专利名称：从玉米麸粉中回收叶黄素的改良方法
技术领域：
本发明涉及从玉米麸粉中回收叶黄素(又名胡萝卜醇)的改良法。使用本发明的方法，可明显改善回收的叶黄素的得率、回收效率和质量。
背景技术：
叶黄素是绿色植物(如玉米、金盏花等)和一些动物制品(最有名的是蛋黄)中存在的氧化了的类胡萝卜素化合物。叶黄素是黄色色素，可用于动物和人的食物及药品。天然饲料源中的叶黄素往往被用于家禽(尤其是鸡)及其蛋的着色。这些天然饲料源的例子包括黄玉米、玉米麸粉、金盏花粉和海藻粉。这些含叶黄素的材料在加入到鸡饲料中后，会赋予烤仔鸡以所需的健康的黄颜色或黄色调。
使用天然食物源来提供叶黄素可能导致结果的不一致，这种情况主要表现为烤仔鸡的颜色深度有差异。在许多情况下，这些天然饲料源在叶黄素的生物利用率、叶黄素含量和叶黄素稳定性方面会有很大的差异。这些问题往往导致饲料材料的化学分析(即，叶黄素的存在量)与生物性能(即，烧烤食品的显色)之间的相关性差。
已有从植物性物质(如玉米和金盏花粉)中提取叶黄素的尝试。例如，苏联专利申请No.1,819,619提供了一种从金盏花花瓣中提取类黄酮和类胡萝卜素的方法。将花瓣碾碎，然后用乙醇在70℃提取7次，每次40分钟。蒸去乙醇之后，将提取物溶解在蓖麻油中。该物质通常含来自最初的金盏花花瓣的约30重量％的类黄酮(例如，藤菊黄素、patuletrin、六羟黄酮、万寿菊甙、五羟黄酮)和约15重量％的类胡萝卜素(例如，叶黄素、rubsanthin、堆心菊脑、胡萝卜素和堇菜磺质)。该物质被用于医学用途。目前使用的大多数叶黄素工业产品来自金盏花花瓣，其结果是，相对较贵。
最近，Cook等发明的美国专利No.5,254,673(1993年10月19日)提供了一种对玉米麸粉进行处理以纯化玉米蛋白的方法。包括叶黄素在内的色素作为副产物而产生。将湿润的或略干的玉米麸质进行酶性淀粉水解、碱处理和酒精洗涤，然后用酒精提取或者将去杂味和去色的麸质分离出来。已有报道，色素在酒精洗涤步骤中被回收，该酒精洗涤步骤由以“连续的逆流方式或在各步骤中用淡酒精分批洗涤的方式”进行的洗涤而组成。关于回收的副产物色素的数量和质量则没有详细说明。
我们现在已用玉米麸粉(含约12重量％的水分)重复了Cook等的方法。用Cook等所述的方法回收的叶黄素通常像橡胶或面糊一样粘稠。而用本发明的方法回收的叶黄素则是黄颜色较强的结晶或粉状物质。而且，用Cook等的方法回收的叶黄素的得率和效率明显地比用本发明的方法回收的低。用Cook等的方法回收的叶黄素明显地必须进一步纯化(得率会由此降低)以使其能在食品中使用。而用本发明的方法制得的叶黄素不进一步纯化也可在食品中使用。
从天然源(如玉米麸粉)中高得率和高效率地回收叶黄素将是人们所希望的。从天然源(如玉米麸粉)中得到呈晶体或粉状的叶黄素将是理想的。从天然源(如玉米麸粉)中以适合在食品中使用的纯度得到叶黄素将同样是理想的。本发明的方法提供这样的叶黄素。
发明概要本发明涉及从玉米麸粉中回收叶黄素的改良法。
在一个方面(“方法I”)中，本发明涉及这样一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，在该方法中，将较干的玉米麸粉用有机醇进行提取，然后进行皂化反应，将叶黄素酯转换成叶黄素。使用本发明的此方法，可以比现有技术的方法高的得率、效率和纯度从玉米麸粉中回收叶黄素。而且，用本发明的方法回收的叶黄素是结晶、粉状固体，非常适合用于食品和药品。
在第二方面(“方法II”)中，本发明涉及这样一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，在该方法中，将含小于约30重量％的水分的玉米麸粉用已加入了抗氧化剂的有机溶剂(或有机溶剂的混合液)进行提取，将所得到的存在于提取物中可溶性部分的粗叶黄素收集起来，可将其纯化以提高最终的叶黄素产物的纯度。与本发明的方法I不同的是，本发明的方法II不使用皂化反应。此外，与本发明的方法I相比，本发明的方法II在用来从玉米麸粉中提取叶黄素以制备粗叶黄素的溶剂(或溶剂混合液)中使用了抗氧化剂，较好的是，方法II中使用的温度高于方法I中使用的温度。使用本发明的方法II，也可以比其他从玉米麸粉中回收叶黄素的方法高的得率、效率和纯度回收叶黄素。用本发明的方法II回收的叶黄素是桔黄色的或红色的糊状物，它可用于食品和药品。本发明的方法II比方法I更佳，因为其纯叶黄素的得率通常更高。
本发明的一个目的是，提供一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，该方法包括(1)将玉米麸粉干燥至含水量小于约12重量％；(2)将干的玉米麸粉用第一种醇进行提取；(3)收集来自步骤(2)的含粗叶黄素的提取物，得到粗叶黄素；(4)用含碱的第二种醇对粗叶黄素进行处理；(5)从处理过的粗叶黄素中除去第二种醇，回收精制叶黄素；(6)收集精制叶黄素(方法I)。
较好的是，将精制叶黄素用吸附色谱法或离子交换色谱法等技术进一步纯化。
本发明的另一个目的是，提供一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，该方法包括(1)将含水量小于约12重量％的玉米麸粉用第一种醇进行提取；(2)收集来自步骤(1)的含粗叶黄素的提取物，得到粗叶黄素；(3)用含碱的第二种醇对粗叶黄素进行处理；(4)从处理过的粗叶黄素中除去第二种醇，回收精制叶黄素；(5)收集精制叶黄素(方法I)。
较好的是，将精制叶黄素用吸附色谱法或离子交换色谱法等技术进一步纯化。
本发明的又一个目的是，提供一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，该方法包括(1)将含水量小于约12重量％的玉米麸粉用第一种醇进行提取；(2)收集来自步骤(1)的含粗叶黄素的提取物，得到粗叶黄素；(3)用含碱的第二种醇对粗叶黄素进行处理，将所有叶黄素酯转换成叶黄素；(4)从处理过的粗叶黄素中除去第二种醇，回收精制叶黄素；(5)用色谱法或离子交换技术将精制叶黄素纯化；(6)收集纯化过的精制叶黄素(方法I)。
本发明的再一个目的是，提供一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，该方法包括(1)将含水量小于约30重量％的玉米麸粉用含抗氧化剂的有机溶剂或有机溶剂混合液进行提取，所含抗氧化剂的量小于玉米麸粉中的叶黄素总量的约0.5重量％，有机溶剂或有机溶剂混合液与玉米麸粉之比至少约为2∶1；
(2)收集所得提取物，得到叶黄素(方法II)。
较好的是，将所得叶黄素用正相吸附色谱法等技术进行纯化。
本发明的还有一个目的是，提供一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，该方法包括(1)将含水量小于约30重量％的玉米麸粉用含抗氧化剂的有机溶剂或有机溶剂混合液进行提取，所含抗氧化剂的量小于玉米麸粉中的叶黄素总量的约0.5重量％，有机溶剂或有机溶剂混合液与玉米麸粉之比至少约为2∶1；(2)收集所得提取物，得到粗叶黄素；(3)将粗叶黄素进行纯化；(4)收集纯叶黄素(方法II)。
