本发明涉及褪黑素的应用技术领域，具体涉及将褪黑素制成水剂，应用于减缓高温胁迫所导致的植物花粉败育，花粉败育表现在花粉生活力下降，花粉萌发率降低等方面。
背景技术：
众所周知，蔬菜等农作物在生长发育的过程中经常受到各种环境条件的制约和影响，高温、冷害、干旱等各种不良天气的出现，造成了农业生产极为严重的经济损失。特别地，随着大气臭氧层遭到破坏，全球气候变暖，高温等极端天气出现频繁，植物生长受到环境改变的影响。有数据表明，在过去100年里，全球平均温度上升了0.8℃。2017年7月份，我国多地出现持续高温天气，其中，全国共有58个气象观测站平或破当地7月最高气温记录。夏季高温天气严重影响植物正常生长发育。特别地，高温会引起植物蒸腾速率加快，植物体内水分流失加快，植物体内活性氧增多，严重时造成植物细胞器等的损伤，尤其植物花粉对温度的感知十分敏感，高温会导致植物花粉活力降低，花粉萌发率下降及花粉小孢子母细胞减数分裂过程出现异常等现象。受高温胁迫的植株，常出现果实结籽率低，果实变小，畸形等症状，进而导致作物减产甚至绝收，严重制约了蔬菜作物的产量及品质，并带来了巨大的经济损失。
在具体的农业实践和作物栽培过程中，人们积极应对自然环境变化。现阶段主要从两个方面着手，一方面，通过改善栽培环境为植物创造较适宜的外界环境条件，常采用物理降温法，比如，塑料大棚装有内、外遮阳网，日光温室内装有风机湿帘等降温设备，与此同时，科学合理且适宜农作物的农事操作也相当重要，而另一方面，随着科学技术的进步和发展，育种学家利用现代分子生物学、育种学、遗传学等专业知识来研究、培养及选育耐高温新品种。这些方法都在一定程度上缓解了高温天气对植物花粉的影响，减少了花粉败育率，进而达到减少经济损失的目的。
褪黑素(melatonin，mt)，又名美拉酮宁、抑黑素、松果腺素，分子式为c13n2h16o2，分子质量为232.27g/mol，熔点116℃～118℃，化学名称为n-乙酰基-5-甲氧基色胺(n-acetyl-5-methoxytryptamine)(结构如图1所示)，不溶于水，溶于丙酮、乙醇、乙醚等有机溶剂，对光线敏感，受热易破坏，主要是由哺乳动物和人类的松果体产生的一种胺类激素，目前发现褪黑素同样广泛存在于各类高等植物中，但含量极少。褪黑素是一种多效信号分子，近年来，对其研究很多，它在调节植物生长和发育中起着关键作用，并为各种环境胁迫提供生理保护。但目前褪黑素介导的花粉耐热性的机制在很大程度上仍是未知的。
技术实现要素：
本发明提供一种褪黑素在提高植物花粉生活力方面的应用，以褪黑素为有效成分的制剂以及通过使用该制剂来缓解高温引起的花粉败育现象，来有效提高植物对高温胁迫的修复能力、安全无污染。
一种褪黑素在减缓高温诱导番茄花粉败育中的应用。
在本发明研究中，利用褪黑素制剂(200μm)灌溉处理，有效地改善了高温诱导的花粉失活和抑制花粉萌发。褪黑素通过上调多种抗氧化酶的转录和活性，缓解番茄花药在高温下的活性氧产生。透射电镜结果表明高温诱导的花粉败育与绒毡层细胞的过早退化以及在早期的单核小孢子阶段花粉粒核退化的形成有关。同时，褪黑素一方面通过提高热激蛋白基因的表达来折叠蛋白，另一方面通过提高表达自噬相关基因和自噬体的形成来降解变性蛋白，从而缓解细胞器的降解。这些发现揭示了褪黑素在高温下保护花粉活性的新功能，并支持褪黑素对植物繁殖发育的潜在作用。除此之外，褪黑素可以保护植物抵抗化学物质和重金属离子的伤害，而且其本身为内源代谢物，能够被生物降解，对人体无毒性安全无残留，非常适合大田及设施农业的生产。
优选地，包括如下步骤：
(1)将褪黑素与附加剂混合后制成褪黑素水剂；
(3)将所述褪黑素水剂喷施于高温胁迫的植物叶面或投加于植物生长的营养液或土壤中。
所述附加剂为常规附加剂，例如，乙醇和水。
