玉米黄质单顺式、双顺式异构体的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种玉米黄质单顺式、双顺式异构体的检测方法，属于分析【技术领域】。将全反式玉米黄质光碘异构化反应制得单顺式、双顺式异构体，采用YMCCarotenoid?C30色谱柱，流动相为甲醇/甲基叔丁基醚/水＝80/15/5和甲醇/甲基叔丁基醚＝1/10，流速为1.0mL/min，柱温为25℃，紫外检测波长为450nm，进样量20μL，显著分离玉米黄质单顺式、双顺式异构体，离子源APCI+，色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μL/min，扫描范围80-1000m/z，毛细管电压2500V，干燥气体5L，雾化气体20psi，汽化温度300℃，蒸汽温度400℃，电晕电流4μA。根据样品的保留时间、色谱图和光谱图进行定性分析，根据峰面积进行定量分析。该方法的优点在于灵敏度高、重现性好、回收率高，适用于玉米黄质全反式、单顺式及双顺式异构体的定性和定量分析。
【专利说明】玉米黄质单顺式、双顺式异构体的检测方法 一、
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种玉米黄质单顺式、双顺式异构体的检测方法，属于液相色谱分析
【技术领域】。 二、
【背景技术】
[0002] 玉米黄质又称玉米黄素，是一种油溶性天然色素，广泛存在于绿色叶类蔬菜、花 卉、水果、枸杞和黄玉米中。玉米黄质化学结构中有11个共轭双键，并且尾端基团上带有羟 基，这种特定结构使它具有较强淬灭单线态氧、清除氧自由基的能力，可以有效预防和减少 人体视网膜的氧化损伤，对眼睛起到保护作用。另外，玉米黄质在减少心血管疾病发病率、 增强免疫功能和减少癌症的发生和发展等方面具有显著的生理功效。
[0003] 自然界中的玉米黄质主要是全反式结构，由于分子中存在不饱和双键，其在光照、 加热和加工等条件下容易发生顺式异构化反应。玉米黄质全反式构象的稳定性和生理活性 最强，顺式结构在物化性质和生理功能上与全反式构象相比变化较大，限制了玉米黄质在 医学和食品中的应用。建立一种准确、高效的玉米黄质单顺式、双顺式异构体的检测方法 可以监测玉米黄质在不同反应条件及不同食品基质中的异构化反应，辅助研究其异构化机 理，利于提出控制玉米黄质稳定性的有效措施。
[0004] 液质联用HPLC-MS技术是类胡萝卜素分析中主要的技术手段，其结合了液相色谱 高效的分离化合物能力与质谱极强的组分鉴定能力，能够使类胡萝卜素样品的分离、定性、 定量一次完成。但实际操作中由于类胡萝卜素分子结构相似，极性相近，且在不同的基质中 变化复杂，准确分离和鉴定的难度较大。因此选择最佳的色谱条件对实现类胡萝卜素最理 想分离和鉴定至关重要。有报道分离叶黄素和α、β-胡萝卜素的顺式异构体，但未见有玉 米黄质双顺式异构体分离检测的相关报道。本发明从色谱柱的选择、流动相配比、液相梯度 条件、质谱检测等方面着手，建立一种稳定、准确的玉米黄质单顺式、双顺式异构体的检测 方法，对玉米黄质稳定性研究及生产应用具有重要意义。 三、
【发明内容】
[0005] 技术问题
[0006] 本发明的目的在于提供一种快速、准确的玉米黄质单顺式、双顺式异构体的 HPLC-MS测定方法，显著分离8种玉米黄质单顺式、双顺式异构体。该项技术可以对玉米黄 质单顺式、双顺式异构体进行准确的定性和定量分析。
[0007] 技术方案
[0008] 本发明通过碘催化-光异构化反应制备得到玉米黄质单顺式、双顺式异构体，采 用C3(|-HPLC进行分离，对流动相比例及洗脱时间进行调整，建立一种准确分离玉米黄质单 顺式、双顺式异构体的检测方法，并采用HPLC-MS联合应用技术对分离得到的化合物进行 定性和定量分析。包括以下步骤：
[0009] 1.玉米黄质单顺式、双顺式异构体的制备
[0010] 将1. 〇mg全反式玉米黄质标准品用甲醇溶解并定容于25mL棕色容量瓶，置于超低 温冰箱中待用。取6份2mL玉米黄质甲醇溶液于6支试管中，氮气吹干后分别加入2mL正 己烷和lmL碘-正己烷溶液（1. 6 μ g/mL)，使碘含量为玉米黄质质量的1 %?2%。将试管 放在距恒温摇床中日光灯l〇cm处（温度25°C，光照强度18001UX)，分别照射l、2、3、4、5h 后取出处理。用硫代硫酸钠溶液（lX103mol/L)洗涤去除多余的碘，氮气吹干后用2mL甲 醇复溶，经0. 45 μ m滤膜过滤后置于超低温冰箱中待测。