本发明的再有一个目的是，提供一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，该方法包括(1)将玉米麸粉试样干燥至含水量小于约30重量％；(2)往有机溶剂或有机溶剂混合液中加入抗氧化剂，加入的抗氧化剂的量小于玉米麸粉试样中的叶黄素总量的约0.5重量％；(3)将玉米麸粉试样用有机溶剂或有机溶剂混合液进行提取，提取方法为，将至少约2份的有机溶剂或有机溶剂混合液与1份玉米麸粉在约10℃至80℃混合约10分钟至90分钟；(4)收集所得提取物，得到粗叶黄素；(5)对粗叶黄素进行纯化；(6)收集纯叶黄素(方法II)。
通过下面的本发明的附图和较佳实施方式的说明，本发明的这些和其他目的和优点将会变得明白。
图面的简单说明
图1是本发明的方法I的较佳实施方式的方块图。
图2是本发明方法I的从玉米麸粉中提取叶黄素的效率与提取所用的乙醇中的含水量的函数关系图；图3是本发明方法I的从玉米麸粉中提取叶黄素的效率与提取温度的函数关系图；图4是本发明方法I的从玉米麸粉中提取叶黄素的效率与在25℃的提取时间的函数关系图5和5A是本发明的方法II的二个较佳实施方式的方块图。
较佳实施方式的描述本发明通过从玉米麸粉中回收叶黄素的改良法。
本发明的方法I提供这样一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，在该方法中，将较干的玉米麸粉用有机醇进行提取，然后进行皂化反应，将叶黄素酯转换成叶黄素。本发明的方法II提供这样一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，在该方法中，将较干的玉米麸粉用含抗氧化剂的有机溶剂进行提取，也可任选地将所得叶黄素产物纯化以得到纯的叶黄素产物。当使用正相吸附色谱法作为任选的纯化步骤中的纯化方法时，应将收集提取物而得到的“粗的叶黄素”产物中的蛋白质除去，使其转换成“精制叶黄素”产物。然后，可将所得“精制叶黄素”产物纯化，得到纯的叶黄素产物。
使用本发明的方法I和方法II，可以比现有技术的方法高的得率、效率和纯度从玉米麸粉中回收叶黄素。而且，用本发明的方法I回收的叶黄素是结晶、粉状固体形式的，用本发明的方法II回收的叶黄素是桔黄色的或红色的糊状形式的，它们均非常适合用于食品和药品。
实践中，用于本发明的方法I和方法II的含叶黄素的来源物是玉米麸粉。玉米麸粉是工业玉米湿磨法的初级副产物。本发明的方法I和方法II中所用的玉米麸粉应较干。“较干”一词是指在本发明的方法I中，玉米麸粉的含水量小于约12重量％，更好的是小于约10重量％，在本发明的方法II中，玉米麸粉的含水量小于约30重量％，较好的是小于约20重量％，更好的是小于12重量％。若在本发明的方法I和方法II中使用湿的玉米麸粉(即，在本发明的方法I中，玉米麸粉的含水量超过约12重量％，在本发明的方法II中，玉米麸粉的含水量超过约30重量％，或往玉米麸粉中加入显著量的水)，则用这二个方法提取叶黄素的效率会明显下降。而且，所得到的叶黄素会像橡胶一样粘稠。可用本领域技术人员已知的常用方法将玉米麸粉干燥至所需的含水量。通常，干燥过的玉米麸粉每磅含约100-200mg叶黄素。
本发明的方法I和方法II中所用的试剂和设备均可从市场上购得。这些试剂和设备的供应商包括Aldrich Chemical公司(密执安州Milwaukee市)、FisherScientific公司(宾夕法尼亚州Pittsburgh市)、Glitsh公司(得克萨斯州Houston市)、Grown Iron Works公司(明尼苏达州Minneapolis市)、Ace Glass公司(新泽西州Vineland市)、Millipore公司(麻萨诸塞州Bedford市)和PCI MembraneSystems公司(英国Hampshire郡Whitchurch市)。方法I在本发明方法I的第一个主要步骤中，将较干的玉米麸粉用叶黄素可微溶于其中的醇进行提取。合适的醇包括甲醇、乙醇、异丙醇和丁醇。较好的是，在溶剂提取法中使用乙醇(工业用或无水)和/或甲醇。较好的是，所用醇的含水量小于约20重量％，更好的是小于约10重量％；当乙醇溶剂的含水量超过约20重量％时，提取效率会下降(参见图2)。通常，玉米麸粉与提取用醇溶剂之比约为1∶2。通常，所用溶剂的量必须足以形成料浆。通常，提取在环境温度(即，约20-30℃)用常用的溶剂提取技术进行。应避免使温度超过约40℃，否则，提取效率会急剧下降(参见图3)。特别优选的提取技术包括连续提取法、逆流提取法、并流提取法、离心提取法等。先将含叶黄素的提取物(或合并的提取物)过滤以除去不溶物质，较好的是，接着除去溶剂。可使用常用的除溶剂的技术如蒸馏法、真空蒸馏法、喷雾法、旋转蒸发法等。除溶剂(若进行的话)不必完全，因为在皂化步骤中也使用溶剂。实际上，在皂化步骤之前除去溶剂不是必需的(虽然是较佳的)。在方法I该阶段的叶黄素提取物通常每磅含约800-1200mg叶黄素。这表明，与初始的玉米麸粉相比，浓缩系数约为7-8。
在本发明的方法I的第二个主要步骤中，将叶黄素提取物与醇碱在皂化反应中反应，以将叶黄素酯转换成游离的叶黄素，从而提高叶黄素的回收率和回收效率。这步转化是常规的皂化反应。虽然可使用各种醇碱，但通常优选乙醇碱。通常，在整个过程中最好使用与第一提取步骤中所用的相同的醇。合适的碱包括氢氧化碱金属，如氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾。氢氧化钾乙醇溶液是最优选的皂化反应物。皂化最好通过将叶黄素提取物在醇碱中回流约1-2小时来进行。用另外的醇(较好的是乙醇)洗涤、过滤和除溶剂之后，回收精制叶黄素。
由本发明的方法I得到的精制叶黄素是金黄色的晶体粉末。通常每磅提取的粉末含约1600-2400mg叶黄素。这表明，与初始的玉米麸粉相比，浓缩系数约为10-15。精制叶黄素可用于各种食物原料、动物饲料和药品，或者，可以且较好的是，将它们进一步纯化。可使用常用的纯化技术。特别优选的纯化技术包括吸附色谱法和离子交换色谱法。使用溶剂混合液(较好的是己烷、丙酮、甲苯和乙醇)，可将叶黄素吸附在硅胶和/或硅藻土柱上。可将通过色谱柱的物质添加到合适的用作动物饲料的麸粉中去，也可将其舍弃；但最好将溶剂回收并重复利用。用另一种溶剂混合液(较好的是己烷、丙酮和甲醇)将纯叶黄素从色谱柱上洗脱下来。合适的色谱吸附体包括硅胶、氧化镁、氧化铝、硅藻土等。或者，可用醇类溶剂将叶黄素吸附在离子交换柱上，然后用含乙酸的醇类溶剂进行洗脱。用常用技术(如蒸馏、真空蒸馏、旋转蒸发等)除去溶剂之后，黄色晶体粉末通常每磅有望含约10,000-20,000mg叶黄素。这表明，与初始的玉米麸粉相比，浓缩系数约为50-150。可将该纯化过的叶黄素作为着色剂或添加剂用于各种食品(如人造奶油)、动物饲料(如家禽饲料)和药品。
