一种长期保存过表达VEGF的血管内皮祖细胞的保存液的制作方法

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种长期保存过表达VEGF的血管内皮祖细胞的保存液。
背景技术：
：由于创伤、感染、肿瘤等原因造成的各种类型骨缺损是临床上遇到的常见问题。据美国的最新统计，其每年涉及骨缺损修复的外科手术超过100万人次；而在我国，因交通、工伤和体育运动等导致的意外损伤以每年7.3％的速度递增。近年来，骨组织工程技术的逐渐兴起为骨缺损的修复提供了有效的解决策略，早期研究证明，用组织工程骨修复小段骨缺损时，其早期成骨及后期骨愈合效果明显。但在应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，导致修复失败，其主要原因就在于未能很好的解决组织工程骨的血管化问题，血管化问题现已成为制约组织工程骨应用于临床的瓶颈。对各种促血管生长因子的研究是目前组织工程骨血管化研究的热点之一。“血管发生”是新生血管形成的主要机制之一，其主要发生于胚胎期，通过内皮前体细胞分化成内皮细胞，在中胚层，内皮细胞分化、增殖、迁移、连接并形成原始毛细血管丛，此过程受血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)控制。VEGF是强有力的血管直接诱导因子，是一类具有肝素结合性的二聚糖蛋白，具有诱导血管内皮细胞增殖、促进血管生成、增加毛细血管渗透性等作用，使血管内成分渗漏，为血管内皮细胞迁移及血管形成提供基质，同时抑制血管内皮细胞凋亡，诱导血管平滑肌细胞迁移，促进血管平滑肌细胞合成和分泌基质金属蛋白酶，并加速基质降解及炎症趋化等，最终促使新生毛细血管形成。VEGF家族包括VEGFA、B、C、D和胎盘形成因子，其中VEGFA是研究较集中的因子，具有四种异构体，分别由121、165、189、206个氨基酸组成，其中VEGF-165活性最强，分布范围广，是体内发挥作用的主要形式。然而重组VEGF-165蛋白价格昂贵，在体内会很快被血液、组织液稀释，半衰期短，很难在局部达到持续的有效作用浓度，而且局部大量应用副作用严重，易导致局部血管瘤。血管内皮祖细胞(EndothelialProgenitorCells,EPC)最早由Asahara等于1997年报道，它是一群具有游走特性，尚未表达成熟血管内皮细胞表型，能分化为血管内皮细胞直接参与血管形成。它在骨髓、脐带血及外周血中均存在,并能在出生后的血管新生过程中有很强的促血管生成作用，并以血管发生方式形成新生血管。这一发现，更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复的理论，也为解决组织工程骨血管化问题提供了新的思路。近年来，有关EPCs在成体血管形成中的作用研究主要集中在缺血心肌、缺血肢体、损伤角膜、损伤皮肤的修复等方面，而其在骨组织工程中的研究在国内外则处于刚刚起步阶段。然而由于EPCs的细胞数量有限，获取困难，体外培养时需要扩增，培养周期长，且需要经FN介导贴壁生长才有利于其存活，这些不足限制了其在动物实验及临床研究中的应用。近年来，随着基因工程技术的发展，基因治疗已成为广大学者研究的热点，转基因的组织工程技术为血管化提供了新的思路和方法。VEGF基因修饰EPC可弥补其数量不足的缺点，VEGF基因转染可明显增强EPC的新生血管特性，能大大优化EPC的促血管新生效果。She等报道应用VEGF-165基因转染的EPC能明显促进缺血心肌中血管新生，从而明显改善大鼠急性心肌梗死后的心功能。易成刚等用人脐血中EPC，利用VEGF-165基因体外转染后移植于裸鼠随意皮瓣，可促进缺血皮瓣的血管新生，提高皮瓣的存活率，而转染VEGF-165基因的EPC具有更强大的促血管新生的作用。为了更好地进一步对过表达VEGF的EPC进行研究和应用，其中一个需要解决的问题就是过表达VEGF的EPC的保存问题。常见的动物细胞冷冻保存液是由20％血清培养基和10％二甲亚砜(DMSO)组成的，冷冻保存液可以在降温时减少细胞内冰晶分子的形成，以免对细胞造成伤害，保存时先将含有细胞的冷冻保存液缓慢冷冻，然后在液氮中长期贮存。但是，含血清的保存液成分不明确，不仅含有细胞因子、生长因子、激素等成分，还有未知的成分。发明人在研究过程中发现，使用上述常用的冷冻保存液来保存过表达VEGF的内皮祖细胞，会造成解冻复苏后的细胞表达VEGF能力下降，无法很好地保持细胞生物学特性，细胞增殖功能较差等问题。因此，本领域需要一种能够在较长时间内很好地维持过表达VEGF的内皮祖细胞的增殖功能和生物学特性并且组分明确的细胞保存液。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，该保存液组分明确，通过使用该保存液，能够长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞，并使复苏后的细胞很好地维持增殖功能和内皮祖细胞的生物学特性。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，包括：白蛋白、葡萄糖、乙二醇、二甲基亚砜、表皮生长因子、硫酸镁、L-谷氨酰胺和倍他米松。