本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，是一种提高大麦小孢子培养愈伤产量和绿苗的方法。
背景技术：
植物小孢子(microspore)是由花粉母细胞经减数分裂后形成的四分体产生的单倍体性细胞，在离体胁迫条件下可以由原有的配子体发育途径转向孢子体发育途径，经胚胎发育形成完整植株。利用这一单倍体性细胞培养体系进行基因转化，通过染色体加倍可以快速纯合、稳定下来，同时可以获得高频再生植株。
小孢子离体培养技术是目前发展起来的重要单倍体育种技术，在烟草、油菜、玉米、辣椒等多种作物中都已建立起成熟的游离小孢子培养体系。本实验室以大田种植材料为供体植株，建立了国内领先、国际先进的大麦高效小孢子再生体系。大田环境极其复杂、受天气影响较大、难以控制，大田种植只能在当季获得小孢子培养供体材料，受季节性限制，并且同批次材料间小孢子的活力差异很大。人工气候室种植能为大麦提供稳定一致的生长环境，可以人为地控制给予供试材料最佳的温度、湿度、光照等生长条件，能解决大田种植的局限。但是由于经济原因人工气候室的面积收到限制，种植大麦苗数量收到极大的限制。因此研究如何提高单株大麦小孢子愈伤产量和成绿苗量是解决大麦苗数量的最有效方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术上的缺陷，提供一种高大麦小孢子培养愈伤产量和绿苗的方法。本发明通过在大麦苗期对幼苗进行低温处理，然后移至人工气候室种植，最终单株通过低温处理后的大麦小孢子培养获得平均愈伤数和绿苗数相对无低温处理大麦有极大的提升。为大麦单倍体育种，大麦单倍体转化提供了更高效的方法。
本发明的第一方面，提供一种提高大麦小孢子培养愈伤产量和绿苗的方法，包括以下步骤：
种植大麦，待幼苗生长至二叶一心期时(此时可以确定大麦幼苗成活并能进行光合作用开始生长)，对其进行低温处理，即将其移至3-5℃(优选4℃，温度过高幼苗生长过快，容易形成高脚苗；温度过低幼苗生长过慢或者不生长，影响后续实验进度)培养28-32天(优选30天，时间过长大麦幼苗叶片开始变黄；时间过短，大麦幼苗低温处理效果不显著)后移植于人工气候室培养。
较优的，所述的人工气候室的植株培养条件为：温度晚上18℃，白天20℃；湿度65％；12小时光照，12小时黑暗。低温处理后大麦没有抽穗，必须长到抽穗时间才能培养小孢子。
较优的，所述的低温处理的植株培养条件为：温度晚上3-5℃(优选4℃)，白天3-5℃(优选4℃)；湿度60-70％(优选65％，此湿度范围是大麦幼苗生长适宜湿度，低于或超过该湿度会影响大麦幼苗的生长)；10-14小时(优选12小时，通常选择光照12h，使大麦幼苗能充分进行光合作用)光照，10-14小时(优选12小时，选择黑暗12h，使大麦幼苗能充分进行生长、发育)黑暗；低温处理28-32天(优选30天)后移植于人工气候室培养。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的提高大麦小孢子培养愈伤产量和绿苗的方法，包括以下步骤：
种植大麦，待幼苗生长至二叶一心期时，对其进行低温处理，植株培养条件为：温度晚上4℃，白天4℃；湿度65％；12小时光照，12小时黑暗；低温处理30天后移植于人工气候室，植株培养条件为：温度晚上18℃，白天20℃；湿度65％；12小时光照，12小时黑暗。
本发明的第二方面，提供一种如上所述的提高大麦小孢子培养愈伤产量和绿苗的方法在大麦遗传育种改良中的应用。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的提高大麦小孢子培养愈伤产量和绿苗的方法在大麦分子生物学研究中的应用；
本发明优点在于：
1、本发明在大麦小孢子培养高效再生的基础上，进一步优化培养过程，获得更高的愈伤产量和绿苗。在大麦幼苗阶段4℃低温处理30天后移植于人工气候室种植，和无低温处理的大麦相比，相同浓度的小孢子培养20天时愈伤产量增加2.3％，移至分化培养基培养20天。移至壮苗培养基培养，最终低温处理比无低温处理小孢子愈伤绿芽增加343.6％。