现在看图1，图1所示的是实施本发明方法I的一个较佳方法。在提取单元14中用乙醇12提取玉米麸粉10，然后在单元16中进行过滤。玉米麸粉10必须较干(即，含水量小于约12重量％，较好的是小于约10重量％)。较好的是，提取14在或接近环境温度(即，约25-35℃)的条件下进行。提取14和过滤16之后，收集含叶黄素的滤液24并合并。可收集来自过滤单元16的固体并在单元18中干燥，得到麸粉20。可将麸粉20用于动物饲料等。视需要，可将来自干燥单元18的乙醇循环至提取单元14或皂化单元32。
然后在单元26中除去合并的滤液24中的乙醇28。除溶剂26可用常用的手段(如蒸馏法、真空蒸馏法、旋转蒸发法、降膜蒸发法等)进行。视需要，可将除去的乙醇28循环至提取单元14或皂化单元32中。除去乙醇之后，得到粗叶黄素30。然后在皂化单元32中用醇碱34(较好的是KOH乙醇溶液)处理粗叶黄素30。皂化32将可能存在于粗叶黄素28中的叶黄素酯转换成游离的叶黄素，从而可提高叶黄素的总回收率和回收效率。用乙醇洗涤和过滤36之后，回收精制叶黄素38。视需要，可将从洗涤和过滤步骤36中除去的乙醇40循环至提取单元14或皂化单元32。
精制叶黄素38可以此形式使用，也可进一步纯化。通常，最好将精制叶黄素38进一步纯化。因此，通常最好用例如含乙醇的溶剂将精制叶黄素38在色谱或阳离子交换柱42中进一步纯化。叶黄素吸附在柱材料上，然后用第二溶剂洗脱。接着，除去洗脱下来的叶黄素中的溶剂，得到纯的叶黄素46。可将其他通过色谱柱而未被吸附的物质48(例如蛋白质、淀粉和脂肪酸)添加到用作动物饲料的麸粉30中去，或者可舍弃。纯的叶黄素产物46是金黄色的晶体粉末，可方便地掺入食品(尤其是禽类饲料产品)中。
下面给出本发明的方法I的实施例以举例说明，但这些实施例不是对本发明的方法I的限定。在这些实施例中，叶黄素含量是用法定方法970.64(Associationof Official Analytical Chemists1990年第15版)测得的。实施例1本实施例举例说明图1所示的本发明的实施。将干燥过的玉米麸粉(100g，含水量小于12重量％)与变性乙醇(200g，含0.4重量％的水)在烧瓶中混合。溶剂/麸粉之比约为2∶1。玉米麸粉每磅含约160mg叶黄素。剧烈搅拌料浆混合物使其在约35℃保持悬浮状态约30分钟。然后将该混合物过滤，收集滤液。收集到约95g干麸粉，它可用作动物饲料。用旋转蒸发器将滤液中的乙醇除去之后，作为提取物，收集到5g固体物质。该含叶黄素的固体物质(即，粗叶黄素)每磅含约1150mg叶黄素。这相当于从每磅初始的玉米麸粉中回收到约58mg叶黄素，回收率约为36％。
然后将粗叶黄素(5g)与约5gKOH乙醇溶液(约40gKOH在约100ml乙醇中)回流约1小时。接着用乙醇(50ml)洗涤反应混合物并过滤。用旋转蒸发器除去滤液中的乙醇，得到约4g固体物质(即，精制叶黄素)，该固体提取物每磅约含2100mg叶黄素。这相当于从每磅初始的玉米麸粉中回收到约76mg叶黄素，回收率约为47％。
该精制叶黄素产物是金黄色的晶体粉末。它可方便地掺入到食品原料和动物饲料中。实施例2基本上重复实施例1的方法，所不同的是，对第一次提取中所用的乙醇中的含水量进行了变化；玉米麸粉起始物质的量约为100g。得到以下结果
该数据图示在图2中。如图2所示，当含水量超过约20重量％时，提取效率下降。较好的是，应将溶剂的含水量保持在小于约10重量％。实施例3重复实施例1的方法，所不同的是，将干燥过的玉米麸粉的温度在约20℃至50℃之间变化。结果见图3。如图3所示，当温度在40℃以上时，提取效率明显下降。较好的是，应将提取温度保持在约20℃至30℃之间以得到最大的提取效率。实施例4重复实施例1的方法，所不同的是，将干燥过的玉米麸粉的提取时间在约0.25-3小时之间变化。结果见图4。如图4所示，当提取时间为30分钟时，提取效率达到最大，而当提取时间超过约2小时，则提取效率呈下降趋势。因此，虽然所用的提取时间可较长(即，在约2小时以上)但它们通常不能显著提高总收率或效率。实施例5本实施例仅用于比较的目的，所举例说明的是Cook等在美国专利No.5,254,673中所述的从玉米麸粉中回收叶黄素的方法。以Cook等的实施例1作为引导。用去离子水(510ml)和玉米麸粉(120g，与实施例1中所用的相同)制备料浆。将该料浆加热至80℃并用3N氢氧化钠将pH调节至约6.4。搅拌下往料浆中加入α-淀粉酶(0.5ml)。继续消化1小时，将料浆冷却至50℃。以1200×g将料浆离心10分钟，除去上清液。将固体悬浮在等份的80℃水中，再以1200×g进行离心。用1M碳酸钠和1M碳酸氢钠将pH调节至9，在20℃对除去淀粉的固体进行处理。将所得的料浆在80℃加热1小时，然后冷却至50℃。以1200×g将料浆离心20分钟，除去上清液。将固体悬浮在等份的水中，用3N盐酸中和。再用等份的水以1200×g将固体离心二次。然后将该固体用2份量的乙醇(4重量％水)在室温提取30分钟并过滤。通过旋转蒸发除去溶剂。回收的固体是黄色的糊状或橡胶状物质，每磅约含141mg叶黄素。由此，提取物中叶黄素的浓度与初始的玉米麸粉中的浓度基本相同(即，每磅玉米麸粉160mg叶黄素)；换言之，Cook等的麸粉并未产生使提取物中的叶黄素浓缩的效果。叶黄素的总回收率约为22％。对本实施例进行了重复，得到了基本相同的结果。由于提取物较粘稠和色素含量较低，因此，该含叶黄素的提取物不能方便地用于包括禽类饲料在内的食物组合物。方法II本发明的方法II使用以含抗氧化剂的有机溶剂(或有机溶剂的混合液)提取含水量小于约30重量％(较好的是小于约20重量％，更好的是小于约12重量％，最好小于10重量％)的玉米麸粉的一般步骤，得到“粗叶黄素”，然后，较好的是，将“粗叶黄素”纯化，得到纯的叶黄素。
当纯化由提取物得到的“粗叶黄素”时和当所用的纯化方法是正相吸附色谱法(它是优选的纯化方法)时，应在该纯化步骤之前进行从含“粗叶黄素”的提取物中除去蛋白质的附加步骤。该除去蛋白质的步骤可采用沉淀法、膜滤法或本领域技术人员已知的其他同类方法。然后可将“精制叶黄素”纯化，并将纯的叶黄素产物收集起来，所采用的收集方法可以与此处就使用其他纯化法的方法II而所述的方式相同。该除去蛋白质的步骤应仅在采用正相吸附色谱法来纯化提取物中所含的“粗叶黄素”时进行，而无需在用其他纯化法来纯化提取物中所含的“粗叶黄素”时进行。(1)提取制得玉米麸粉试样，若玉米麸粉的含水量大于约30重量％，较好的是，以与前面就本发明的方法I所述的相同的方式将其干燥至小于20重量％，更好的是小于约12重量％，最好小于约10重量％。
然后往有机溶剂或有机溶剂的混合液中加入抗氧化剂，其添加量小于被提取的玉米麸粉中的总叶黄素的约0.5重量％，较好的是小于约0.1重量％。被提取的玉米麸粉中的总叶黄素可用前面所述的法定方法970.64或下述的改良方法测得。
抗氧化剂可减少叶黄素的氧化性降解并可使提取在较高的温度(通常在约10-80℃之间，较好的是在约50-70℃之间，最好是约50℃)进行。添加抗氧化剂和提高提取温度已被证明能将最终提取物中的叶黄素得率提高至86％。
