本发明涉及抑制植物病原真菌的方法，具体是一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂的制备方法。
背景技术：
玉米小斑病是世界玉米产区普遍发生的重要病害之一。在我国，尤其以夏玉米产区受害最为严重。一般造成减产15%-20%，严重时可达50%以上甚至颗粒无收。尽管植物病害的防治方法多样，但化学防治依然是目前治理玉米小斑病的主要措施。然而，随着化学农药的长期、大量、单一使用导致病原菌逐渐产生抗药性，截至目前，仅就苯并咪唑类杀菌剂而言，全世界已有近60个属、100余种病原菌对其产生了明显抗药性。此外，抗药性菌株数量日益增多、抗性发展速度逐渐加快、高抗药性风险的化学农药日趋普遍。
纳米银是一种新的抗菌剂，其小尺寸效应及极高的比表面积极大促进了纳米颗粒与病原微生物接触。银纳米粒子的抗菌作用具有广谱性、高效性及持久性等特点。广谱性是指其对细菌、真菌以及病毒等都有良好的抑菌效果。高效性指的是银纳米颗粒能够在短时间内接触并渗透到病原微生物组织，进而达到杀菌或抑菌效果。持久性指的是银纳米颗粒能够持续释放Ag+并与带有负电荷的微生物细胞接触，然后形成牢固的吸附作用，最终造成病原物细胞活性丧失或遗传物质改变。银纳米颗粒的抗菌机制研主要分为以下三种：1、银纳米颗粒直接与菌类细胞膜作用，致使膜破坏或在细胞中形成复合物。2、银纳米颗粒与菌内硫醇作用并产生活性氧组分；3、银纳米颗粒与菌类接触后释放Ag+，Ag+能够抑制呼吸酶活性并产生活性氧。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂的制备方法，该方法制备的纳米银杀菌剂可以提高对玉米小斑病原菌抑制效果，减少化学农药用量，延缓抗药性产生，而且原料易得，制备方法简单、方便。
为达到上述技术效果，本发明提供了一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将白果去核、洗净、吹干；
（2）取10重量份的白果的果肉于烧杯中，加入100重量份去离子水混合均匀，然后置于95℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随玻璃棒持续搅拌形成混合物；
（3）将混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）用移液枪吸取滤液与去离子水，按体积比1:1-19的比例配成第一混合液；
（5）在第一混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为1-8mmol/L，得到第二混合液；
（6）在第二混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，使第二混合液的pH值在3-11之间，得到第三混合液；
（7）将第三混合液置于4-80℃的恒温环境中反应15min即可得到含有纳米银的第四混合液；
（8）用孔隙为0.22μm的微孔滤膜过滤第四混合液，并重复两次，得到滤液，设滤液体积为V；
（9）通过移液枪移取滤液至离心机中在12000rpm下离心20min，弃上清液然后加入无水乙醇至总体积为V，再次在12000rpm下离心20min，然后再去除上清液，最后在65℃的环境下干燥得到纳米银粉末；
（10）将得到的纳米银粉末配制成10mg/ml的纳米银母液，与10mg/ml杀菌剂母液混合得到一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂。
本发明中的白果为银杏科下的银杏果实，其提取液在纳米银合成过程中充当还原剂，将溶液中的银离子还原为银单质。溶液中的银离子充当反应的中的被还原物质。
步骤（7）得到的含有纳米银的第四混合液采用紫外可见分光光度计（UV-Vis）测其吸光度，得到的吸收光谱在426nm处出现强吸收峰，其对应于纳米银表面的等离子体共振，进一步确定了纳米银的形成。
用透射电子显微镜（TEM）对产品进行进一步分析，TEM结果显示合成的纳米银为球形或近球形，分散性良好，粒径为8-24nm，根据TEM图像，随机选取200个纳米银颗粒，利用Image J软件测定并分析出其平均粒径约为14nm。
本发明的优点：该方法制备的纳米银杀菌剂可以提高对玉米小斑病原菌抑制效果，减少化学农药用量，延缓抗药性产生，而且纳米银的合成过程无需使用大型仪器设备，无需添加毒性较大的助剂，原料液廉价易得，制备方法简单、方便。
作为优选的，所述的杀菌剂为戊唑醇、丙森锌、咯菌腈中的其中一种。
作为优选的，所述的纳米银母液与戊唑醇母液的体积混合比为1-9:1-9，所述的纳米银母液与丙森锌母液的体积混合比为6-9:1-4，所述的纳米银粉末与咯菌腈的体积混合比为7-9:1-3。
1、易操作性，从纳米银与杀菌剂复配的过程仅为简单的混合，无需使用大型仪器设备，也无需添加毒性较大的助剂，操作简便、用时少、能耗低。
2、增效性，实验证实纳米银按特定的比例范围与戊唑醇、丙森锌、咯菌腈复配所制成的复配杀菌剂，相比其各自单剂在对玉米小斑病菌均有较强的抑制作用中具有增效作用。
3、环境友好性，生物合成的纳米银对非靶标生物的安全性已得到广泛证实，将这种环境友好型纳米银与常规杀菌剂戊唑醇、丙森锌、咯菌腈复配，一方面在提高抑菌效果的同时能够减少农药用量，降低农药残留污染；另一方面能够最大限度地避免病原菌产生抗药性。
实验验证：
纳米银、杀菌剂单剂抑制作用：
取步骤（9）制得的纳米银粉末配制纳米银母液，利用菌丝生长速率法测定纳米银对玉米小斑病菌的抑制作用，纳米银母液的浓度梯度为：6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml，结果表明纳米银具有抑菌作用。SPSS 13.0分析纳米银对玉米小斑病菌的EC50为31.73μg/ml。