[0011] 2.色谱及质谱条件
[0012] C3(I-HPLC 分析条件：色谱柱 YMC Carotenoid C30 (4.6 X250mm，5 μ m)，二极管阵列 检测器，流动相为甲醇/甲基叔丁基醚/水=80/15/5和甲醇/甲基叔丁基醚1/10进行梯 度洗脱，流速1. OmL/min，进样量20 μ L，柱温25°C。
[0013] MS分析条件：色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10 μ L/min，离子源APCI+，扫 描范围80-1000m/z，毛细管电压2500V，干燥气体5L，雾化气体20psi，汽化温度300°C，蒸汽 温度400°C，电晕电流4μΑ。
[0014] 3.建立全反式玉米黄质标准曲线
[0015] 准确称取1. 〇mg全反式玉米黄质标准品，用甲醇溶解并定容至50mL棕色容量瓶 中，混匀，制成质量浓度为20yg/mL的标准液。分别取0. 0125、0. 075、0. 15、0. 25、0. 5、 0. 75、1. 0、1. 4、2. 0、2. 5mL标准液于5mL容量瓶中，用甲醇定容并混匀，制成质量浓度为 0. 05、0. 3、0. 6、1、2、3、4、6、8、10μ g/mL的系列标准溶液，每个系列浓度进样3次，以进样量 为横坐标、相应吸收峰面积为纵坐标进行线性回归分析，绘制全反式玉米黄质标准曲线。 [0016] 有益效果
[0017] 1.本发明在比较国内外文献的基础上，选择甲醇和甲基叔丁基醚作为洗脱溶剂 对玉米黄质单顺式、双顺式异构体进行分离。根据参照文献中流动相之间的比例及洗脱时 间进行实验，分离效果不佳，如图1中（a)、（b)和（c)所示。其中（a)和（b)流动相为甲 醇/甲基叔丁基醚/1.5 %乙酸铵水=70/25/5和甲醇/甲基叔丁基醚/1.5%乙酸铵水= 10/85/5,（c)流动相为甲醇/甲基叔丁基醚/1. 5%乙酸铵水=70/25/5和甲醇/甲基叔丁 基醚=1/10。经过多次调整，确定流动相比例为甲醇/甲基叔丁基醚/水=80/15/5和甲 醇/甲基叔丁基醚=1/10,之后又对洗脱时间进行优化，如图1中（d)和（e)所示，最终确 定本发明色谱条件，见表1。该色谱条件分离得到4种玉米黄质双顺式异构体、3种玉米黄 质单顺式异构体，与参考文献中色谱条件相比，显著提高分离度、缩短分离时间并降低最小 检测量。
[0018] 表1分离全反式玉米黄质及其异构体的流动相组成和洗脱时间
[0019]
【权利要求】
1. 玉米黄质单顺式、双顺式异构体检测方法，其特征在于： 色谱柱YMC Carotenoid C30,4.6X 250mm，粒径5 μ m，二极管阵列检测器，流动相为 甲醇/甲基叔丁基醚/水=80/15/5和甲醇/甲基叔丁基醚=1/10进行梯度洗脱，流速 1. OmL/min，进样量20 μ L，柱温25°C ;色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10 μ L/min，离 子源APCI+，扫描范围80-1000m/z，毛细管电压2500V，干燥气体5L，雾化气体20psi，汽化温 度300°C，蒸汽温度400°C，电晕电流4 μ A ;
2. 权利要求1所述玉米黄质单顺式、双顺式异构体检测方法，其特征在于在上述HPLC 条件下，13,15-双顺式-玉米黄质、9,15-双顺式-玉米黄质、9,13-双顺式-玉米黄质、 15/15' -顺式-玉米黄质、13/13' -顺式-玉米黄质、全反式玉米黄质、9,9'双顺式-玉 米黄质、9/9' -顺式-玉米黄质共8种玉米黄质单顺式、双顺式异构体得到显著分离，根据 色谱、质谱和光谱信息对8种化合物进行一一鉴定；建立了全反式玉米黄质标准曲线Y = 5. 96X-4. 79, R2 = 0. 9998,用于玉米黄质全反式、单顺式及双顺式异构体的定量分析，方法 重现性好、回收率高。
【文档编号】G01N30/88GK104090061SQ201410376891
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】张钟元, 李大婧, 肖亚冬, 刘春泉 申请人:江苏省农业科学院