较好的是，使用饲料级或食品级抗氧化剂，如乙氧喹(6-乙氧基-1，2-二氢-2，2，4-三甲基喹啉)、棓酸丙酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、叔丁基对苯二酚、生育酚等。
与本发明的方法I相同，合适的溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和辛醇。优选乙醇或乙醇-己烷混合液。此外，与本发明的方法I相同，较好的是，溶剂(和本发明方法II中使用的所有其他试剂)的含水量小于约20重量％，更好的是小于约10重量％，因为当溶剂的含水量超过约20重量％时，提取效率会下降。通常，溶剂的量必须足以形成料浆。
然后，用含抗氧化剂的有机溶剂(或有机溶剂混合液)以溶剂与玉米麸粉之重量比至少约为2∶1(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1等)提取干燥过的玉米麸粉，通常所采用的方法是，例如在剧烈搅拌下将玉米麸粉与含抗氧化剂的溶剂在10-80℃之间混合约10-90分钟。通常，有机溶剂的量应足以形成料浆，因此，有机溶剂与玉米麸粉之比应不低于约2∶1。玉米麸粉可用逆流提取法、并流提取法、连续提取法、离心提取法和本领域技术人员已知的其他方法提取。在本发明的方法II中，最优选的提取方法是逆流提取法。
与本发明的方法中I应避免温度超过约40℃不同的是，在本发明的方法II的提取步骤中，所用的温度最好在约49℃以上。
在本发明方法II的该阶段(未进行纯化)的叶黄素提取物每磅通常含约500-2,000mg叶黄素。这表明，与初始的玉米麸粉相比，浓缩系数约为5-20。
如下面的实施例1所示，以3∶1的溶剂与玉米麸粉之比使用工业用乙醇在50℃进行提取，所得到的干燥过的提取物每磅含799mg叶黄素(未纯化)。
如下面的实施例2所示，用20∶80的己烷/乙醇混合液得到的干燥过的提取物每磅含1140mg叶黄素(未纯化)。
如下面的实施例4所示，用40∶60的己烷/乙醇混合液得到的纯化和干燥过的提取物每磅含1410mg叶黄素(未纯化)。
提取可用一个步骤进行，或者，可与下面的实施例5同样，所采用的提取方法是，通过一系列单独的、含抗氧化剂的有机溶剂(或有机溶剂混合液)被分成2份、3份、4份或多份的提取进行。在后一种情况下，玉米麸粉可用那些份溶剂中的每一份分别提取，其方式就如同仅一个这样的提取在进行一样。在这些单独的提取均分别进行之后，合并含叶黄素的提取物。较好的提取方法是，通过一系列单独的提取进行，因为该方法与逆流提取相似，能得到较高的粗叶黄素的得率。
混合完毕之后，收集含叶黄素的提取物(或由用分成多份的含抗氧化剂的溶剂或溶剂混合液进行的一系列单独的提取得到的提取物的合并物)，所用的方法例如是，将提取物过滤，从提取物中除去不溶性物质，得到“粗叶黄素”。或者，可用离心法、水力旋流法或本领域技术人员已知的其他类似方法进行。所得到的提取物含“粗叶黄素”，它可以此形式用于各种食物原料、动物饲料和药品，也可并较好的是将其纯化。
如实施例6所示，可用例如旋转蒸发的方法将提取物干燥，然后，在纯化之前，将干燥过的提取物用相同的或不同的有机溶剂(或有机溶剂混合液)再提取一或多次。(2)纯化(a)除去蛋白质从含“粗叶黄素”的提取物中除去蛋白质的操作应仅在使用正相吸附色谱法作为纯化由提取得到的“粗叶黄素”产物的方法时进行。这是纯化由提取得到的叶黄素产物的优选方法。可使用的其他纯化方法〔如分配(反相)吸附色谱法、离子交换色谱法、体积排除色谱法和逆流色谱法〕则不需要此步骤。
蛋白质占含“粗叶黄素”玉米麸粉提取物的主要部分。在用正相色谱法进行纯化之前，用本领域技术人员已知的采用技术(如蒸馏法、真空蒸馏法、喷雾法、旋转蒸发法等)除去有机溶剂，将提取物溶解在非极性溶剂(如己烷)中。由于蛋白质不溶于己烷，它可能阻塞色谱柱，从而干扰叶黄素纯化。
可使用包括沉淀法和膜滤法在内的多种除蛋白质的方法。
沉淀蛋白质的方法可以是，往提取物中加入硫酸铵等试剂，把蛋白质从溶液中逼出。例如，加入蛋白质不溶于其中的溶剂(如丙酮、乙酸乙酯等)可将蛋白质逼出使其沉淀。将提取物浓缩(即，在将蛋白质沉淀之前除去部分有机溶剂)不是必需的，但可以做。然后通过例如过滤或本领域技术人员已知的其他方法(如离心法或水力旋流法)将形成的主要由蛋白质组成的沉淀物除去。所得的可溶性部分的提取物含“精制叶黄素”。可使用本领域技术人员已知的常用技术(如蒸馏法、真空蒸馏法、喷雾法、旋转蒸发法等)将滤液干燥。然而，在纯化步骤之前将滤液干燥不是必需的。
也可用膜将蛋白质与提取物中的其他成分分离。用凝胶电泳测得的该蛋白质的分子量范围在20,000-25,000道尔顿之间。可用来将叶黄素(分子量为568.85)等分子量较低的成分与蛋白质等分子量较大的成分分离的膜市场上有售。Millepore公司和PCI Membrane Systems公司等厂家生产分子量截止值为20,000以下的膜。在这样的系统中，用泵将有机溶剂送过膜系统，蛋白质仍留在浓缩液中，而叶黄素及甘油三酯和脂肪酸则将进入渗透液中。然后用惯用的汽提法将有机溶剂从渗透液中除去，用正相吸附色谱法对渗透液进行分离。(b)纯化然后，可将前述提取物中所含的“粗叶黄素”(当使用正相吸附色谱法以外的纯化方法纯化“粗叶黄素”产物时)或前述除去蛋白质步骤之后得到的“精制叶黄素”产物(当使用正相吸附色谱法纯化提取物中所含的“粗叶黄素”产物时)纯化。
“精制叶黄素”可用正相吸附色谱法纯化，而“粗叶黄素”可用分配(反相)吸附色谱法、离子交换色谱法、体积排除色谱法、逆流色谱法等本领域技术人员已知的方法极性纯化。
正相吸附色谱法在下列文献中有描述K.Robards等，Principles and Practiceof Mordern Chromatographic Methods，Academic Press出版(1995)；R.P.W.Scott，Techniques and Practices of Chromatography，Marcel Dekker出版，New York(1995)；L.R.Snyder等，Introduction to Mordern LiquidChromatography(第2版)，John Wiley and Sons公司出版，New York(1979)；和K.K.Unger，Packing and Stationary Phases in Chromatographic Techniques，Marcel Dekker公司出版，New York(1990)。
分配(反相)色谱法在下列文献中有描述El Rassi等，“Reversed Phase andHydrophobic Interaction Chromatography of Peptides and Proteins”，在SeparationProcesses in Biotechnology中，Marcel Dekker公司出版(1990)；和K.K.Unger，Packing and Stationary Phases in Chromatographic Techniques，Marcel Dekker公司出版，New York(1990)。