配制杀菌剂母液浓度为10mg/ml，利用菌丝生长速率法分别测定戊唑醇、丙森锌、咯菌腈这三种杀菌剂对玉米小斑病菌的抑制作用，结果表明戊唑醇、丙森锌、咯菌腈均具有抑制作用。SPSS 13.0分析戊唑醇、丙森锌、咯菌腈对玉米小斑病菌的EC50分别为0.52、3.63、0.77μg/ml。
纳米银复配杀菌剂抑制作用：
（1）基于纳米银与杀菌剂的EC50值，将纳米银母液与杀菌剂母液按分别照体积比1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的比例混合制成混合液，每种混合液取5ml分别加入到9个55℃的45ml PDA培养基中，构成9个实验组，再分别将5ml纳米银（10:0）、5ml杀菌剂（0:10）加入3个55℃的45ml PDA培养基中构成2个对照组；
（2）取恒温培养5天的玉米小斑病菌，无菌打孔器沿菌落边缘打取直径为5mm菌饼，在上述9个实验组和2个对照组共11个培养基的中央分别接种1个菌饼，菌丝面朝下，28℃恒温培养3-5天，用十字交叉法测量菌落直径；
（3）参照Horsfall法计算复配剂（纳米银为A，杀菌剂为B）毒性比率，即实际抑制率={[（对照菌落直径-菌饼直径）-（处理菌落直径-菌饼直径）]/（对照菌落直径-菌饼直径）]}×100%；理论抑制率=（A的EC50抑制率×A在复配剂中所占比例+B的EC50抑制率×B在复配剂中所占比例）×100%；毒性比率=实际抑制率/理论抑制率。若毒性比率＞1，为增效作用；毒性比率＝1，为相加作用；毒性比率＜1，为拮抗作用。
（4）实验结果见表1-表3：
表1 纳米银与戊唑醇复配对玉米小斑病菌的毒性比
由上表可得纳米银与戊唑醇的体积混合比在1-9:1-9之间表现为增效作用。
表2 纳米银与丙森锌复配对玉米小斑病菌的毒性比
由上表可得纳米银与丙森锌的体积混合比在6-9:1-4之间表现为增效作用。
表3 纳米银与咯菌腈复配对玉米小斑病菌的毒性比
由上表可得纳米银与咯菌腈的体积混合比为7-9:1-3之间表现为增效作用。
具体实施方式
实施例一：
一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将白果去核、洗净、吹干；
（2）取10g的白果的果肉于烧杯中，加入100ml去离子水混合均匀，然后置于95℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随玻璃棒持续搅拌形成混合物；
（3）将混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）用移液枪吸取滤液5ml与去离子水水定容至100ml，配成第一混合液；
（5）在第一混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为1mmol/L，得到第二混合液；
（6）在第二混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，使第二混合液的pH值为3，得到第三混合液；
（7）将第三混合液置于4℃的恒温箱中反应15min即可得到含有纳米银的第四混合液；
（8）用孔隙为0.22μm的微孔滤膜过滤第四混合液，并重复两次，得到滤液，设滤液体积为V；
（9）通过移液枪移取滤液至离心机中在12000rpm下离心20min，弃上清液然后加入无水乙醇至总体积为V，再次在12000rpm下离心20min，然后再去除上清液，最后在65℃的环境下干燥得到纳米银粉末；
（10）将得到的纳米银粉末配制成10mg/ml的纳米银母液，与10mg/ml戊唑醇母液按照1:9的体积比混合，得到一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂。
实施例二：
一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将白果去核、洗净、吹干；
（2）取10g的白果的果肉于烧杯中，加入100ml去离子水混合均匀，然后置于95℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随玻璃棒持续搅拌形成混合物；
（3）将混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）用移液枪吸取滤液20ml与去离子水水定容至100ml，配成第一混合液；
（5）在第一混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为5mmol/L，得到第二混合液；
（6）在第二混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，使第二混合液的pH值为5，得到第三混合液；
（7）将第三混合液置于40℃的恒温水浴中反应15min即可得到含有纳米银的第四混合液；
（8）用孔隙为0.22μm的微孔滤膜过滤第四混合液，并重复两次，得到滤液，设滤液体积为V；
（9）通过移液枪移取滤液至离心机中在12000rpm下离心20min，弃上清液然后加入无水乙醇至总体积为V，再次在12000rpm下离心20min，然后再去除上清液，最后在65℃的环境下干燥得到纳米银粉末；
（10）将得到的纳米银粉末配制成10mg/ml的纳米银母液，与10mg/ml戊唑醇母液按照5:5的体积比混合，得到一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂。
实施例三：
一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将白果去核、洗净、吹干；
