子的特异性设计一对上下游引物dft-f：5’-tgatcaaagaacatataatatttgggcg-3’和dft-r：5’-taaataaaaatactcattatatatgagc-3’，pcr扩增的目的条带大小为202bp，用于检测lcft1基因“dft”型启动子。

(3)pcr扩增检测

分别以待检测88份荔枝种质资源的dna为模板进行pcr扩增，其标准pcr反应体系为25μl，具体组成如下：dna模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，2×taqpcrmastermix(tiangen)12.5μl，ddh2o9.5μl。pcr具体扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35循环，72℃延伸10min，10℃停止。扩增的pcr产物经1.5％浓度的琼脂糖电泳检测。

如图2-a所示，引物eft-f和eft-r检测到36份荔枝种质资源(编号1-10和63-88)含有lcft1基因“eft”型启动子。

如图2-b所示，引物dft-f和dft-r检测到78份荔枝种质资源(编号11-88)含有lcft1基因“dft”型启动子。

上述检测结果表明，编号1-10为纯合“eft”型荔枝种质资源(如“三月红”、“褐毛荔”等)，编号11-62为纯合“dft”型荔枝种质资源(如“桂味”、“糯米糍”、“紫良喜”等)，编号63-88为两者杂合型荔枝种质资源(如“桂早荔”、“岭丰糯”、“皇帝舅”等)。

3.荔枝杂交父母亲本的选择

通过上述分子鉴定结果表明：“三月红”为纯合“eft”型荔枝品种(该品种成花诱导所需低温量少，极易成花，特早熟，缺点是果实品质差)；“桂味”为纯合“dft”型荔枝品种(该品种果实品质优良，深受广大消费者的亲睐，商品价值极高，但一个主要缺点是成花诱导所需低温量多，成花难，产量受冬天低温不足影响很大)。因此，本杂交实验中选择“三月红”作为母本，“桂味”作为父本，以期获得优质的易成花荔枝杂交新种质资源。

4.人工采集父本“桂味”荔枝花粉。

在父本“桂味”雄花盛花期采集发育成熟而未开裂的花药，然后用硅胶干燥剂干燥12个小时左右使花药开裂，再用筛子过筛收集花药于保存管中，短时间保存(一个星期左右)可存放于4℃冰箱，长时间保存需液氮中超低温保存。

5.母本“三月红”荔枝花穗人工套袋隔离花粉。

在母本“三月红”荔枝雌花盛开期去除花穗上少量的雄花和已经开放的雌花，然后套上花粉隔离袋。

6.人工授粉。

等到母本“三月红”荔枝雌花开放之后，摘下花粉隔离袋取出事先准备好的父本“桂味”花粉，用细毛笔沾取花粉涂抹雌花柱头进行人工授粉，授粉结束后再套上花粉隔离袋一个星期左右，在摘袋之后同时剪去未经授粉的雌花和未开放的花蕾，只保留授过粉的雌花。

7.在授粉工作结束之后一定加强授粉母本树的水肥和病虫害管理，等到杂交果实成熟后收集杂交种子，进行催芽定值。

序列表

<110>广西壮族自治区农业科学院园艺研究所

<120>一种高效的易成花荔枝新种质育种方法

<130>zyws

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(一种高效的易成花荔枝新种质育种方法)

<400>1

atgattaaggtttcaaatatatctatacat30

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(一种高效的易成花荔枝新种质育种方法)

<400>2

ggtgctacttttattttctgaatttaa27

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(一种高效的易成花荔枝新种质育种方法)

<400>3

tgatcaaagaacatataatatttgggcg28

<210>4

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(一种高效的易成花荔枝新种质育种方法)

<400>4

taaataaaaatactcattatatatgagc28