本发明涉及生物资源的开发利用领域，具体涉及一种利用发芽玉米富集叶黄素的方法及其产品和应用。
技术背景
叶黄素是一种含氧类胡萝卜素，含有多个不饱和双键和紫罗酮环，广泛存在于自然界中，是构成蔬菜、水果、花卉等植物色素的主要组分；同时也是人眼视网膜黄斑区域的主要色素。除了对眼部健康有一定作用之外，研究还发现叶黄素对糖尿病、心血管疾病、癌症等多种慢性疾病有一定预防和改善作用。因此，富含叶黄素的食品开发已经成为热点。同时，叶黄素已被作为食品补充剂允许在食品、饮料、化妆品和保健品中添加。
现有技术中关于叶黄素的生产工艺研究主要体现在如何对原料进行分离、纯化的研究，如专利(公开号cn103058904b，公开日2016年3月30日)公开了一种富集纯化万寿菊中叶黄素的新方法，利用超临界co2萃取和膜分离技术富集纯化万寿菊中的叶黄素。利用生物学方法对叶黄素进行富集的研究较少。
植物种粒发芽后，其化学成分均有所改变，活性物质含量增多，且形成独特的风味及口感，提升植物营养品质。专利(公开号cn102754780b，公开日2014年3月5号)公开了“一种富含γ-氨基丁酸的冻干豆类芽菜及其生产工艺”；专利(公开号cn107211852a，公开日2017年9月29日)公开了“一种富集大麦中γ-氨基丁酸的生产方法”；专利(公开号cn106922509a，公开日2017年7月7号)公开了“一种富集豆芽菜中γ-氨基丁酸含量并提高产量的生产方法”；专利(公开号cn105901519a，公开日2016年8月31日)公开了“一种提高小米糙米中γ-氨基丁酸含量的方法”；专利(公开号cn104498548a，公开日2015年4月8号)公开了“一种利用发芽糙米富集γ-氨基丁酸的生产方法”。上述专利均只利用谷物种子进行发芽富集γ-氨基丁酸，但利用玉米发芽富集叶黄素未涉及专利公布。玉米是我国重要粮食作物，原料来源广泛，在营养与保健领域具有较大的开发价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种利用发芽玉米富集叶黄素的方法。
本发明提供了一种利用发芽玉米富集叶黄素的方法，以具有发芽能力的玉米籽粒为原料，所述原料经钙离子溶液浸种、黑暗培养后，uv-b辐照处理。
优选的，所述钙离子溶液为0.5～10.0mmol/l的cacl2溶液，所述钙离子溶液浸种的时间为6～10h。
优选的，所述钙离子溶液浸种前还包括，玉米籽粒用去离子水浸种12～20h。
优选的，所述黑暗培养的温度为22～28℃。
优选的，所述黑暗培养时间为10～14h。。
优选的，所述uv-b辐照在玉米籽粒表面的平均辐射强度为0.3～0.45w/m2。
优选的，所述uv-b辐照采用6～12w的紫外灯，所述紫外灯距离玉米籽粒的高度为20～50cm。
优选的，所述uv-b辐照的时间为30～60min。
本发明还提供了上述方法制备得到的发芽玉米，以所述发芽玉米的干重计，发芽玉米中的叶黄素含量不小于12μg/g。
本发明还提供了上述芽玉米在制备含有叶黄素的食品、药品、保健品或化妆品中的应用。
有益效果：
(1)本发明以玉米籽粒为原材料，在浸种期间施加适宜浓度的外源钙离子，钙离子在植物体内的代谢途径中起到调节因子及第二信使的作用，在逆境胁迫下，可提高玉米籽粒对逆境的抵御能力，改善其在逆境胁迫条件下的生长状况，缓解逆境胁迫的损伤；同时，对玉米籽粒内类胡萝卜素的合成也起到调节作用，促进类胡萝卜素的积累。发芽期间对玉米籽粒进行uv-b辐照胁迫，使其启动体内保护机制，即增强抗氧化系统及紫外吸收物质的积累，而叶黄素作为主要光保护色素，在uv-b辐射后大量积累。本发明将钙离子浸泡与紫外辐照胁迫的处理相结合，在叶黄素富集中起到了协同作用。在钙离子单独浸泡处理后，发芽玉米中叶黄素的富集率≤15％；将钙离子浸种与uv-b辐照联合处理后，发芽玉米籽粒中叶黄素提高率能够达到40％以上。