2、本发明针对大麦小孢子技术中的苗期管理做出改良，通过低温处理大麦幼苗一段时间，将大麦幼苗移至人工气候室种植，显著提高大麦小孢子愈伤产量和成绿苗数，使大麦小孢子培养技术操作更加高效。这项改良技术可应用于大麦单倍体育种、单倍体转化。
附图说明
图1.低温和常温处理花30幼苗小孢子培养20天时愈伤形成情况比较(t-test，p<0.05)。
图2.低温和常温处理花30幼苗小孢子培养绿苗数情况比较(t-test，p<0.05)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1低温处理大麦材料花30幼苗
种植大麦材料花30于盆钵中(大麦品种花30是由上海市农业科学院生物技术研究所细胞工程研究室培育的优良大麦品种，国内种植面积较广，种子由上海市农业科学院细胞工程研究室保存)，待幼苗生长至二叶一心期时，移至智能培养箱中进行低温处理，植株培养条件为：温度晚上4℃，白天4℃；湿度65％；12小时光照，12小时黑暗。低温处理30天后移植于人工气候室，无低温处理植株作为对照组同时种植，植株培养条件为：温度晚上18℃，白天20℃；湿度65％；12小时光照，12小时黑暗。
实施例2大麦材料花30小孢子培养
选取低温处理和对照植株幼穗中部小花小孢子发育处于单核早-中期的大麦穗子，剪去叶片(保留上部两片叶子基部约1.5cm)，用干净的湿纱布包好幼穗，放入保鲜袋中保湿，标明取材日期和数量等，放入4℃冰箱中进行2～4周低温预处理。经过低温处理的材料取花苞游离小孢子，小孢子游离参照陆瑞菊等方法(参考文献：陆瑞菊,黄剑华，等，秋水仙碱对大麦离体培养小孢子存活与成苗的影响。植物生理学报，2001，27(2)：135～140)。每个试管接4个穗子的花苞，加入12ml提取液(甘露醇60g/l+cacl21.1g/l+mes0.976g/l+秋水仙碱20mg/l，ph5.8)，用高速分散器超速旋切。把旋切好的悬浮液，用300目筛网过滤，滤液以700rpm，5min低速离心，重复3次，收集小孢子。收集到的小孢子用提取液于25℃、黑暗中预处理2d后再纯化培养小孢子。培养前小孢子用诱导培养基(n6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加90g/l麦芽糖、0.5mg/lkt、1.0mg/l2,4-d、0.976g/lmes、400mg/l水解干酪素+1600mg/l谷氨酰胺，ph5.8)洗涤1次，密度调节至1.0×105/m1，取1.5ml(约1.5×105个)小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)中，parafilm封口，25℃，暗培养。培养至20天时对两组处理小孢子愈伤称重(附图1)，低温处理小孢子愈伤平均重量为4.26g/皿，常温处理小孢子愈伤平均重量为4.16g/皿，低温处理比常温条件下愈伤产量增加2.3％，在p<0.05条件下有显著差异。
移至分化培养基(2/3ms+麦芽糖30g/l+6-ba0.5mg/l+kt1.5mg/l+naa0.05mg/l+琼脂5.5g/l，ph5.8)进行分化培养。待分化芽长至2-4cm时转移至壮苗培养基(1/2ms+蔗糖30g/l+naa0.05mg/l+多效唑4.0mg/l+琼脂5.5g/l+头孢噻肟钠100mg/l，氨苄青霉素100mg/l，ph5.8)培养。至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开盖炼苗1-2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，统计两组处理材料最终获得再生植株数(附图2)。低温处理绿苗平均株数为173棵/皿，常温处理绿苗平均株数为39棵/皿，低温处理比无低温处理小孢子愈伤绿芽增加343.6％，在p<0.05条件下有显著差异。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。