本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种稳定的苹果矮化砧m9t337的组织培养新方法专利申请事宜。
背景技术：
苹果是我国第一大水果品种，全国的种植面积约有3700万亩（2016年）。长期以来，我国苹果以乔砧大冠稀植为主要种植模式，存在树体高大、种植密度低、果实商品性差等问题，并且不能机械操作，已经不适应现代果业的发展。矮砧密植栽培具有树冠小、结果早、果实品质优良，便于标准化、机械化生产等优点，已经成为苹果栽培的发展趋势。近年来世界苹果生产先进国家基本上完成了由乔砧稀植向矮砧密植种植模式的过渡，我国也在普及矮砧密植栽培模式，并且在栽培中所占的比重越来越大。
利用苹果矮化砧是达到苹果矮化密植的重要手段。m9t337是苹果矮化砧m9系中的一个优良无病毒系，其矮化效果好，具有建园成形快、结果早等优点，在生产中广泛应用，种苗需求旺盛。
植物组织培养方法具有可短期内提供大量种苗，易于实现量产的技术优势，因而是多种瓜果种苗的主要提供生产方式之一。但种苗组培化量产的前提是要有稳定的增殖体系、较高的生根效率和移栽成活率，这个目标的实现需要多个因素配合，如合适的培养基、适宜的培养条件以及培养方法等。现有组培化生产研究中，由于不同物种组培条件不一，缺乏较为统一性的规律可以遵循，因此多侧重于针对不同物种、不同品种的培养基成分和培养条件的试验研究。而针对苹果组培研究中，目前主要问题还有：量产化过程中，随着继代次数增加，组培苗容易出现玻璃化、苗高降低、生长势衰退现象，进而影响增殖和生根培养，导致生产效率低，生产成本高。因而对于苹果种苗的组培体系，尚需进一步对培养基及对应的组织培养方法进行优化调整，以建立稳定的量产技术体系。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种稳定的苹果矮化砧m9t337量产组织培养新方法，从而为苹果的矮砧密植技术的推广奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种苹果矮化砧m9t337组织培养用培养基组合物，所述培养基组合物包括初代培养基、第一型继代培养基、第二型继代培养基和生根培养基；具体而言：
初代培养基：以ms为基本培养基，附加有：6-苄氨基嘌呤（6-ba）0.5～1.3mg/l、吲哚丁酸（iba）0.5～1.3mg/l、蔗糖20～40g/l、琼脂5～7g/l；
所述初代培养基优选配方为：以ms为基本培养基，附加有：6-苄氨基嘌呤（6-ba）1.3mg/l、吲哚丁酸（iba）0.5mg/l、蔗糖40g/l、琼脂6g/l；
第一型继代培养基：以改良ms为基本培养基，附加有：蔗糖30～50g/l、琼脂5～7g/l，6-ba0.1～0.5mg/l、iba0.3～0.8mg/l；
所述第一型继代培养基优选配方为：以改良ms为基本培养基，附加有：蔗糖30g/l、琼脂6g/l，6-ba0.2mg/l、iba0.4mg/l；
第二型继代培养基：以改良ms为基本培养基，附加有：蔗糖30～50g/l、琼脂5～7g/l，6-ba0.5～1.0mg/l、iba0.3～0.8mg/l；
所述第二型继代培养基优选配方为：以改良ms为基本培养基，附加有：蔗糖30g/l、琼脂6g/l，6-ba0.8mg/l、iba0.4mg/l；
生根培养基，以ms为基本培养基，其中大量元素减半，附加有：iba0.3～0.8mg/l，吲哚乙酸（iaa）0.3～0.8mg/l、蔗糖20～40g/l、琼脂5～7g/l；
所述生根培养基优选配方为：以ms为基本培养基，其中大量元素减半（即1/2ms培养基），附加有：iba0.6mg/l，吲哚乙酸（iaa）0.5mg/l、蔗糖20g/l、琼脂6g/l。
一种苹果矮化砧m9t337组织培养量产方法，该方法具体包括如下步骤：
（1）初代培养：
以苹果矮化砧木m9t337带腋芽茎段为外植体，灭菌后利用初代培养基进行初代培养，培养25~35天左右至形成若干适量（一般形成1~4个不等）不定芽丛为止；
所述外植体，具体标准可参考为：保留有顶端3片叶的苹果矮化砧木m9t337小苗的上部带腋芽茎段；
具体灭菌步骤可参考为：
先初步清洗茎段（用肥皂水浸泡1～2min，自来水冲洗30min）；
再拿至超净工作台上：先用无菌水冲洗2遍；再用75%酒精浸泡10s，然后无菌水冲洗2次；0.1%升汞（加入一滴吐温80）灭菌6～8min，无菌水冲洗6次（每遍1～2min）；最后取出茎段放在无菌滤纸上吸干水分，切去茎段基部及叶柄上端和受伤叶片，然后即可接种于使用；