优选地，所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，包括：0.1-20％白蛋白、0.1-10％葡萄糖、0.1-5％乙二醇、5-20％二甲基亚砜、5-15ng/ml表皮生长因子、0.15-0.3g/l硫酸镁、2-5mML-谷氨酰胺和80-100ng/ml倍他米松。在一个优选的实施方案中，所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，包括：0.5-15％白蛋白、0.5-10％葡萄糖、2-5％乙二醇、5-15％二甲基亚砜、10-15ng/ml表皮生长因子、0.2-0.3g/l硫酸镁、2-5mML-谷氨酰胺和80-100ng/ml倍他米松。在另一个优选的实施方案中，所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，包括：2-15％白蛋白、1-10％葡萄糖、2-5％乙二醇、5-12％二甲基亚砜、12-15ng/ml表皮生长因子、0.2-0.3g/l硫酸镁、2.5-5mML-谷氨酰胺和80-95ng/ml倍他米松。在再一个优选的实施方案中，所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，包括：6-15％白蛋白、4-10％葡萄糖、2-5％乙二醇、5-12％二甲基亚砜、12-15ng/ml表皮生长因子、0.2-0.3g/l硫酸镁、2.5-5mML-谷氨酰胺和80-95ng/ml倍他米松。在一个具体的实施方案中，所述的长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液，包括：10％白蛋白、8％葡萄糖、5％乙二醇、10％二甲基亚砜、15ng/ml表皮生长因子、0.25g/l硫酸镁、3mML-谷氨酰胺和80ng/ml倍他米松。本发明还提供了一种长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的方法，所述方法包括：(1)取对数生长期的过表达VEGF的血管内皮祖细胞，去除旧的培养基，用PBS清洗；(2)去除PBS，加入适量胰蛋白酶，使其覆盖培养皿表面，将单层生长的细胞消化下来；(3)将步骤(2)所得的细胞液离心，去除上清；(4)向步骤(3)得到的细胞中加入冷冻保存液，轻轻吹打细胞使细胞悬浮均匀，计数并调节冷冻保存液中的细胞浓度为1×106-1×107个/ml；(5)将步骤(4)得到的细胞保存液分装到冻存管中；(6)将冻存管进行冻存。优选地，在步骤(4)中，调节冷冻保存液中的细胞浓度为5×106-1×107个/ml。优选地，在步骤(5)中，每个冻存管中的细胞保存液体积为1-1.5ml。优选地，在步骤(6)中，使用程序冷冻仪对冻存管进行冻存。在一个优选的实施方案中，在步骤(6)中，设定程序冷冻仪的降温速度为-1至-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，增至-5至-10℃/min；当温度达到-100℃时，转移至液氮中储存。本发明针对过表达VEGF的血管内皮祖细胞的特性，研制出了一种长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞的保存液。该保存液成分清楚明确，能够长期保存过表达VEGF的内皮祖细胞，并使复苏后的细胞很好地维持增殖功能和内皮祖细胞的生物学特性。其中，二甲基亚砜是一种渗透性保护剂，可迅速渗入细胞，降低细胞的冰点，促进细胞内水渗出胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的损伤；乙二醇可以进一步有助于减少细胞由于冰晶形成及渗透压改变而导致的物理损伤；白蛋白、葡萄糖、表皮生长因子、硫酸镁、L-谷氨酰胺等可以为细胞提供冷冻保存所需的渗透压及缓冲体系等条件，并在细胞复苏时有助细胞快速恢复；发明人在长期研究过表达VEGF的内皮祖细胞过程中发现，通过向保存液中添加表皮生长因子和倍他米松，可以进一步提高复苏后的细胞的增殖功能，还可以更好地维持其内祖细胞的生物学特性，具体机理尚不十分明确。综上所述，本发明与现有技术相比，具有如下优点：(1)本发明提供的保存液成分清楚明确，不含血清。(2)通过使用本发明提供的保存液对过表达VEGF的内皮祖细胞进行冻存，可以很好地维持过表达VEGF的内皮祖细胞的增殖功能和生物学特性。附图说明图1复苏的过表达VEGF的血管内皮祖细胞增殖功能检测；现结合附图和实施例对本发明作进一步说明：具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1构建过表达VEGF的血管内皮祖细胞实验方法：1)血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定：3-4周龄Vistar大鼠，脱颈处死，酒精浸泡消毒，取长骨，剪开，冲洗骨髓，将细胞悬液加入大鼠淋巴细胞分离液表面，离心，取两层液体之间云雾状细胞，洗涤，加入EGM-2MV培养液，CO2细胞培养箱培养。