(2)本发明提供的方法中使用uv-b辐照，辐照时间短，仅照射30～60min即可，耗能低，易于实现工业化生产。
(3)本发明中，玉米籽粒经钙盐离子浸种及uv-b联合胁迫处理，对发芽玉米的芽长、根长等生理特征无影响，仍适合作为基质进行产品开发，对后续加工不会产生影响；此外，玉米籽粒的呼吸强度、还原糖含量及游离氨基酸含量分别提高了46.8％、41.1％、25％，提升了产品的营养品质及保健功能。
附图说明
图1为不同uv-b辐照时间发芽玉米籽粒中叶黄素含量变化；
图2为不同浓度钙离子联合uv-b胁迫发芽玉米籽粒中叶黄素含量变化；
图3为不同辐照切入时间发芽玉米籽粒中叶黄素含量变化为；
图4紫外联合盐胁迫下玉米籽粒中叶黄素含量变化。
具体实施方式
本发明提供了一种利用发芽玉米富集叶黄素的方法，以具有发芽能力的玉米籽粒为原料，所述原料经钙离子溶液浸种、黑暗培养后，uv-b辐照处理。
在浸种前，本发明优选筛选具有发芽能力的玉米籽粒，所述筛选优选用清水对待筛选的玉米籽粒进行淘洗，去除杂质；然后将玉米籽粒静置于清水中，5～10min后将上浮的玉米籽粒剔除。在本发明中，所述筛选的目的主要是去除玉米籽粒中的杂质和不饱满颗粒。
本发明优选对筛选得到的玉米籽粒进行消毒，所述消毒优选使用naclo溶液浸泡；所述naclo溶液的浓度优选为0.1％～1％，更优选为0.5％；所述消毒的时间优选为10～30min，更优选为25min。本发明优选使用去离子水对消毒后的玉米籽粒进行淘洗，以清洗玉米籽粒表面残余的naclo溶液，至玉米籽表面的ph值为7。
在钙离子溶液浸种前，本发明优选对玉米籽粒进行去离子水浸种，所述去离子水浸种的时间优选为12～20h，更优选为14～16h。在本发明中，所述去离子水浸种优选为间歇浸泡，所述间歇浸种每浸泡7h，断水1h；连续浸泡2次。本发明将玉米籽粒在去离子水中浸泡一段时间后取出，让种子与空气充分接触，进行呼吸作用；断水的目的是防止一次浸泡时间过长出现种子发粘发臭的现象。
本发明使用钙离子溶液对具有发芽能力的玉米籽粒进行浸种。在本发明中，所述钙离子溶液优选为cacl2溶液，所述cacl2溶液的浓度优选为0.5～10.0mmol/l，更优选为5mmol/l；所述浸种的时间优选为6～10h，更优选为8h；所述浸种的温度优选为10～30℃，更优选为18～25℃。在浸种期间施加适宜浓度的外源钙离子，可提高植物对逆境的抵御能力，改善其在逆境胁迫条件下的生长状况，缓解逆境胁迫的损伤。
钙离子溶液浸种后，本发明优选使用去离子水清洗籽粒表面残余的盐溶液，然后将冲洗后的玉米籽粒置于恒温恒湿培养箱内黑暗培养。在本发明中，所述黑暗培养的温度为22～28℃，优选为25℃；所述黑暗培养的相对湿度优选为70～98％，更优选为80～95％；所述黑暗培养的时间优选为10～14h，更优选为12h。玉米籽粒在黑暗中培养10～14h的目的是使玉米籽粒自然发芽，提高种粒自身的生长能力，保持一定的发芽率，再经uv-b胁迫(以免一开始施加紫外胁迫而导致种粒的严重受损)。另外，紫外光照射的切入时间经过单因素实验优化也得到该结论(图3)。在黑暗培养过程中，本发明优选将玉米籽粒置于垫有两层经去离子水润湿的滤纸的培养皿中，每4h喷一次水，以保持发芽玉米湿润。