离子交换色谱法在下列文献中有描述Charles D.Shuey，“Ion ExchangeProcesses”，在Separation Processes in Biotechnology中，Marcel Dekker公司出版(1990)；H.Small，Ion Chromatography，Plenum Press出版(1989)；K.K.Unger，Packing and Siationary Phases in Chromatographic Techniques，Marcel Dekker公司出版，New York(1990)；和Phillip C.Wankat，“Large Scale Chromatography”，在Handbook of Separation Process Technology，John Wiley and Sons公司出版，NwYork(1987)。
体积排除色谱法在K.K.Unger，Packing and Stationary Phases inChromatographic Techniques，Marcel Dekker公司出版，New York(1990)中有描述。
逆流色谱法在Walter D.Conway等，Modern Countercurrent Chromatography，American Chemical Society出版，Wshington，D.C.(1995)中有描述。
上述关于色谱法的文献的全部内容均在此处引作参考。
对于作为优选的纯化方法的正相吸附色谱法而言，可使用的合适吸附剂(固定相)包括硅胶、氧化镁、氧化铝、纤维素、蔗糖、淀粉、氧化钙、磷酸钙、碳酸钙、碳酸钾、碳酸钠等，也可使用这些吸附剂的混合物，如硅胶与氧化铝的混合物即是一个较佳的吸附剂。
已成功地以低至2∶1和高至100∶1的吸附剂对“精制叶黄素”之干重比对“精制叶黄素”进行了纯化。因此，这样的吸附剂对“精制叶黄素”之干重比可在约2∶1至100∶1之间。较好的是，吸附剂对“精制叶黄素”之干重比为2∶1。
将“精制叶黄素”吸附在固定相上。视需要，可在吸附至柱床之前将它们加溶在小量的洗脱溶剂(移动相)中。然后用有机溶剂或二种或多种有机溶剂的混合液对色谱柱进行洗脱，以将纯化过的叶黄素产物从柱上洗脱下来。
可以用等溶剂(即，在整个洗脱过程中，使用同一溶剂或溶剂混合液)洗脱色谱柱，也可以使用梯度洗脱液或阶式梯度洗脱液(即，溶剂或溶剂混合液组分在洗脱过程中变化)。
在使用等溶剂系统时，用有机溶剂或有机溶剂混合液洗脱色谱柱。根据使用的溶剂，非极性溶剂或溶剂混合液(如己烷、环己烷、庚烷、石油醚等)可占溶剂或溶剂混合液的100％至50％。但可以用0-50％的极性较大的溶剂或溶剂混合液(如乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇等)进行调整。可能需要5-200柱体积的移动相来洗脱色谱柱，合适的量可由本领域技术人员确定。
收集从色谱柱洗脱下来的流分。可将含甘油三酯和脂肪酸的流分加回到提取过的玉米麸粉中去。并可将叶黄素酯流分与游离叶黄素流分合并，或者皂化，然后与游离叶黄素流分合并。游离叶黄素流分可用作家禽饲料增补剂，或者可进一步纯化。若收集蛋白质流分，则也可将其加回到提取过的玉米麸粉中去。
或者，可用梯度或阶式梯度溶剂系统洗脱色谱柱。在“精制叶黄素”吸附在固定相之后，用有机溶剂或有机溶剂混合液洗脱色谱柱。移动相的组分会随着时间而连续地或阶式地变化，使移动相极性增大。例如，初始的移动相会是100％至50％的非极性溶剂或溶剂混合液(包括己烷、环己烷、庚烷、石油醚等溶剂)。然后用0-50％的极性较大的溶剂或溶剂混合液(包括乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇等)进行调整。然后用本领域技术人员已知的方式以一给定的速率或以阶式增加极性较大的溶剂或溶剂混合液的百分比。可将一种或多种极性较大的溶剂或溶剂混合液的百分比增加到占移动相的0％或100％，或者其间的任何数值。可能需要5-200倍的移动相来洗脱色谱柱，合适的量可由本领域技术人员确定。
例如，可用体积比为97/3的己烷/丙酮将“精制叶黄素”混合物吸附在硅胶柱上。用该溶剂混合液将甘油三酯、胡萝卜素和叶黄素酯从色谱柱上洗脱下来，但游离的“精制叶黄素”仍吸附在色谱柱上。可用极性较大的溶剂混合液(如己烷/丙酮体积比在94/6至0/100之间的溶剂混合液)将纯化过的叶黄素从色谱柱上洗脱下来。
然后可用前述的和/或本领域技术人员已知的任一种方法将纯的游离叶黄素流分干燥，接着用前述法定方法970.64或下面所述的该方法的改进法算出干燥的流分中的纯的叶黄素的浓度。
不管使用的是何种纯化方法，可用色谱法作进一步的纯化，以提高最终的纯的叶黄素产物的纯度。该附加的色谱法所使用的色谱柱可包括如前面所述的正相吸附剂，反相吸附剂，如键合吸附剂十八烷基硅烷(C18)、辛基硅烷(C8)、丁基硅烷(C4)、氰基丙基硅烷(CN)、氨基丙基硅烷(NH2)等。可与反相吸附剂一起使用的溶剂包括水、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、己烷等。也可其他色谱法(如离子交换色谱法、体积排除色谱法、分配色谱法和逆流色谱法)以提高叶黄素产物的纯度。
由本发明的方法II得到的纯的叶黄素产物是桔黄色或红色糊状物。通常每磅纯的产物有望含约5,000-60,000mg叶黄素。这表明，与初始的玉米麸粉中的叶黄素浓度(每磅麸粉约100-200mg叶黄素)相比，浓缩系数高达约600。可以前面就本发明的方法I所述的方式使用该纯的叶黄素产物。
现在看图5，图5是本发明的方法II的一个较佳实施方式的方块图。
在提取单元214中，用含相当于玉米麸粉中的叶黄素总量的约0.1重量％的抗氧化剂乙氧喹的乙醇212提取玉米麸粉210。然后收集所得提取物，在滤器单元216中，从该提取物中滤去不溶物215，得到滤液224。玉米麸粉210应较干(即，含水量小于约30重量％，较好的是，小于约20重量％，更好的是，小于约12重量％，最好小于约10重量％)。较好的是，提取214在约50℃进行。
滤液224中的粗叶黄素可直接使用，或者可进一步纯化。通常，宜将粗叶黄素进一步纯化246。通常宜用例如含乙醇的溶剂将粗叶黄素在色谱柱中进一步纯化，以得到纯的叶黄素250。可使叶黄素吸附到吸附剂上，然后用第二溶剂进行洗脱，得到纯的叶黄素250。可将其他通过色谱柱而未被吸附的物质248(如蛋白质、淀粉和脂肪酸)添加到用作动物饲料的麸粉中去，也可将其舍弃。纯的叶黄素产物250是桔黄色或红色的糊状物，可方便地掺入食物产品(尤其是家禽饲料产品)中。例如，可将其溶解在固体或液体载体(如水)中，喷雾干燥成产品并用本领域技术人员已知的方法进行混合。