优选地，当采用喷施方式时，先配置褪黑素水剂母液，将褪黑素水剂母液稀释成150～250μm并混入表面活性剂后喷施在植物叶面；进一步优选地，稀释成180～220μm；最优选地，稀释成200μm。每次喷施量以所有叶片湿润为准。优选喷施2～4次。
为使该制剂在水溶液中均匀分布，并均匀喷洒于番茄叶面上，需在该制剂中加入表面活性剂。所述的各种常用的表面活性剂可使制剂在植物表面的湿润、分散、展着和渗透性能显著增强，有效减少制剂喷洒后随风漂移，提高制剂的抗雨水冲刷能力和药效、减少制剂的用量、延长制剂的有效期。本发明中的表面活性剂可采用农用有机硅、吐温60、厨房用清洁剂、脂肪酸甘油酯或silwet-l77中的一种，优选为农用有机硅，其不仅表面活性效果较好，延展性、降低制剂表面张力上效果更为显著，使制剂更易被植株吸收，而且价格更为低廉，实际使用时被认为是最优选的表面活性剂，加入量为万分之二。
优选地，当采用投加到植物生长的营养液中时，褪黑素水剂的投加量以褪黑素在营养液中的终浓度为150～250μm计；进一步优选地，终浓度为180～220μm计；最优选地，终浓度为200μm。
乙醇作为有机溶剂，其作用在于溶解褪黑素，使褪黑素更易与其他组分混合，优选地，褪黑素水剂母液的浓度为150～250mm。使用时用水稀释。
当水培番茄长出第一穗花时，向营养液中加入褪黑素水剂，2～4天后，对植株进行2～4小时40～42℃高温处理，褪黑素制剂加入营养液中，褪黑素终浓度为180～220μm。
更进一步优选地，当水培番茄长出第一穗花时，向营养液中加入褪黑素水剂，3天后，对植株进行3小时42℃高温处理。
更进一步优选地，褪黑素制剂加入营养液中，褪黑素终浓度为200μm。
在本发明研究中，利用褪黑素制剂(优选200μm)灌溉处理，有效地改善了高温诱导的花粉失活和抑制花粉萌发。褪黑素通过上调多种抗氧化酶的转录和活性，缓解番茄花药在高温下的活性氧产生。透射电子显微镜结果显示，高温诱导的花粉败育与绒毡层细胞过早退化和早期单核小孢子阶段形成有退化细胞核的缺陷花粉粒有关，而褪黑素则通过增强细胞器的表达来保护细胞器的退化热休克蛋白基因重折叠未折叠的蛋白质和自噬相关基因的表达和自噬体的形成以降解变性的蛋白质。这些发现提示了褪黑素在高温下保护花粉活性的新功能，并支持褪黑素对植物繁殖发育的潜在作用。除此之外，褪黑素可以保护植物抵抗化学物质和重金属离子的伤害，而且其本身为内源代谢物，能够被生物降解，对人体无毒性安全无残留，非常适合大田及设施农业的生产。
本发明的优点在于：
(1)本发明对于已知化合物褪黑素发掘了新的缓解高温胁迫引起植物花粉败育的用途，开拓了一个新的应用领域。
(2)褪黑素作为植物友好型物质，可在环境和生物体内降解，且该制剂制备工艺简单，使用方便，成本较低，不会产生产品和环境污染，不易产生药害，具有广阔的应用前景。
(3)本发明以褪黑素为主要有效成分制备的制剂，通过将褪黑素与常规的附加剂混合后制成水剂得到，以适当浓度通过叶面喷施或者直接投加应用于营养液中或土壤中，可安全有效减缓高温诱导的植物花粉败育，进而减少结籽率降低带来的产量降低和经济损失。
总之，本发明研究结果表明，褪黑素作为信号分子在高温下对花粉生活力具有多重保护功能。首先，褪黑素缓解高温诱导的花粉活力下降和萌发率降低；其次，褪黑素通过提高抗氧化酶活性，从而降低花药中的ros积累；第三，褪黑素对于绒毡层中细胞器的稳定性也很重要。本发明提供了褪黑素调控生殖发育和植物抗性机制的新见解。
附图说明
图1为褪黑素分子结构。
图2为实施例1中进行褪黑素和高温处理后，浇施本发明制剂与乙醇对照间的番茄花粉活力和萌发情况的比较图。