（2）取10g的白果的果肉于烧杯中，加入100ml去离子水混合均匀，然后置于95℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随玻璃棒持续搅拌形成混合物；
（3）将混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）用移液枪吸取滤液50ml与去离子水水定容至100ml，配成第一混合液；
（5）在第一混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为8mmol/L，得到第二混合液；
（6）在第二混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，使第二混合液的pH值为11，得到第三混合液；
（7）将第三混合液置于80℃的恒温水浴中反应15min即可得到含有纳米银的第四混合液；
（8）用孔隙为0.22μm的微孔滤膜过滤第四混合液，并重复两次，得到滤液，设滤液体积为V；
（9）通过移液枪移取滤液至离心机中在12000rpm下离心20min，弃上清液然后加入无水乙醇至总体积为V，再次在12000rpm下离心20min，然后再去除上清液，最后在65℃的环境下干燥得到纳米银粉末；
（10）将得到的纳米银粉末配制成10mg/ml的纳米银母液，与10mg/ml戊唑醇母液按照9:1的体积比混合，得到一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂。
实施例四：
一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将白果去核、洗净、吹干；
（2）取10g的白果的果肉于烧杯中，加入100ml去离子水混合均匀，然后置于95℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随玻璃棒持续搅拌形成混合物；
（3）将混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）用移液枪吸取滤液5ml与去离子水水定容至100ml，配成第一混合液；
（5）在第一混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为1mmol/L，得到第二混合液；
（6）在第二混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，使第二混合液的pH值为3，得到第三混合液；
（7）将第三混合液置于4℃的恒温箱中反应15min即可得到含有纳米银的第四混合液；
（8）用孔隙为0.22μm的微孔滤膜过滤第四混合液，并重复两次，得到滤液，设滤液体积为V；
（9）通过移液枪移取滤液至离心机中在12000rpm下离心20min，弃上清液然后加入无水乙醇至总体积为V，再次在12000rpm下离心20min，然后再去除上清液，最后在65℃的环境下干燥得到纳米银粉末；
（10）将得到的纳米银粉末配制成10mg/ml的纳米银母液，与10mg/ml丙森锌母液按照6:4的体积比混合，得到一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂。
实施例五：
一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将白果去核、洗净、吹干；
（2）取10g的白果的果肉于烧杯中，加入100ml去离子水混合均匀，然后置于95℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随玻璃棒持续搅拌形成混合物；
（3）将混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）用移液枪吸取滤液20ml与去离子水水定容至100ml，配成第一混合液；
（5）在第一混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为5mmol/L，得到第二混合液；
（6）在第二混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，使第二混合液的pH值为5，得到第三混合液；
（7）将第三混合液置于40℃的恒温水浴中反应15min即可得到含有纳米银的第四混合液；
（8）用孔隙为0.22μm的微孔滤膜过滤第四混合液，并重复两次，得到滤液，设滤液体积为V；
（9）通过移液枪移取滤液至离心机中在12000rpm下离心20min，弃上清液然后加入无水乙醇至总体积为V，再次在12000rpm下离心20min，然后再去除上清液，最后在65℃的环境下干燥得到纳米银粉末；
（10）将得到的纳米银粉末配制成10mg/ml的纳米银母液，与10mg/ml丙森锌母液按照8:2的体积比混合，得到一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂。
实施例六：
一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将白果去核、洗净、吹干；
（2）取10g的白果的果肉于烧杯中，加入100ml去离子水混合均匀，然后置于95℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随玻璃棒持续搅拌形成混合物；
（3）将混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）用移液枪吸取滤液50ml与去离子水水定容至100ml，配成第一混合液；
（5）在第一混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为8mmol/L，得到第二混合液；