现在看图5A，图5A是是本发明的方法II的另一个较佳实施方式的方块图。
在提取单元114中，用含相当于玉米麸粉中的叶黄素总量的约0.1重量％的抗氧化剂乙氧喹的乙醇112提取玉米麸粉110。然后收集所得提取物，在滤器单元116中，从该提取物中滤去不溶物115。如前面就图5所述，玉米麸粉110应较干。较好的是，提取114在约50℃进行。
在上述提取和过滤之后，较好的是，接着，在单元126中将滤液124中的乙醇128除去。除溶剂可以前面就本发明方法I所述的方式进行。除去乙醇128之后，得到含“粗叶黄素”的提取物130。
粗叶黄素可直接使用，或者可进一步纯化。通常，宜将粗叶黄素130进一步纯化。因此，通常宜用例如含乙醇的溶剂将粗叶黄素在色谱柱中进一步纯化。可使叶黄素吸附到吸附剂上，然后用第二溶剂进行洗脱。然后除去洗脱下来的叶黄素中的溶剂，得到纯的叶黄素。可将其他通过色谱柱而未被吸附的物质(如蛋白质、淀粉和脂肪酸)添加到用作动物饲料的麸粉中去，也可将其舍弃。
接着，较好的是，在减容单元132中用旋转蒸发器或其他类似的装置将含“粗叶黄素”的提取物减少至总固体浓度在约10-40重量％之间。
然后，宜以溶剂/提取物为1/1的重量比将第二有机溶剂(它最好是乙酸乙酯134)加入到含“粗叶黄素”的提取物中。较好的是，在剧烈搅拌下，将提取物在25℃与溶剂混合30秒钟。
然后在滤器单元136中除去在上面的步骤中形成的主要由蛋白质组成的沉淀物140。残留的提取物的可溶性部分含“精制叶黄素”138。
然后，宜在旋转蒸发单元142中从含精制叶黄素138的提取物的可溶性部分中除去溶剂乙酸乙酯144。
用1/1的硅胶/氧化镁作为吸附剂，用己烷作为有机溶剂，使精制叶黄素138吸附在色谱柱上，以乙醇作为第二溶剂，将纯的精制叶黄素150从色谱柱上洗脱下来，由此通过正相吸附色谱法将精制叶黄素138进一步纯化。可将其他通过色谱柱而未被吸附的物质148(如蛋白质、淀粉、脂肪酸和甘油三酯)添加到动物饲料中，也可将其舍弃。纯的精制叶黄素产物150是桔黄色或红色的糊状物，可以前面就图5所述的方式方便地掺入食物产品(尤其是家禽饲料产品)中。
给出下面的实施例是为了举例说明而不是限定本发明的方法II。与前面就本发明的方法I给出的实施例一样，在本发明方法II的实施例中所述的不同步骤中的叶黄素含量均是用前述法定方法970.64测得的。然而，在本发明的方法II的实施例中，用VWR变性酒精(Fisher Scientific公司产品目录第VW0475-3号)代替提取剂中的无水乙醇。该配方(下面将描述)系通过比较研究进行确定，以提供同等的结果。
配方SDI酒精100体积甲基·异丁基酮 1体积乙酸乙酯 1体积烃类溶剂 1体积此外，用97/3的己烷/丙酮代替96/4的己烷/丙酮作为胡萝卜素的洗脱液，因为发现97/3的己烷/丙酮可使最前面的叶黄素条带(单羟基色素)更好的分离。最后，在读取所产生的叶黄素溶液的等分试样的吸收度之前，将该等分试样进行离心。业已发现，净化溶液可提高分析的精度。实施例1搅拌下，在50℃用300g含抗氧化剂乙氧喹的乙醇提取含小于12重量％的水和含170mg叶黄素的玉米麸粉(100g)30分钟。通过真空过滤回收玉米麸粉，然后用相同方式再提取2次。所用乙氧喹的总量相当于用前述法定方法970.64测得的玉米麸粉中的叶黄素量的0.1％。将三份提取物合并，通过旋转蒸发进行干燥。用前述法定方法970.64测得的干提取物中的叶黄素浓度为799mg/磅(未进一步纯化)，与初始(起始)的玉米麸粉中的叶黄素的量相比，浓度提高了约5倍。实施例2搅拌下，在60℃用200g含抗氧化剂乙氧喹的20/80的己烷/乙醇提取含小于12重量％的水和含170mg叶黄素的玉米麸粉(100g)30分钟。通过真空过滤回收玉米麸粉，然后用相同方式再提取2次。所用乙氧喹的总量相当于用前述法定方法970.64测得的玉米麸粉中的叶黄素量的0.1％。将三份提取物合并，通过旋转蒸发进行干燥。用前述法定方法970.64测得的干提取物中的叶黄素浓度为1140mg/磅(未进一步纯化)，与初始(起始)的玉米麸粉中的叶黄素的量相比，浓度提高了约7倍。实施例3搅拌下，在60℃用300g含抗氧化剂乙氧喹的乙醇提取含20重量％的水和含170mg叶黄素的玉米麸粉(100g)30分钟。通过真空过滤回收玉米麸粉，然后用相同方式再提取2次。所用乙氧喹的总量相当于用前述法定方法970.64测得的玉米麸粉中的叶黄素量的0.1％。将三份提取物合并，通过旋转蒸发进行干燥。用前述法定方法970.64测得的干提取物中的叶黄素浓度为549mg/磅(未进一步纯化)，与初始(起始)的玉米麸粉中的叶黄素的量相比，浓度提高了约3倍。实施例4搅拌下，在60℃用200g含抗氧化剂乙氧喹的40/60的己烷/乙醇提取含小于12重量％的水和含170mg叶黄素的玉米麸粉(100g)30分钟。通过真空过滤回收玉米麸粉，然后用相同方式再提取2次。所用乙氧喹的总量相当于用前述法定方法970.64测得的玉米麸粉中的叶黄素量的0.1％。将三份提取物合并，通过旋转蒸发进行干燥。用前述法定方法970.64测得的干提取物中的叶黄素浓度为1410mg/磅(未进一步纯化)，与初始(起始)的玉米麸粉中的叶黄素的量相比，浓度提高了约8倍。实施例5提取将100g干玉米麸粉(含小于12重量％水的玉米麸粉)称取到提取容器中去。
然后用前述法定方法970.64算出干玉米麸粉(以g计)中的叶黄素总量。由于玉米麸粉的叶黄素浓度为每磅170mg，因此，100g玉米麸粉含37.4mg叶黄素。加入到所用溶剂(乙醇)中的抗氧化剂乙氧喹的量为37.4mg的0.1％，即37.4μg。
在溶剂/玉米麸粉为3/1的分批提取中，将抗氧化剂在3份300g 96％乙醇(0.4重量％水)中进行分配。
将第一份300g乙醇倾入到内有干玉米麸粉的提取容器中，剧烈搅拌下在50℃提取30分钟。通过真空过滤回收提取物。
将玉米麸粉返回到提取容器中。将第二份乙醇倾倒在玉米麸粉上面，在50℃进行第二次类似的30分钟提取。通过真空过滤将提取物再一次回收。
将玉米麸粉返回到提取容器中去，以类似的方式用第三和最后一份乙醇进行提取。提取在搅拌下于50℃进行30分钟。通过真空过滤回收最后的提取物。
将上述三份提取物合并。合并后的提取物重713.4g，含16.81g总固体(固含量为2.36重量％)。(将10.0g合并的提取物试样通过旋转蒸发进行干燥，测得重0.236g。根据该值，测得合并的提取物中的总固体)。用前述法定方法970.64测得所得干重“粗叶黄素”浓度为每磅提取物含799mg(纯化之前)。除蛋白质通过旋转蒸发除去部分乙醇，这样，提取物的重量从713.74g减至156.23g。此时，浓缩物的固含量为10.8重量％。
以溶剂与浓缩物之重量比为2/1的比率往浓缩物中加入含0.004％水的乙酸乙酯，即，将312.5g的乙酸乙酯加入到浓缩物中。于是，有主要由蛋白质组成的淡黄色沉淀物形成。接着，通过真空过滤除去沉淀物。