a：通过fda染色检测花粉活力和通过苯胺蓝染色体外测定花粉萌发，利用荧光显微镜得到图片，其标尺＝200μm。b：统计a中不同处理下花粉活力情况。每种处理至少有500个花粉用于定量。c：统计a中不同处理下花粉的萌发率。每种处理至少有500个花粉用于定量。mel表示褪黑激素预处理。图2中b和c显示的数据是四次重复的平均值，标准误差由竖线显示。采用tukey检验，不同小写字母表示不同处理间差异达5％显著水平。
图3为实施例1中进行褪黑素和高温处理后，浇施本发明制剂与乙醇对照间的番茄花药活性氧清除能力的比较图。
a：通过nbt染色和dcf染色分别测定不同处理番茄花药中超氧阴离子(o2·-)和过氧化氢(h2o2)的含量，其中图上标尺分别为1.5mm和60μm。b：统计a中不同处理下番茄花药中h2o2的含量，根据a中dcf染色的相对荧光强度进行统计；mel表示褪黑激素预处理；图3中b显示的数据是四次重复的平均值，标准误差由竖线显示；采用tukey检验，不同小写字母表示不同处理间差异达5％显著水平。表明褪黑素能提高番茄花药高温胁迫下的活性氧清除能力。
图4为实施例1中进行褪黑素和高温处理后，浇施本发明制剂与乙醇对照间的番茄花药抗氧化基因的表达情况。
mel表示褪黑激素预处理；图中显示的数据是四次重复的平均值，标准误差由竖线显示；采用tukey检验，不同小写字母表示不同处理间差异达5％显著水平。
图5为实施例1中进行褪黑素和高温处理后，浇施本发明制剂与乙醇对照间的番茄花药抗氧化酶cat，apx，g-pod和sod等的活性变化情况。
mel表示褪黑激素预处理；图中显示的数据是四次重复的平均值，标准误差由竖线显示；采用tukey检验，不同小写字母表示不同处理间差异达5％显著水平。
图6为实施例1中进行褪黑素和高温处理后，浇施本发明制剂与乙醇对照间的番茄花药绒毡层细胞(a)和花粉粒(b)在番茄早期单核小孢子期的超微结构。标尺＝2μm。
图7为实施例1中进行褪黑素和高温处理后，浇施本发明制剂与乙醇对照间的番茄花药hsp和atg基因的表达情况。
mel表示褪黑激素预处理；图中显示的数据是四次重复的平均值，标准误差由竖线显示；采用tukey检验，不同小写字母表示不同处理间差异达5％显著水平。
图8为实施例1中进行褪黑素和高温处理后，浇施本发明制剂与乙醇对照间的番茄花药自噬体积累的情况。
a：通过mdc染色检测番茄花药中的自噬体，利用lsm780共聚焦显微镜观察并得到图片，其中自噬体为图中小点，标尺＝25μm；b：根据a中对照植物，归一化得各处理相对自噬活性。将对照植物的自噬活性设定为1，统计各处理花药中自噬体数量；每种处理至少有30个来自不同花药的薄切片用于定量；mel表示褪黑激素预处理；图中显示的数据是四次重复的平均值，标准误差由竖线显示；采用tukey检验，不同小写字母表示不同处理间差异达5％显著水平。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，本发明的保护范围不受实施例的限制，本发明的保护范围由权利要求书决定。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
实施例1
(1)植物材料
番茄(solanumlycopersicuml.cv.micro-tom)种子65℃温水浸种催芽后，播种于装有蛭石和珍珠岩(7:1＝v:v)混合基质的育苗穴盘内，子叶出土后按照基质水分情况浇水使其保持湿润。当番茄幼苗第四片真叶完全展开时，进行洗根操作，并将其转移到装满hoagland营养液的1l黑色不透明塑料盆(40cm×25cm×15cm)中进行水培。每个塑料盆中放置4棵番茄苗，用海绵进行固定。为保证植株健康正常生长，每3d更换一次营养液，并在每个塑料盆中装有加氧球以补充足够o2。植物生长条件如下：光周期为14/10h(昼/夜)，温度为25/23℃(昼/夜)，平均相对湿度为80％，光合光量子通量密度(ppfd)为600μmol·m-2·s-1。