本发明用uv-b辐照胁迫处理上述黑暗培养后的玉米籽粒。在本发明中，所述uv-b辐照在玉米籽粒表面的平均辐射强度为0.3～0.45w/m2，优选为0.375w/m2；所述uv-b辐照优选采用紫外灯进行，所述紫外灯的功率优选为6～12w，更优选为8w；所述紫外灯距离玉米籽粒的高度优选为20～50cm；更优选为30cm。所述uv-b辐照的时间优选为30～60min，更优选为40min。本发明在玉米籽粒发芽期间对玉米进行uv-b辐照胁迫，使其启动体内保护机制，促进叶黄素大量积累。黑暗辐照结束后，本发明优选将玉米籽粒放回22～28℃恒温条件下继续黑暗培养24～96h，优选为72h。
本发明优选将上述辐照后的发芽玉米真空冷冻干燥后粉碎，制得发芽玉米冻干粉。在本发明中，所述真空冷冻干燥前优选对所述发芽玉米洗净沥干，然后预冻；所述预冻的温度优选为-60～-100℃，更优选为-80℃；所述预冻的时间优选为20～30h，更优选为24h；所述粉碎后的粒径优选为过40～70目，更优选为过60目。在本发明中，所述真空冷冻干燥的温度优选为-70～-60℃，更优选为-65℃；所述真空冷冻干燥的时间优选为24～48h。
在本发明的实施例中，还对发芽玉米冻干粉的叶黄素含量进行了测定。具体的测定方法为：准确称取3.0g冻干玉米粉置于磨口锥形瓶中，加入30ml正己烷-乙醇-丙酮-甲苯(10：6：7：7，v/v)混合萃取液，静置3-4h，加入2ml40％koh-甲醇溶液摇匀后置于暗处25℃皂化16h，将皂化液转入分液漏斗，加40ml正己烷，振荡摇匀，再加入48ml10％硫酸钠溶液，弃去下层液，收集上层溶液。重复处理2次，混合上层溶液，旋转蒸发，氮气吹干，用2ml甲醇溶解，待高效液相色谱-二极管阵列检测-质谱(hplc-dad-ms)分析。
本发明提供了上述方法制备得到的发芽玉米，所述发芽玉米优选为发芽玉米冻干粉。以所述发芽玉米的干重计，发芽玉米中的叶黄素含量不小于12μg/g，叶黄素含量丰富。
本发明还提供了上述发芽玉米在制备含有叶黄素的食品、药品、保健品或化妆品中的应用，以上述发芽玉米配合其他活性成分；或以上述发芽玉米作为唯一活性成分，配合本领域可以接受的载体，制成食品、药品、保健品或化妆品。所述发芽玉米的用量为1～100％。。
下面结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围
实施例1
(1)玉米籽粒的筛选与消毒：玉米籽粒经去除杂质和不饱满颗粒后，用清水对其进行淘洗，静置5-10min，将上浮的玉米籽粒剔除后，再用0.5％naclo溶液浸泡消毒25min。
(2)间歇浸种：将步骤(1)中玉米籽粒用去离子水淘洗，清洗表面残余的naclo溶液。常温下每浸泡7h、断水1h，连续浸泡2次，共浸泡16h。
(3)盐胁迫浸种：用5mmol/l氯化钙溶液，常温下浸泡8h。浸种后用去离子水清洗籽粒表面残余的盐溶液。
(4)籽粒发芽：将步骤(3)中的玉米籽粒每30g(20～25粒)放入垫有已被润湿的双层滤纸的培养皿(ф15cm)中，置于25℃恒温培养箱内黑暗发芽12h。
(5)uv-b辐射处理：将步骤(4)中发芽玉米移至带有紫外灯管的培养箱内进行uv-b辐照处理，紫外灯管垂直悬挂于培养皿上方约30cm处，中心辐照强度为0.375w/m2，连续辐照40min后将玉米籽粒放回25℃恒温培养箱内继续黑暗发芽到72h。
(6)干燥制粉：将发芽后的玉米籽粒及其芽体洗净沥干，放入-80℃冰箱预冻24h，然后经真空冷冻干燥机干燥，粉碎后过60目筛，测得其中叶黄素含量为16.23μg/g。
实施例2
(1)玉米籽粒的筛选与消毒：玉米籽粒经去除杂质和不饱满颗粒后，用清水对其进行淘洗，静置5-10min，将上浮的玉米籽粒剔除后，再用0.5％naclo溶液浸泡消毒25min。