通过旋转蒸发从滤液中除去溶剂。用前述法定方法970.64测得干燥后的滤出物每磅所含“精制叶黄素”的浓度为2150mg。正相吸附色谱法在小的玻璃色谱柱(30mm内径×60mm)中装入12g 1∶1的硅胶60(Devisil633级60A型)∶氧化镁(Fisher Scientific公司生产的hyflo super cel)。
将精制叶黄素(即，干燥后的滤出物)溶解在175g己烷(不含水)中，然后吸附在色谱柱上。
用79g己烷/丙酮(97∶3v/v，含0.02重量％水)进行洗脱，然后用100g丙酮(含0.5重量％水)进行洗脱。
将从色谱柱洗脱下来的3份流分收集起来(1)己烷流分；(2)97∶3己烷/丙酮流分；和(3)丙酮流分。
将各流分通过旋转蒸发进行干燥。测得己烷流分的干重为3.53g，用前述法定方法970.64测得的每磅固体流分的叶黄素浓度为205mg。测得97∶3己烷/丙酮流分的干重为0.85g，用前述法定方法970.64测得的每磅固体流分的叶黄素浓度为820mg。这二个流分主要含油、脂肪酸、胡萝卜素和叶黄素酯，可加回到回收的用作动物饲料的麸粉中去，也可将其舍弃。最后一个流分(即，丙酮流分)的干重为1.32g，用前述法定方法970.64测得的每磅固体流分的纯叶黄素浓度为7430mg，固体流分呈桔黄色/红色糊状。
由此，在前述过程完成之后，玉米麸粉中的叶黄素浓度从初始玉米麸粉的每磅170mg提高到纯化过的干提取物的每磅7430mg，提高了约44倍。实施例6搅拌下，在60℃用900g含抗氧化剂乙氧喹的乙醇提取含小于12重量％的水和含170mg叶黄素的玉米麸粉(300g)30分钟。通过真空过滤回收玉米麸粉，然后用相同方式再提取3次。所用乙氧喹的总量相当于用前述法定方法970.64测得的玉米麸粉中的叶黄素量的0.3％。将三份提取物合并，通过旋转蒸发进行干燥。用前述法定方法970.64测得的干提取物中的叶黄素浓度为596mg/磅(纯化之前)。
将一份干提取物(55.7g)溶解在100ml乙醇中。往提取物中加入己烷(500ml)和丙酮(100ml)，将溶液在1L分离漏斗中与300ml的10％硫酸钠水溶液进行分配。取出己烷层，用500ml己烷再提取水层2次。将三份己烷相合并并通过旋转蒸发进行干燥。用前述法定方法970.64测得叶黄素浓度为1716mg/磅。
将78g 1∶1的硅胶(Devisil633级60A型)∶氧化镁(Fisher Scientific公司生产的hyflo super cel)装入1″(内径)×25″的色谱柱中。将进样料(干重7.33g，叶黄素浓度为1716mg/磅，由上述合并的己烷相组成)溶解在246g己烷中，然后吸附到色谱柱上。接着用己烷(69g)、97∶3己烷/丙酮(515g)、70∶15∶15己烷/丙酮/甲醇(384g)和甲醇(212g)进行洗脱。称得叶黄素流分的干重为0.2g，用前述法定方法970.64测得的叶黄素浓度为30,760mg/磅，即，与初始(起始)的玉米麸粉中的叶黄素的量相比，叶黄素浓度提高了约180倍。实施例7搅拌下，在60℃用300g含抗氧化剂乙氧喹的乙醇提取含15重量％的水和含170mg叶黄素的玉米麸粉(100g)30分钟。通过真空过滤回收玉米麸粉，然后用相同方式再提取2次。所用乙氧喹的总量相当于用前述法定方法970.64测得的玉米麸粉中的叶黄素量的0.1％。将三份提取物合并，并从提取物中取出试样，通过旋转蒸发进行干燥。用前述法定方法970.64测得的干提取物中的叶黄素浓度为600mg/磅(纯化之前)。
通过旋转蒸发除去合并的提取物中的溶剂，使总固体浓度为41％(通过将10.0ml试样进行干燥而测得)。往提取物中加入乙酸乙酯(132g)，将混合物用刮勺搅拌1或2分钟。将混合物真空过滤，除去沉淀物。通过旋转蒸发将滤液干燥，用前述法定方法970.64测得其叶黄素浓度为1835mg/磅。
将9.4g 1∶1的硅胶(Devisil633级60A型)∶氧化镁(Fisher Scientific公司生产的hyflo super cel)装入32mm(内径)×30mm的色谱柱中。将进样料(干重4.7g，叶黄素浓度为1835mg/磅，由上述玉米麸粉乙醇提取物中可溶于乙酸乙酯的部分组成)溶解在5g 97∶3己烷/乙酸乙酯中，然后吸附到色谱柱上。接着用己烷(40g)、乙酸乙酯(55g)进行洗脱。称得叶黄素流分的干重为0.9g，用前述法定方法970.64测得的叶黄素浓度为8,320mg/磅，即，与初始(起始)的玉米麸粉中的叶黄素的量相比，叶黄素浓度提高了约49倍。实施例8搅拌下，在60℃用900g含抗氧化剂乙氧喹的乙醇提取含小于12重量％的水和含170mg叶黄素的玉米麸粉(300g)30分钟。通过真空过滤回收玉米麸粉，然后用相同方式再提取2次。所用乙氧喹的总量相当于用前述法定方法970.64测得的玉米麸粉中的叶黄素量的0.1％。将三份提取物合并，并从提取物中取出试样，通过旋转蒸发进行干燥。用前述法定方法970.64测得的干提取物中的叶黄素浓度为470mg/磅(纯化之前)。
通过旋转蒸发除去合并的提取物中的溶剂，使其浓度为54％(通过将10.0ml试样进行干燥而测得)。往提取物(100g)中加入乙酸乙酯(400g)，将混合物用刮勺搅拌15分钟。将混合物真空过滤，除去沉淀物。通过旋转蒸发将滤液干燥，用前述法定方法970.64测得其叶黄素浓度为1518mg/磅。
将16.5g 1∶1的硅胶(Devisil633级60A型)∶氧化镁(Fisher Scientific公司生产的hyflo super cel)装入30mm(内径)×60mm的色谱柱中。将一部分干重为8.35g的干滤出物溶解在70g己烷中，然后吸附到色谱柱上。接着用己烷(90g)、97∶3己烷/乙酸乙酯(98g)、乙酸乙酯(142g)和乙醇(118g)进行洗脱。称得叶黄素流分的干重为2.32g，用前述法定方法970.64测得的叶黄素浓度为5150mg/磅。
将80.0g 1∶1的硅胶(Devisil633级60A型)∶氧化镁(Fisher Scientific公司生产的hyflo super cel)装入1″(内径)×26″的色谱柱中。将进样料(主要由一部分来自前述色谱柱的叶黄素流分组成，干重1.57g，用前述法定方法970.64测得的叶黄素浓度为5,150mg/磅)溶解在15g 96∶4己烷/异丙醇中，然后吸附到色谱柱上。接着用96∶4己烷/异丙醇(518g)、90∶10己烷/异丙醇(174g)和异丙醇(174g)进行洗脱。称得叶黄素流分的干重为0.35g，用前述法定方法970.64测得的叶黄素浓度为9,307mg/磅，即，与初始(起始)的玉米麸粉中的叶黄素的量相比，叶黄素浓度提高了约55倍。
虽然前面用一些特征并结合其某些优选实施方式对本发明进行了描述，但本领域技术人员会明白，已描述的这些特征和实施方式可有许多不超出本发明的范围和实质的变化、改进和替换。因此，所有这些改进和变化应认为是在本文所描述和要求保护的本发明的范围之内，本发明仅受下面的权利要求书的范围的限定，对这样的权利要求书应给予合理宽的解释。
权利要求