(2)褪黑素制剂制备
褪黑素制剂组成如下：98％褪黑素(阿拉丁，上海晶纯生化科技股份有限公司)、乙醇、水及表面活性剂。
乙醇作为有机溶剂，其作用在于溶解褪黑素，使褪黑素更易与其他组分混合。此外，经实验发现，有机溶剂用量过少时，无法实现褪黑素的充分溶解，在本发明制剂中褪黑素的用量下，所述有机溶剂用量需达到10～20ml。
该褪黑素制剂按照如下步骤制备而得：称取褪黑素929.1mg，量取乙醇溶液20ml，将褪黑素完全溶解于乙醇溶液中，即得到200mm的褪黑素母液；施用时采用将褪黑素母液加水稀释为工作液的方法，即1ml母液加入1l水，得到200μm的褪黑素工作液，并加入占总体积万分之二的农用有机硅，充分搅拌，使溶液混合均匀，保证无褪黑素析出，最终得到200μm的褪黑素制剂。所有操作尽量避光进行，配置好的制剂需4℃避光保存。
(3)胁迫处理
为了分析褪黑素诱导的花粉热耐受性，实验设置4个处理(对盛花期番茄根部进行褪黑素(200μm)处理3天，然后在42℃高温下处理3小时)，分别为rt-control、rt-mel、ht-control、ht-mel。分别收集各处理雄蕊或花粉样品，检测其生理生化指标和分子指标。每个处理设置四个重复，每个重复由12株植物组成。
(4)花粉活力及花粉体外萌发检测
用fda(fluoresceindiacetate)染色法检测番茄花粉活力。将fda(aladdin，f109384)溶解于丙酮中，配成2mg·ml-1的母液，4℃避光保存。使用时，用0.5m蔗糖溶液稀释成0.01％的工作液。取上午9时刚刚开放的花朵，在载玻片上滴一滴fda工作液，用镊子抖动花药，使花粉散落在染色液中，置于湿盒内28℃避光染色1h，盖上盖玻片于荧光显微镜下观察(leica，germany)并拍照。
按照表1配制花粉体外萌发培养基，用naoh调ph至6.5，加入终浓度为0.1％的琼脂粉，微波炉煮沸，冷却至室温待用。在载玻片上滴一滴花粉萌发培养基，取上午刚开放的花朵，用镊子抖动花药，使花粉散落在培养基中，置于湿盒内28℃避光培养1h，加20μl0.1％苯胺蓝溶液(sigma-aldrich，b8563)，染色3min，盖上盖玻片，用荧光显微镜(leica，germany)观察并拍照，并统计花粉萌发百分率。
表1花粉体外萌发培养基配方
(5)活性氧(ros)的组织化学染色
花药中o2·-含量采用nbt染色法进行检测。花药浸泡在0.1mg·ml-1硝基蓝四唑(nbt)溶液(nbt用ph7.8，25mmk-hepes缓冲液溶解)中，在黑暗中25℃孵育1小时后，用95％(v/v)乙醇漂洗，然后把浸泡在乙醇中的花药在95℃煮沸15～20分钟，最后对花药进行拍照。
花药中h2o2含量采用dcf-da染色法进行检测。按花蕾大小对番茄雄蕊进行分级取样，用刀片将雄蕊切成薄片，放置于六孔板中，先在50mm的磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)中浸泡10-20min，消除因机械损伤产生的ros，吸出pbs缓冲液，加入25μmdcf-da荧光染料(sigma-aldrich，35848)，避光染色15min，最后用pbs缓冲液漂洗三遍，将雄蕊样品置于载玻片上，盖上盖玻片，用荧光显微镜(leica，germany)观察并拍照。
(6)抗氧化酶提取和活性测定