所述初代培养基，以ms为基本培养基，附加有：6-苄氨基嘌呤（6-ba）0.5～1.3mg/l、吲哚丁酸（iba）0.5～1.3mg/l、蔗糖20～40g/l、琼脂5～7g/l；
具体培养时，培养条件为：温度为26±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间7h/d；
（2）继代培养：
切取步骤（1）中初代培养后的不定芽丛，转接至继代培养基上，进行继代扩繁培养；
所述继代培养基有两种类型，
第一型继代培养基：以改良ms为基本培养基，附加有：蔗糖30～50g/l、琼脂5～7g/l，6-ba0.1～0.5mg/l、iba0.3～0.8mg/l；
第二型继代培养基：以改良ms为基本培养基，附加有：蔗糖30～50g/l、琼脂5～7g/l，6-ba0.5～1.0mg/l、iba0.3～0.8mg/l；
继代培养时，先在第二型培养基中继代培养三个周期后，再在第一型继代培养基中继代培养一个周期，一般而言，应培养至幼苗苗高不小于2cm，优选培养至苗高3~5cm后再用于后续诱导生根；每个周期的时长为25~35天，优选设置为30天；
具体培养时，培养条件为：温度为26±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间7h/d；
（3）生根、炼苗：
切取步骤（2）中继代培养后生长健壮的单芽幼苗，接种到生根培养基上，诱导生根并进行炼苗培养；
一般而言，生根与炼苗可以分开进行，但优选方式下，本申请中可以将生根培养与炼苗环节相结合，从而简化相关操作，并最终减少所需组培时间；
所述生根培养基，以ms为基本培养基，其中大量元素减半，附加有：iba0.3～0.8mg/l，吲哚乙酸（iaa）0.3～0.8mg/l、蔗糖20～40g/l、琼脂5～7g/l；
具体生根、炼苗过程为：接种生根培养基后，先培养8～20d进行诱导生根培养，然后将诱导后的幼苗置于外界环境中培养10～22d继续生长，以适应外界环境；
具体生根培养时，培养条件为：温度为26±2℃，光照强度1500～4000lx，光照时间6～12h/d；较优生长条件设置为：温度为26±2℃，光照时间为8h/d，光照强度为3000～4000lx；
生根炼苗时，环境条件要求为：温度25～30℃，光照强度为5000～10000lx，光照时间为自然光照时长；
（4）移栽：
将步骤（3）中生根、炼苗后组培幼苗，进行移栽育苗；
所述移栽，具体可参考如下操作：将步骤（3）中生根炼苗后幼苗从培养瓶中取出，清水洗掉苗基部培养基，用800～1000倍多菌灵消毒2～3min，移入栽培基质（体积比，草炭：珍珠岩=4:1）中，移栽初期扣小拱棚保温保湿，一周后逐渐掀开棚膜通风。
初步试验结果表明，本申请通过优化培养基中生长激素组合及其浓度，同时通过优化组培方法，结合继代培养中不同类型培养基的交替使用，有效降低了玻璃化苗、黄化苗现象，使增殖系数稳定在5倍，苗高在3cm以上，增殖与生根比例控制在1：2～3之间，进一步通过将生根培养与炼苗环节结合缩短移栽时间，使得从生根到移栽由原来的40d左右减少到30d左右，总体生根率稳定在88%左右，移栽成活率达到84%左右，表现出较好的组培生产效果。
总体而言，本发明较好解决了现有苹果矮化砧m9t337量产中增殖系数不稳定、易于玻璃化，苗高降低、生长势衰退等问题，在适宜的增殖和生根培养基上，经过优化继代培养方法、生根炼苗等技术细节，可较好提高生产效率，降低组培周期和组培成本，形成了较为稳定的组织培养量产新方法，具有较好的生产应用价值。
附图说明
图1为苹果矮化砧木m9t337初代培养过程中生产实际图；
图2为苹果矮化砧木m9t337继代增殖培养中生产实际图；
图3为苹果矮化砧木m9t337组培苗生根后生产实际图；
图4为苹果矮化砧木m9t337生根苗移栽后生产实际图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：苹果矮化砧木m9t337，一种常见苹果矮化砧木品种苗木；
实验地点：相关实验均在河南省农业科学院园艺研究所植物组培快繁生产中心进行，相关温湿度及光照调节设备均是通用设备，不再赘述；具体培养过程中，初代和继代增殖培养条件为：温度为26±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间7h/d。