取0，4，7，10天的贴壁细胞，进行标记CD34，FLK-1，CD133，vWF的免疫组化检测，第14天的细胞进行投射电镜检查可见特异性的W-P小体。2)PcDNA3.0-hVEGF165真核表达载体的构建：根据GENEBANK的VEGF165序列合成VEGF165的cDNA并在其5’端引入Kpn-1酶切位点，在其3’端引入EcoRV酶切位点(金斯瑞生物科技公司合成)，对PcDNA3.0质粒和合成的VEGF165片段进行Kpn-1和EcoRV双酶切，T4连接酶连接。将连接产物转化到DH-5α感受态细胞，氨苄青霉素平板筛选，挑单克隆进行酶切验证和测序，得到正确的PcDNA3.0-hVEGF165质粒克隆。3)PcDNA3.0-hVEGF165转染血管内皮祖细胞：细胞生长到第十天消化细胞连接，5％FCS的EBM-2培养基配成1×105/ml细胞悬液按1ml/孔接种于已预铺盖玻片的24孔板。培养过夜细胞生长融合到50％-70％，按照脂质体Lipofectamine的操作说明书，将脂质体2μl和PcDNA3.0-hVEGF165质粒2μl转染血管内皮祖细胞。实施例2-3和对比例1-3血管内皮祖细胞转染VEGF165后，对于得到的过表达VEGF的血管内皮祖细胞，取第10代细胞进行低温保存。实施例2-3和对比例1-3分别使用不同的保存液。实施例2-3和对比例1-2使用的保存液成分如下表所示，对比例3使用的保存液为含10％二甲基亚砜的20％牛血清培养基。其中白蛋白为人血白蛋白，购自ThermoFisher公司(货号191297010)；牛血清购自ThermoFisher公司(货号10099158)。实施例2-3和对比例1-3均按照以下方法进行细胞的冷冻保存：(1)取对数生长期的过表达VEGF的血管内皮祖细胞，去除旧的培养基，用PBS清洗；(2)去除PBS，加入适量胰蛋白酶，使其覆盖培养皿表面，将单层生长的细胞消化下来；(3)将步骤(2)所得的细胞液离心，去除上清；(4)向步骤(3)得到的细胞中加入冷冻保存液，轻轻吹打细胞使细胞悬浮均匀，计数并调节冷冻保存液中的细胞浓度为5×106个/ml；(5)将步骤(4)得到的细胞保存液分装到冻存管中，每管1ml；(6)使用程序冷冻仪对冻存管进行冻存，设定程序冷冻仪的降温速度为-1至-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，增至-5至-10℃/min；当温度达到-100℃时，转移至液氮中储存。实施例4复苏的过表达VEGF的血管内皮祖细胞增殖功能检测检测经过6个月冻存后，实施例2-3和对比例1-3保存的细胞的增殖功能：(1)从液氮中取出冷冻管，迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌环境中取出细胞；(2)在1000r/min速度下离心5-10分钟，弃去上清，加入适量培养液(DMEM+20％FBS+bFGF)后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃细胞培养箱静置培养。(3)24h后，将培养瓶中的细胞按1.0×104/孔的密度接种于标准24孔培养皿内培养。接种后1-7天每天取3孔细胞消化，进行细胞计数，进行血管内皮祖细胞增殖功能鉴定，步骤如下：1)在无菌操作下吸尽孔内培养基，加入1mlPBS静置3min×2次(液体与皿底充分接触)；2)弃PBS液后加入胰酶0.2ml摇匀；3)镜下见细胞变圆、悬浮在液体中时可冲洗、吹打(将贴壁细胞冲至液体中)；4)在光学显微镜下细胞计数，计数统计结果见图1。由图1结果可知，与使用对比例1-3的保存液相比，通过使用实施例2-3的保存液，复苏的过表达VEGF的血管内皮祖细胞增殖功能更好。实施例5复苏的过表达VEGF的血管内皮祖细胞生物学特性检测检测经过6个月冻存后，实施例2-3和对比例1-3保存的细胞的生物学特性：(1)从液氮中取出冷冻管，迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌环境中取出细胞；(2)在1000r/min速度下离心5-10分钟，弃去上清，加入适量培养液(DMEM+20％FBS+bFGF)后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃细胞培养箱静置培养。(3)培养24h后进行贴壁细胞消化，分别取1×106个细胞，以PE标记的CD34和CD133抗体标记细胞，流式细胞仪(FACACalibur型)检测，以上荧光标记抗体均购自BD公司。经流式免疫表型检测，经实施例2-3和对比例1-3保存的细胞各抗体阳性率的统计结果如下表所示：实施例2实施例3对比例1对比例2对比例3CD34PE99.93％99.68％92.52％94.58％94.22％CD133PE99.31％99.26％90.45％92.46％91.37％由检测结果可知，与使用对比例1-3的保存液相比，通过使用实施例2-3的保存液，复苏的过表达VEGF的血管内皮祖细胞的生物学特性得到了更好地保持。本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3