对于酶提取，称取0.1g完全展开的新鲜花样，加入2ml加钢珠的磨样管中，利用冷冻磨样仪(tissuelyserⅱ，retsch公司，德国)磨样，之后立即加入800μl冰冷的含有0.2mmedta，2％(w/v)pvp的50mmpbs(ph7.8)，并涡旋混匀。将匀浆物在4℃以12,000g离心20分钟，收集上清液，即为酶液。用bradford的方法测定酶液中的蛋白含量，并测量超氧化物歧化酶(sod)，过氧化氢酶(cat)，抗坏血酸过氧化物酶(apx)和愈创木酚过氧化物酶(g-pod)酶的活性。具体而言，通过测定其抑制nbt的光化学还原的能力来测定sod活性。cat活性是通过在240nm下消耗h2o2来测定的。反应混合物含有25mmpbs(ph7.0)，10mmh2o2和酶提取物。apx活性是通过290nm处吸光度的降低来测量的。反应混合物含有25mmpbs(ph7.0)，0.25mm抗坏血酸(asa)，1mmh2o2和酶提取物。使用愈创木酚作为底物评估g-pod活性，并且在470nm下进行一些修改测定。反应混合物含有25mmpbs(ph7.0)，0.05％愈创木酚，1mmh2o2和酶提取物。
(7)总rna提取和基因表达分析
利用总rna提取试剂盒(dp419，tiangen，中国上海)从番茄完全展开的新鲜花朵中分离提取总rna，具体操作根据说明书进行。1μg总rna用反转录试剂
(8)透射电子显微镜(tem)
为了观察绒毡层及花粉的亚细胞结构，首先将处于小孢子时期的不同处理的花药用2.5％的戊二醛4℃固定过夜；用0.1m，ph7.0的磷酸缓冲液洗涤三次，每次15min；用1％的锇酸固定1-2h；用0.1m，ph7.0的磷酸缓冲液洗涤三次，每次15min；用30％、50％、70％、80％、90％和95％的乙醇进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理20min，最后过度到纯丙酮处理20min；用包埋剂与丙酮混合液(v/v＝1/1)处理1h；用包埋剂与丙酮混合液(v/v＝3/1)处理3h；纯包埋剂处理过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品，样品在leicaemuc7(germany)型超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染色5-10min，并用型号hitachih-7650(japan)透射电镜在75kv的加速电压下观察绒毡层细胞的稳定性。
(9)褪黑素制剂对高温胁迫引起的花粉败育的缓解效果
花粉活力检测如图2所示，进行褪黑素和高温处理后浇施本发明制剂与乙醇对照间的番茄花粉活力和萌发情况的比较，结果显示褪黑素制剂有效缓解3h高温胁迫下花粉活力和萌发率的下降。由图2中a和b所示，常温(25℃)下，花粉活力由fda染色，13.4％的花粉丧失生活力，褪黑素预处理后，花粉活力略有增加。但在3h的高温处理后，与对照花粉粒相比，大部分花粉粒活性丧失，仅有24.8％的花粉粒具有活性。重要的是，褪黑素预处理的番茄植株花粉活力比未经处理的植物增加了123.3％，大大缓解了高温诱导的花粉败育。同样，由图2中a和c所示，经过褪黑素预处理的高温下花粉的平均萌发率也显着高于对照。特别地，在42℃高温处理后，对照组仅有38.7％的花粉萌发，而体外褪黑素预处理有50.5％的花粉萌发。
花粉粒生活力是控制作物产量的决定性因素之一。然而，花粉比小花内的胚珠对高温更敏感。在这项研究中，本发明发现在高温下，体外褪黑素预处理植物的花粉活力和萌发增加(图2)。有研究报道，褪黑素在田间条件下提高了大豆植物的种子数量和产量。这表明，本研究中，所配制的褪黑素制剂可能通过调控花粉发育和维持植物生殖生长期的小孢子活性，以提高花粉的活力和萌发率，达到缓解高温下花粉败育的效果，进一步缓解由高温引起的果实减产等不良效应。
(10)褪黑素制剂能有效缓解高温胁迫引起的花粉败育的作用机理
①褪黑素提高高温下ros清除和抗氧化酶活性