实施例
以苹果矮化砧木m9t337无菌体系构建为例（构建过程中部分实际生长情况如图1~图4所示），就本申请的苹果矮化砧m9t337组织培养方法简要介绍如下。
（一）初代培养：以苹果矮化砧木m9t337带腋芽茎段为外植体，灭菌后利用初代培养基进行初代培养，培养30d左右至形成适量不定芽丛。
选择外植体时，具体选择标准为：保留有顶端3片叶的苹果矮化砧木m9t337小苗的上部带腋芽茎段；
具体灭菌步骤为：
先初步清洗茎段：用肥皂水浸泡1～2min，然后自来水冲洗30min；
再拿至超净工作台上：先用无菌水冲洗2遍；再用75%酒精浸泡10s，然后无菌水冲洗2次；0.1%升汞（加入一滴吐温80）灭菌6～8min左右，无菌水冲洗6次（每遍1～2min）；最后取出茎段放在无菌滤纸上吸干水分，切去茎段基部及叶柄上端和受伤叶片，然后即可接种于使用。
初代培养时的初代培养基，以ms为基本培养基，附加有：6-苄氨基嘌呤（6-ba）1.3mg/l、吲哚丁酸（iba）0.5mg/l、蔗糖40g/l、琼脂6g/l。
（二）继代培养：切取步骤（一）中初代培养后的不定芽丛，转接至继代培养基上，进行继代扩繁培养；
所述继代培养基有两种类型，
第一型继代培养基：以改良ms为基本培养基，附加有：蔗糖30g/l、琼脂6g/l，6-ba0.1～0.5mg/l、iba0.3～0.8mg/l；
第二型继代培养基：以改良ms为基本培养基，附加有：蔗糖30g/l、琼脂6g/l，6-ba0.8mg/l、iba0.4mg/l；
继代培养时，先在第二型培养基中继代培养三个周期后，再在第一型继代培养基中继代培养一个周期。
需要解释和说明的是，本实施例中，每个培养周期设置为30d。之所以必须进行培养基类型转换，其主要原因是：
上述第二型继代培养基也是现有苹果砧木培养中的常用培养基配方，常规大量实验观察总结表明：常规组培过程中，采用此配方继代培养3个周期后，激素易于在植物体内发生明显累积，存在增殖系数过大、玻璃化现象明显、苗高降低，组培苗生长势减弱等现象，进而造成能够用于生根的有效新梢数量减少，且不利于后续生根培养。为克服此问题，发明人对于培养基配方进行了重新调整、设计，并由此获得了第一型继代培养基配方，并据此进行了培养周期转换的培养方法的调整。
（1）第一型继代培养基中6-ba浓度确定
为确定继代培养过程中，第一型继代培养基中6-ba的较佳用量，以幼苗生产状况和幼苗叶片大小为指标，对于不同6-ba浓度中幼苗生长情况进行了观察统计，相关数据列表1如下（培养方法均为：先在第二型继代培养基中培养三个周期，再在第一型继代培养基中进行培养一个周期）。
表1，继代培养基a中不同6-ba浓度处理对苗的增殖影响（实验处理组对应培养基配方中的iba均为0.4mg/l）
需要说明的是，6-ba浓度确定原则应当是：确保继代增殖效果的稳定性，同时避免玻璃化现象的发生。基于此，对上表1结果分析可以看出，随着6-ba浓度的增加，增殖系数也逐渐增加，苗高也逐步增加；但总体而言，在6-ba浓度超过0.2mg/l时，继续增加时组培苗逐渐变弱，不利于继代或生根培养，因而综合确定6-ba浓度0.2mg/l为宜，此时更适于后续增根培养。
（2）培养密度确定
需要明确和解释的是，合适的培养密度对于组培幼苗的生长也具有较为直接的影响，密度过小时，生长速度不一致，容易横向增殖多，同时也易增加组培成本；而密度过大时，幼苗伸长速度虽然较快，但易于出现苗细、营养供应不足问题，进而导致出现黄叶，因此对于幼苗培养密度也需进一步优化确定。
为确定最优培养密度，在上述第二型继代培养基继代培养过程中，每瓶（培养瓶，材质玻璃，规格为高11cm、直径6.5cm）接入丛生芽数量为5~10丛，以确定每瓶培养基中接入丛生芽的最适数量；
对于不同接种密度情况下增殖苗生长情况进行观察统计，具体统计列表如下。
表2，不同接种密度对增殖苗的影响（表格中数据均是基于第二型培养基培养阶段的统计记录）：
从上表数据可以看出，最佳接种密度为每瓶接种7丛，更有利于组培苗生长，此时组培苗生长速度较为一致、增殖和生长协调，因此后续组织培养过程中，增殖培养阶段（即整个继代培养阶段，包括第一型培养基的培养阶段和第二型培养基的培养阶段）均采用此培养密度。