（6）在第二混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，使第二混合液的pH值为11，得到第三混合液；
（7）将第三混合液置于80℃的恒温水浴中反应15min即可得到含有纳米银的第四混合液；
（8）用孔隙为0.22μm的微孔滤膜过滤第四混合液，并重复两次，得到滤液，设滤液体积为V；
（9）通过移液枪移取滤液至离心机中在12000rpm下离心20min，弃上清液然后加入无水乙醇至总体积为V，再次在12000rpm下离心20min，然后再去除上清液，最后在65℃的环境下干燥得到纳米银粉末；
（10）将得到的纳米银粉末配制成10mg/ml的纳米银母液，与10mg/ml丙森锌母液按照9:1的体积比混合，得到一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂。
实施例七：
一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将白果去核、洗净、吹干；
（2）取10g的白果的果肉于烧杯中，加入100ml去离子水混合均匀，然后置于95℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随玻璃棒持续搅拌形成混合物；
（3）将混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）用移液枪吸取滤液5ml与去离子水水定容至100ml，配成第一混合液；
（5）在第一混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为1mmol/L，得到第二混合液；
（6）在第二混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，使第二混合液的pH值为3，得到第三混合液；
（7）将第三混合液置于4℃的恒温箱中反应15min即可得到含有纳米银的第四混合液；
（8）用孔隙为0.22μm的微孔滤膜过滤第四混合液，并重复两次，得到滤液，设滤液体积为V；
（9）通过移液枪移取滤液至离心机中在12000rpm下离心20min，弃上清液然后加入无水乙醇至总体积为V，再次在12000rpm下离心20min，然后再去除上清液，最后在65℃的环境下干燥得到纳米银粉末；
（10）将得到的纳米银粉末配制成10mg/ml的纳米银母液，与10mg/ml咯菌腈母液按照7:3的体积比混合，得到一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂。
实施例八：
一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将白果去核、洗净、吹干；
（2）取10g的白果的果肉于烧杯中，加入100ml去离子水混合均匀，然后置于95℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随玻璃棒持续搅拌形成混合物；
（3）将混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）用移液枪吸取滤液20ml与去离子水水定容至100ml，配成第一混合液；
（5）在第一混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为5mmol/L，得到第二混合液；
（6）在第二混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，使第二混合液的pH值为5，得到第三混合液；
（7）将第三混合液置于40℃的恒温水浴中反应15min即可得到含有纳米银的第四混合液；
（8）用孔隙为0.22μm的微孔滤膜过滤第四混合液，并重复两次，得到滤液，设滤液体积为V；
（9）通过移液枪移取滤液至离心机中在12000rpm下离心20min，弃上清液然后加入无水乙醇至总体积为V，再次在12000rpm下离心20min，然后再去除上清液，最后在65℃的环境下干燥得到纳米银粉末；
（10）将得到的纳米银粉末配制成10mg/ml的纳米银母液，与10mg/ml咯菌腈母液按照8:2的体积比混合，得到一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂。
实施例九：
一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将白果去核、洗净、吹干；
（2）取10g的白果的果肉于烧杯中，加入100ml去离子水混合均匀，然后置于95℃的水浴锅中加热30min，加热过程中伴随玻璃棒持续搅拌形成混合物；
（3）将混合物在垫有无菌滤纸的漏斗中趁热过滤，滤液降至室温后备用；
（4）用移液枪吸取滤液50ml与去离子水水定容至100ml，配成第一混合液；
（5）在第一混合液中再加入AgNO3粉末，使混合液中AgNO3浓度为8mmol/L，得到第二混合液；
（6）在第二混合液中加入HCl溶液和NaOH溶液，使第二混合液的pH值为11，得到第三混合液；
（7）将第三混合液置于80℃的恒温水浴中反应15min即可得到含有纳米银的第四混合液；
（8）用孔隙为0.22μm的微孔滤膜过滤第四混合液，并重复两次，得到滤液，设滤液体积为V；
（9）通过移液枪移取滤液至离心机中在12000rpm下离心20min，弃上清液然后加入无水乙醇至总体积为V，再次在12000rpm下离心20min，然后再去除上清液，最后在65℃的环境下干燥得到纳米银粉末；
（10）将得到的纳米银粉末配制成10mg/ml的纳米银母液，与10mg/ml咯菌腈母液按照9:1的体积比混合，得到一种抑制玉米小斑病菌的纳米银杀菌剂。