免疫疗法和改良疫苗的制作方法

专利名称：免疫疗法和改良疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫疗法组合物和方法，以及改良的保护性和治疗性疫苗，还涉及用于预防性和/或治疗性诱导抗抗原免疫应答的改进方法。
背景技术：
疫苗可用于免疫个体以抵抗靶抗原，例如病原性抗原或与类疾病中涉及的细胞相关抗原。与参与人类疾病细胞相关的抗原包括癌相关性肿瘤抗原和参与自身免疫疾病的细胞相关抗原。
各种免疫接种策略总的目标都是诱导特异性的免疫应答反应，这样的应答赋予被免疫者对某给定病原的终身保护。为达此目的的一个主要难题是，由某一种病原及其引起的保护作用的相互关系会因感染性因子的变化而变化。所以，一个临床上更有效的疫苗应该诱导对其靶病原产生特异性更强的免疫应答。根据已知的保护作用与特定病原的相互关系需要设计将免疫接种策略一直“聚焦”于特定的病原。
在设计上述疫苗的过程中已经发现，能在接种个体的细胞内产生靶抗原的疫苗是能有效诱导免疫系统细胞免疫的疫苗。具体地说，减毒活疫苗、采用非致病性载体和DNA疫苗的重组疫苗都能在被接种个体的细胞内产生抗原，由此诱导免疫系统的细胞免疫。另一方面，只包含蛋白质的亚单位疫苗和死的或灭活的疫苗，诱导的只是体液应答反应，却不能诱导良好的细胞免疫应答反应。
为了治疗病原感染、癌症或自身免疫病，常常需要细胞免疫应答反应来提供抵抗病原感染的保护力和有效的免疫介导治疗。所以，较好的是能够在免疫接种个体的细胞内产生靶抗原的疫苗，例如减毒活疫苗、采用无致病性载体和DNA疫苗的重组疫苗。
核酸免疫是一种新的接种技术，它将编码某特定免疫原的DNA构建物递送给宿主。DNA疫苗除了能够同时诱导抗原特异性细胞和体液免疫应答之外，它还可能通过免疫学上重要分子的共同传递而操纵所产生的免疫应答反应。
虽然上述疫苗通过预防性或治疗性免疫接种个体常能有效地抵抗病原感染或人体疾病，但仍然需要改进的疫苗，仍然需要产生增强的免疫应答的组合物和方法。
发明概述本发明涉及基因构建物，它包含编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，所述的调节蛋白可给予正在接受预防性或治疗性接种或治疗性免疫调节疗法的个体。这些免疫调节蛋白包括人体蛋白IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和一种新的分子BL-1。
本发明涉及的基因构建物包括编码IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18或BL-1的核苷酸序列；或者编码IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18或BL-1中不少于两个的核苷酸序列。本发明希望，基因构建物能够包含同一核苷酸序列的多份拷贝。
本发明涉及个体免疫接种的方法，即通过给予个体疫苗组合物导入免疫原并联合导入基因构建物，该基因构建物包括编码一种或多种免疫调节蛋白，从而可得到增强的和/或更理想的免疫应答的核苷酸序列。而且本发明还涉及调节个体免疫应答的方法，即给予包含一个或多个免疫调节蛋白编码核苷酸序列的基因构建物。对于免疫应答的调节可以是疫苗接种程序中的一个步骤其中将疫苗组合物和促进一种免疫应答形式的免疫调节蛋白共同给予患者，然后将疫苗组合物和促进另一种免疫应答形式的免疫调节蛋白共同给予患者进行加强免疫，由此将患者的免疫应答由主要为Th1转变成Th2，或由Th2转变为Th1。
疫苗组合物最好是直接导入体内的质粒。类似地，包含一个或多个免疫调节蛋白编码核苷酸序列的基因构建物也最好是质粒。
本发明涉及一种质粒，它包含编码人IL-12蛋白质的核苷酸序列，该序列与在真核细胞中表达所必需的调控元件操作性连接，还包含编码免疫原性靶抗原的核苷酸序列，该序列与在真核细胞中表达所必需的调控元件操作性连接。在某些较好的实施方式中，所述的免疫原性靶抗原是病原性抗原、癌相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞连接的抗原。在某些实施方案中，该质粒包含一段编码单链人IL-12蛋白质的核苷酸序列，该序列与在真核细胞中表达所必需的调控元件操作性连接。单链IL-12蛋白是一种单体(single)蛋白，它由单一的编码序列编码，而且包括一个连接两亚基的接头。接头具有足够的大小和柔韧性，足以使得此单体蛋白能够折叠成原来功能性二亚基所显示的生物活性构象。
本发明涉及一种诱导个体内针对某抗原的免疫应答的方法，它包括给予个体某种质粒的步骤，所述质粒包含编码人IL-12蛋白质的核苷酸序列，该序列与在该个体的细胞内表达所必需的调控元件操作性连接，还包含编码靶抗原的核苷酸序列，该序列与在该个体的细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。在某些较好的实施方式中，靶抗原是病原性抗原、癌相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞连接的抗原。在较好的实施方案中，诱导的针对靶抗原的免疫应答为治疗感染、疾病、紊乱和某些病症(与抗抗原免疫反应所针对的蛋白有关)提供了效果，和/或，诱导产生针对病原或某些细胞的保护性免疫反应，这些细胞所含的蛋白与抗抗原产生的免疫应答有交叉反应。在有些实施方案中，人IL-12蛋白质是一种单链IL-12蛋白。