1.一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，该方法包括(a)将含水量小于30重量％的玉米麸粉用含抗氧化剂的有机溶剂或有机溶剂混合液进行提取，所含抗氧化剂的量小于玉米麸粉中的叶黄素总量的0.5重量％，有机溶剂或有机溶剂混合液与玉米麸粉之比至少为2∶1；(b)收集所得提取物，得到叶黄素。
2.如权利要求1所述的方法，其中，玉米麸粉的含水量小于20重量％，将该玉米麸粉与有机溶剂或有机溶剂混合液在10-80℃混合10-90分钟。
3.如权利要求2所述的方法，其中，玉米麸粉的含水量小于12重量％。
4.如权利要求3所述的方法，其中，有机溶剂的含水量小于20重量％。
5.如权利要求4所述的方法，其中，有机溶剂是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、辛醇或乙醇-己烷混合液。
6.如权利要求1所述的方法，其中，抗氧化剂是乙氧喹、棓酸丙酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、叔丁基对苯二酚或生育酚。
7.如权利要求6所述的方法，其中，有机溶剂是乙醇或乙醇-己烷混合液。
8.如权利要求7所述的方法，其中，乙醇或乙醇-己烷混合液含小于10重量％的水和相当于玉米麸粉中的叶黄素的总量的0.3重量％以下的抗氧化剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中，抗氧化剂是乙氧喹。
10.如权利要求9所述的方法，其中，将玉米麸粉与乙醇或乙醇-己烷混合液在50-70℃混合。
11.如权利要求4所述的方法，其中，提取通过一连串的二个或多个单独的提取或逆流提取进行。
12.如权利要求6所述的方法，其中，提取通过一连串的二个或多个单独的提取或逆流提取进行。
13.一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，该方法包括(a)将含水量小于30重量％的玉米麸粉用含抗氧化剂的有机溶剂或有机溶剂混合液进行提取，所含抗氧化剂的量小于玉米麸粉中的叶黄素总量的0.5重量％，有机溶剂或有机溶剂混合液与玉米麸粉之比至少为2∶1；(b)收集所得提取物，得到粗叶黄素；(c)将粗叶黄素进行纯化；(d)收集纯化过的叶黄素。
14.如权利要求13所述的方法，其中，玉米麸粉的含水量小于20重量％，将该玉米麸粉与有机溶剂或有机溶剂混合液在10-80℃混合10-90分钟。
15.如权利要求14所述的方法，其中，玉米麸粉的含水量小于12重量％。
16.如权利要求15所述的方法，其中，有机溶剂的含水量小于20重量％。
17.如权利要求16所述的方法，其中，从含粗叶黄素的提取物中除去蛋白质，得到精制叶黄素，将该精制叶黄素通过正相吸附色谱法进行纯化。
18.如权利要求17所述的方法，其中，通过沉淀或膜滤除去蛋白质，色谱法中所用的吸附剂是硅胶与氧化镁的混合物，在该色谱法中，用己烷、己烷/异丙醇或异丙醇使精制叶黄素吸附在吸附剂上，用乙醇、甲醇、己烷、己烷/丙酮、丙酮、己烷/丙酮/甲醇、己烷/乙酸乙酯、乙酸乙酯或己烷/异丙醇将纯化过的叶黄素从色谱柱上洗脱下来。
19.如权利要求16所述的方法，其中，通过分配(反相)吸附色谱法、离子交换色谱法、体积排除色谱法或逆流色谱法对粗叶黄素进行纯化。
20.如权利要求17所述的方法，其中，有机溶剂是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、辛醇或乙醇-己烷混合液，抗氧化剂是乙氧喹、棓酸丙酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、叔丁基对苯二酚或生育酚。
21.如权利要求19所述的方法，其中，所述有机溶剂是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、辛醇或乙醇-己烷混合液，抗氧化剂是乙氧喹、棓酸丙酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、叔丁基对苯二酚或生育酚。
22.如权利要求20所述的方法，其中，有机溶剂是含小于10重量％的水和含相当于玉米麸粉中的叶黄素的总量的0.3重量％以下的乙氧喹的乙醇或乙醇-己烷混合液。
23.如权利要求21所述的方法，其中，有机溶剂是含小于10重量％的水和含相当于玉米麸粉中的叶黄素的总量的0.3重量％以下的乙氧喹的乙醇或乙醇-己烷混合液。
24.如权利要求22所述的方法，其中，将玉米麸粉与乙醇或乙醇-己烷混合液在50-70℃混合。
25.如权利要求23所述的方法，其中，将玉米麸粉与乙醇或乙醇-己烷混合液在50-70℃混合。
26.如权利要求24所述的方法，其中，提取通过一连串的二个或多个单独的提取或逆流提取进行。
27.如权利要求25所述的方法，其中，提取通过一连串的二个或多个单独的提取或逆流提取进行。
28.如权利要求26所述的方法，其中，将玉米麸粉与乙醇或乙醇-己烷混合液在50℃混合，通过沉淀或膜滤除去蛋白质，色谱法中所用的吸附剂是硅胶与氧化镁的混合物，在该色谱法中，用己烷、己烷/异丙醇或异丙醇使精制叶黄素吸附在所述吸附剂上，用乙醇、甲醇、己烷、己烷/丙酮、丙酮、己烷/丙酮/甲醇、己烷/乙酸乙酯、乙酸乙酯或己烷/异丙醇将纯化过的叶黄素从色谱柱上洗脱下来。
29.如权利要求27所述的方法，其中，将玉米麸粉与乙醇或乙醇-己烷混合液在50℃混合。
30.如权利要求28所述的方法，其中，用己烷使精制叶黄素吸附吸附在吸附剂上，用乙醇将纯化过的叶黄素从色谱柱上洗脱下来。
31.一种从玉米麸粉中回收叶黄素的方法，该方法包括(a)将玉米麸粉试样干燥至含水量小于30重量％；(b)往有机溶剂或有机溶剂混合液中加入抗氧化剂，加入的抗氧化剂的量小于玉米麸粉试样中的叶黄素总量的0.5重量％；(c)将玉米麸粉试样用有机溶剂或有机溶剂混合液进行提取，提取方法为，将至少约2份的有机溶剂或有机溶剂混合液与1份玉米麸粉在10-80℃混合10-90分钟；(d)收集所得提取物，得到粗叶黄素；(e)对粗叶黄素进行纯化；(f)收集纯化过的叶黄素。
全文摘要
提供改进的从玉米麸粉中回收叶黄素的方法。更具体地说,描述了通过以下步骤从玉米麸粉中回收叶黄素的方法:将较干的玉米麸粉用有机醇进行提取,然后进行皂化反应,将叶黄素酯转换成叶黄素。还描述了通过以下步骤从玉米麸粉中回收叶黄素的方法:用含抗氧化剂的第一溶剂对较干的玉米麸粉进行提取,然后可任选地将所得提取物纯化。使用这些方法,可以比现有技术的方法高的得率、效率和纯度从玉米麸粉中回收叶黄素。而且,在这些方法中回收的叶黄素产物非常适合用于食品和药品。这些物质尤其适合用于家禽饲料,会赋予烤仔鸡和卵黄以所需的健康的黄颜色或黄色调。
文档编号C07C35/00GK1242761SQ97181210
公开日2000年1月26日 申请日期1997年11月24日 优先权日1997年11月24日
发明者H·S·穆拉利达拉, T·L·科尔尼埃勒 申请人:嘉吉有限公司