需要解释和说明的是，上述实验结果及数据仅是部分较优实验记录结果，并非整个实验阶段的全部实验结果记录。而从上述结果可以看出，经优化后，具体继代培养时，优化后的培养基及培养方法为：将苹果矮化砧木m9t337的初代培养材料（切分成带2～3个芽的丛生芽），每瓶接入7个丛生芽，先采用第二型继代培养基（改良ms+6-ba0.8mg/l+iba0.4mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l）培养3个周期，再采用第一型继代培养基（改良ms+6-ba0.2mg/l+iba0.4mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l）培养一个周期；后续实验即以此优化后培养基及培养方法所制备幼苗进行生根及炼苗实验。
（三）生根炼苗：
切取步骤（2）中继代培养后生长健壮的单芽幼苗，接种到生根培养基上，进行生根、炼苗培养；
所述生根培养基，以ms为基本培养基，其中大量元素减半（即1/2ms培养基），附加有：iba0.6mg/l，吲哚乙酸（iaa）0.5mg/l、蔗糖20g/l、琼脂6g/l。
所述生根、炼苗，需要强调的是，本申请可以将生根培养与炼苗环节相结合，先在培养间进行8～20d的诱导生根培养，再将生根瓶苗放置于温室中继续生根炼苗10～22d，以适应外界环境。
本实施例中的培养条件方面：诱导生根时：光照时间为8h/d，光照强度为3000～4000lx，培养温度26±2℃，在此环境中进行组培苗根原基诱导培养，培养一段时间后，再将组培苗置于温室中培养，温室中的光照强度远大于培养间的光照强度，在5000～10000lx，光照时间为自然光照时长，培养温度为25～30℃，此环境条件与移栽时的环境条件一致；此方式的主要优点在于：在培养间由于仅需诱导根原基形成，而根系的继续生长发育可以在温室中完成，从而与炼苗环节结合在一起，节省了培养间空间，同时简化了炼苗程序，可较好缩短生根移栽周期。
（1）培养间生根诱导培养条件的筛选优化
需要说明的是，在生根诱导环节诱导根原基形成时，合适的光照强度、光照强度对于幼苗是有直接影响的，为确定较好生长环境条件，以根原基诱导率为评价目标，结合苗高情况，发明人对于培养间的光照时长、光照强度条件进行了筛选优化。具体实验设置及实验结果如下表所示。
表3，光照时间和光照强度对苹果矮化砧m9t337生根情况的影响：
综合生长记录的观察结果表明：在光照时间开始为12h/d，光照强度2000～2500lx情况下，苗高和生根不整齐；而在调整光照强度为1500～4000lx，光照时间为8～10h/d后，苗根原基诱导率很高，在90%以上，苗高在3cm以上，组培苗长势好；因此后续实验均以此优化后培养条件进行生根诱导培养。
（2）不同的生根诱导培养时间及生根、炼苗时间对组培苗移栽的影响
对优化后的“光照时间为8h/d，光照强度为3000～4000lx，培养温度26±2℃”培养条件下的幼苗进行生根诱导及生根、炼苗时间筛选，幼苗先在培养间进行不同培养时间的生根诱导，再放至温室进行不同时间的生根、炼苗，以生根率、成活率等数据为统计指标，对不同的生根诱导培养时间及生根、炼苗时间对组培苗移栽影响进行统计，结果如下表所示。
表4，幼苗不同生根诱导培养时间及生根炼苗时间对移栽的影响：
需要说明的是，所述常规方法：是将生根环节与炼苗环节分开进行，即：先在培养间生根培养30d，组培苗根系生长完好后再置于温室中进行炼苗一周左右，让生根苗适应外界条件后再行移栽。具体移栽时，本申请与常规方法相同，具体移栽操作步骤如下：
用清水洗净根系粘附的培养基，放入800倍的多菌灵溶液中进行消毒2min～3min左右，栽入营养钵中，移栽基质为草炭和珍珠岩（比例为4:1），移栽后及时浇水定根；移栽后覆盖塑料拱棚，密闭保湿；
移栽初期8d～12d，保持小苗的生长温度25℃～28℃，相对湿度保持在90%以上；当移栽苗长出新根后，逐渐透气通风，先一侧后两端，逐步揭开塑料拱棚，直至完全适应外界的环境。
还需说明的是，上述成活率统计是在移栽后（在生根的组培苗根系长到2～3cm时进行移栽）进行的统计。
一般而言，常规方法中，由于生根环节与与炼苗环节分开进行，在诱导生根阶段一般需要培养30~35d，进一步在温室中炼苗需要5~10d，因此整个生根和炼苗时间在40d左右。而从上表数据可以看出，在培养室诱导生根15d，再在温室中生根炼苗15d后，相比较其他处理而言，组培苗长势较好，平均苗高较高，生根率较高，可达88%，且移栽率可高达到84%，并且在将生根和炼苗环节结合起来后，从生根到移栽只需30d，比常规方法可提前10d，能够较好缩短整体组培所需时限。