本发明涉及一种组合物，它包含多个质粒，它们集合了编码人IL-12两亚基和靶抗原的核苷酸序列，各编码序列分别与基因表达必需的调控元件操作性连接。在某些实施方案中，组合物包含两种质粒第一种质粒包含编码IL-12蛋白的核苷酸序列，它与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接；第二种质粒包含编码免疫原性靶抗原的核苷酸序列，它与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。在某些实施方案中，一个质粒包含编码免疫原性靶抗原和人IL-12一个亚基的核苷酸序列，而第二个质粒则包含编码IL-12另一亚基的核苷酸序列。在某些实施方案中，提供3种不同的质粒其一包含编码免疫原性靶蛋白的核苷酸序列，其二包含编码人IL-12的p35亚基的核苷酸序列，另一则包含编码人IL-12的p40亚基的核苷酸序列。在有些实施方案中，该组合物包含两种质粒，第一质粒包含编码单链IL-12蛋白的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接，第二质粒包含编码免疫原性靶抗原的核苷酸序列，该序列也与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。
本发明涉及在个体内诱导针对某抗原的免疫应答的方法，它包括给予个体组合物的步骤，此组合物含有多个质粒，这些质粒集合了编码人IL-12两亚基和靶抗原的核苷酸序列，各编码序列均与基因表达必需调控元件操作性连接。在某些实施方案中，两种或三种上述质粒共同包含编码人IL-12两亚基和免疫原性靶蛋白的核苷酸序列，编码蛋白质的核苷酸序列与在个体的细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。在较好的实施方案中，由靶抗原诱导的免疫应答与病原性抗原、癌相关抗原或与自身免疫病相关细胞连接的抗原发生交叉反应。本发明涉及免疫接种个体以抵抗病原、癌症或自身免疫病的方法。在较好的实施方案中，靶抗原是病原性抗原、癌相关抗原或与自身免疫病相关细胞连接的抗原。在有些实施方案中，人IL-12是单链IL-12蛋白。
本发明涉及一种质粒，它所含的核苷酸序列编码人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5h IL-10蛋白中一个或多个，所述核苷酸序列与在个体的细胞内表达所必需的调控元件操作性连接，还包含编码靶抗原的核苷酸序列，该序列与在个体的细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。在某些较好的实施方案中，免疫源性靶抗原是一种病原性抗原、癌相关抗原或与自身免疫病相关细胞连接的抗原。在某些较好的实施例中，免疫原性靶抗原是病原性抗原、癌相关抗源或与自身免疫病相关细胞连接的抗源。
本发明涉及在个体内诱导针对某抗源的免疫应答的方法，它包括给予个体一种质粒的步骤，该质粒所含核苷酸序列编码人GM-CSF、IL-12、INF-α、INF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中的一个或多个，此核酸序列与在个体细胞中表达所必需的调控元件操作性连接。它还包括给予个体编码靶抗源的核苷酸序列，该序列与在个体一细胞中表达所必需的调控元件操作性连接。在某些较佳实例中，该靶抗原是病原性抗原，癌相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞连接的抗原。在较好的实施方案中，所诱导的针对靶抗原的免疫应答为感染、疾病、紊乱和某些病症(与抗抗原免疫反应所针对的蛋白有关)提供了治疗效果，和/或，诱导产生了针对病原或某些细胞的保护性免疫应答，这些细胞所含的蛋白与所产生的针对靶抗原的免疫应答有交叉反应。
本发明涉及一种组合物，它包含多个质粒，其中包括两种质粒第一种质粒包含的核苷酸序列编码人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一个或多个，这些序列与在个体的细胞内表达所必需的调控元件操作性连接，第二质粒包含编码免疫原性靶抗原的核苷酸序列，该序列与在个体的细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。在有些实施方案中该组合物包含三种质粒，其中的第三质粒包含编码GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。在有些实施方案中，该组合物包含4种质粒，其中第3质粒包含编码人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与真核细胞表达所必须的调控元件操作性连接；以及第4质粒包含编码GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。
本发明涉及在个体内诱导针对某抗原的免疫应答的方法，它包括给予个体一种组合物，该组合物中包含多个质粒，其中包括两种质粒第一种质粒包含编码人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与基因表达所必需的调控元件操作性连接；第二种质粒包含编码免疫原性靶抗原的核苷酸序列，该序列与表达所必需的调控元件操作性连接。在较好的实施方案中，由靶抗原诱导的免疫应答与病原性抗原、癌相关抗原或与自身免疫病相关细胞连接的抗原发生交叉反应。本发明涉及免疫接种个体以抵抗病原、癌症或自身免疫病的方法。在较好的实施方案中，靶抗原是病原性抗原、癌相关抗原或与自身免疫病相关细胞连接的抗原。在有些实施方案中，所述方法包括给予某种组合物，该组合物包含3种质粒，其中的第三质粒包含编码人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。在有些实施方案中，所述方法包括给予某种组合物，该组合物包含4种质粒，其中第三种质粒包含编码人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与真核细胞表达所必需的调控元件操作性连接，以及第四种质粒，它包含编码人GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5或IL-10蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。