(2)间歇浸种：将步骤(1)中玉米籽粒用去离子水淘洗，清洗表面残余的naclo溶液。常温下每浸泡7h、断水1h，连续浸泡2次，共浸泡16h。
(3)盐胁迫浸种：用0.5mmol/l氯化钙溶液，常温下浸泡8h。浸种后用去离子水清洗籽粒表面残余的盐溶液。
(4)籽粒发芽：将步骤(3)中的玉米籽粒每30g(20～25粒)放入垫有已被润湿的双层滤纸的培养皿(ф15cm)中，置于25℃恒温培养箱内黑暗发芽12h。
(5)uv-b辐射处理：将步骤(4)中发芽玉米移至带有紫外灯管的培养箱内进行uv-b辐照处理，紫外灯管垂直悬挂于培养皿上方约30cm处，中心辐照强度为0.375w/m2，连续辐照40min后将玉米籽粒放回25℃恒温培养箱内继续黑暗发芽到72h。
(6)干燥制粉：将发芽后的玉米籽粒及其芽体洗净沥干，放入-80℃冰箱预冻24h，然后经真空冷冻干燥机干燥，粉碎后过60目筛，测得其中叶黄素含量为12.89μg/g。
实施例3
(1)玉米籽粒的筛选与消毒：玉米籽粒经去除杂质和不饱满颗粒后，用清水对其进行淘洗，静置5-10min，将上浮的玉米籽粒剔除后，再用0.5％naclo溶液浸泡消毒25min。
(2)间歇浸种：将步骤(1)中玉米籽粒用去离子水淘洗，清洗表面残余的naclo溶液。常温下每浸泡7h、断水1h，连续浸泡2次，共浸泡16h。
(3)盐胁迫浸种：用5mmol/l氯化钙溶液，常温下浸泡8h。浸种后用去离子水清洗籽粒表面残余的盐溶液。
(4)籽粒发芽：将步骤(3)中的玉米籽粒每30g(20～25粒)放入垫有已被润湿的双层滤纸的培养皿(ф15cm)中，置于25℃恒温培养箱内黑暗发芽12h。
(5)uv-b辐射处理：将步骤(4)中发芽玉米移至带有紫外灯管的培养箱内进行uv-b辐照处理，紫外灯管垂直悬挂于培养皿上方约30cm处，中心辐照强度为0.375w/m2，连续辐照1h后将玉米籽粒放回25℃恒温培养箱内继续黑暗发芽到72h。
(6)干燥制粉：将发芽后的玉米籽粒及其芽体洗净沥干，放入-80℃冰箱预冻24h，然后经真空冷冻干燥机干燥，粉碎后过60目筛，测得其中叶黄素含量为14.16μg/g。
对比例1
与实施例1相比，省略了步骤(3)和步骤(5)，直接将去离子水浸种后的玉米籽粒置于25℃恒温培养箱内黑暗发芽72h。
对比例2
与实施例1相比，省略了步骤(5)，直接将钙离子溶液浸种后的玉米籽粒置于25℃恒温培养箱内黑暗发芽72h。
对比例3
与实施例1相比，省略了步骤(3)，直接将去离子水浸种后的玉米籽粒在黑暗中培养12h，然后经辐照40min后置于25℃恒温培养箱内继续黑暗发芽到72h。
对比例1所述方案处理的发芽玉米干燥制粉后，测得其中叶黄素含量为9.15μg/g。实施例1～3相较对比例1的叶黄素含量分别提高了77.37％、40.87％和54.75％。
另外，本发明所述玉米籽粒经钙盐离子浸种及uv-b联合胁迫处理，对发芽玉米的芽长、根长等生理特征无影响，仍适合作为基质进行产品开发，对后续加工不会产生影响。详见表1：
表1：紫外联合盐胁迫下玉米籽粒各项生理生化指标情况
以上详细说明了本发明的实施方式，但这只是为了便于理解而举的实例，不应被视为是对本发明范围的限制。同样，任何所属技术领域的技术人员均可根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，做出各种可能的等同改变或替换，但所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。