本发明通过nbt染色，发现在高温处理(42℃)3h后花药中高温诱导ros积累(图3中a)，与此同时，dcf染色也证实，番茄花药经热胁迫处理后，比在正常条件下积累更多的h2o2(图3)。此外，褪黑素能有效缓解花药中h2o2在高温下的积累。褪黑素预处理植物中的h2o2含量比未处理植物在高温下降低了35.3％(图3中b)。对h2o2组织定位分析进一步表明，h2o2的积累主要发生在高温番茄花药的绒毡层细胞中，而褪黑素预处理植物中绒毡层细胞的热诱导h2o2积累减少(图3)。
褪黑素可以直接解毒ros，间接促进抗氧化酶清除植物遭受胁迫时所积累的ros。为探究褪黑素在调控植物抗氧化系统中的作用，应用qrt-pcr技术对cat1，apx1，dahr和fe-sod等抗氧化酶等基因进行表达分析。与常温未施加褪黑素组相比，褪黑素预处理后，高温胁迫下四种抗氧化酶相关基因的转录水平均有所上升，从55.1％到172.7％(图5)。与此同时，除了高温诱导四种抗氧化酶基因表达上升，褪黑激素预处理还进一步提高了这些抗氧化酶的表达量(图4)。与基因转录水平相一致，在高温及褪黑素预处理条件下，花药中过氧化氢酶(cat)，抗坏血酸过氧化物酶(apx)，愈创木酚过氧化物酶(g-pod)和超氧化物歧化酶(sod)活性分别提高了146.0％，58.8％，83.5％和74.5％(图5)。这些发现清楚地表明了提前浇施褪黑素制剂能有效缓解高温胁迫下ros在番茄花药中的积累。
②褪黑素通过诱导hsp和atg基因的表达和高温形成自噬体来保护花粉绒毡层细胞的稳定性
高温环境常造成植物雄配子不能正常生长和功能缺失，从而对植物整个的生殖生长产生巨大影响，进一步造成果实减产。花粉发育过程中，由最靠近花粉的绒毡层进行调控和提供营养，因此，可以通过观察高温条件绒毡层降解等情况，进一步观测花粉的生长发育状态。本实验中，透射电镜结果显示，对照中绒毡层细胞组织良好，细胞器的适当分布(图6)。然而，在早期的单核小孢子阶段，高温造成绒毡层细胞的显著降解、花粉畸形及核退化(图6)。重要的是，用褪黑素预处理显著恢复了高温诱导的绒毡层细胞变性和花粉畸形(图6)。绒毡层细胞可为对温度敏感的花粉提供养分，在高温胁迫下花粉的变性也有所缓和。因此，褪黑素能保护绒毡层细胞的稳定性，避免高温胁迫下的花粉畸形。
为了抵消和中和高温带来的不良影响，植物触发热休克蛋白(hsp)分子伴侣的表达，本发明发现高温下，预施褪黑素能明显提高绒毡层的稳定性，且诱导番茄花药中hsp21(3.23倍)和hsp70(2.6倍)基因的高表达(图7)。
自噬是真核生物中常见的细胞组分降解途径，其在植物生长和发育中起关键作用，自噬相关基因(atg)突变体由于花粉成熟缺陷和水稻花药有限而表现出不育表型，褪黑素诱导atg基因表达和热应激反应的自噬形成。为了进一步寻求褪黑素在绒毡层恢复中的缓解作用，本发明研究了几种atg基因(atg6，atg8c，atg12和atg18h)的表达，观察到这些atg基因的表达在正常条件下通过褪黑素预处理在花药中被诱导(图7)。重要的是，相比于未经处理的花药，褪黑素预处理的花药在高温胁迫3h后的表达增加了26.0％至64.7％(图7)。利用mdc检测花药自噬。在对照植物中，仅观察到少数mdc染色的自噬体(图8a)。相反，在高温胁迫3h后花药中检测到许多mdc染色的自噬体。用褪黑素预处理进一步刺激自噬体形成，以降解花药中由热引起的错误折叠或降解的蛋白质(图8)。
综上所述，本发明研究结果表明褪黑素通过诱导hsp和atg基因恢复绒毡层细胞稳定性以及遭受高温胁迫时形成自噬保护。
实施例2
步骤同实施例1，将褪黑素制剂的施用方法改为体外喷施法，在高温处理前3天喷施一次，按照实施例步骤(4)进行花粉活力及萌发测定，结果显示能够达到实施例1的处理效果。喷施时间为傍晚，每株喷施量随植株大小而异，喷施至所有叶片湿润为止，约为15～50ml，共喷施3次。