本发明涉及一种改良的重组疫苗载体，它包含编码人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接，还包含编码靶抗原的核苷酸序列，该序列也与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。在有些实施方案中，人IL-2蛋白的编码基因编码单链蛋白形式的IL-2。在较好的实施方案中，靶抗原是病原性抗原、癌相关抗原或与自身免疫病相关细胞连接的抗原。
本发明涉及一种免疫接种个体以抵抗病原、癌症或自身免疫病的方法，它包括给予个体一种重组载体的步骤，该载体编码人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与在个体的细胞内表达所必需的调控元件操作性连接，还包含编码靶抗原的核苷酸序列，该序列也与在个体的细胞内表达所必需的调控元件操作性连接，其中的靶抗原是病原性抗原、癌相关抗原或与自身免疫病相关细胞连接的抗原。
本发明涉及改良的减毒活疫苗，它包含编码人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接。
本发明涉及一种免疫接种个体以抵抗病原、癌症或自身免疫病的方法，它包括给予个体减毒疫苗的步骤，该疫苗包含编码人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与在所述个体的细胞内表达所必需的调控序列操作性连接。
本发明涉及一种质粒，它包含编码人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接。
本发明涉及一对质粒，其中一个质粒含有编码人IL-12蛋白p35亚基的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接，另一质粒含有编码人IL-12蛋白p40亚基的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接。
本发明涉及一种质粒，它含有编码单链人IL-12蛋白的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接，其中单链人IL-12蛋白是一种单体蛋白，它的p35亚基和p40亚基通过一接头序列彼此连接，被表达时，此单链蛋白能够形成具有生物活性的IL-12分子。
本发明涉及一种药物组合物，它包含一种质粒和药学上可接受的载体或稀释剂，该质粒含有编码人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接。
本发明涉及一种药物组合物，它包含一对质粒和药学上可接受的载体或稀释剂，一个质粒含有编码人IL-12蛋白p35亚基的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接，另一质粒含有编码人IL-12蛋白p40亚基的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接。
本发明涉及一种药物组合物，它包含一种质粒和药学上可接受的载体或稀释剂，此质粒含有编码单链人IL-12蛋白的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接，其中单链人IL-12蛋白是一种单体蛋白，它的p35亚基和p40亚基通过一接头序列彼此连接，被表达时，此单链蛋白能够形成具有生物活性的IL-12分子。
本发明涉及治疗患有过敏反应、病原感染、癌症或自身免疫病个体的治疗方法，包括给予患者一种质粒的步骤，该质粒含有编码IL-12蛋白的核苷酸序列，而此序列与在个体的细胞内表达所必需的调控序列操作性连接。
本发明涉及治疗患有过敏反应、病原感染、癌症或自身免疫病个体的治疗方法，包括给予患者一对质粒的步骤，其中一个质粒含有编码人IL-12蛋白p35亚基的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接，另一质粒含有编码人IL-12蛋白p40亚基的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接。
本发明涉治疗患有过敏反应、病原感染、癌症或自身免疫病个体的治疗方法，包括给予患者一种质粒的步骤，该质粒含有编码单链人IL-12蛋白的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接，所述的单链人IL-12蛋白是一种单体蛋白，它的p35亚基和p40亚基通过一接头序列彼此连接，被表达时，此单链蛋白能够形成具有生物活性的IL-12分子。
本发明涉及加强或推动个体内免疫应答向Th1型免疫应答转变的方法，它包括给予个体一种质粒的步骤，该质粒含有编码人IL-12蛋白质的核苷酸序列，该序列与在个体的细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。
本发明涉及一种加强个体内TH1型免疫应答或推动个体内的免疫应答向TH1型转变的方法，它包括给予个体一对质粒的步骤，其中一个质粒含有编码人IL-12蛋白p35亚基的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接，另一质粒含有编码人IL-12蛋白p40亚基的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接。
本发明涉及一种加强个体内TH1型免疫应答或推动个体内的免疫应答向TH1型转变的方法，它包括给予个体一种质粒的步骤，该质粒含有编码单链人IL-12蛋白的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接，其中单链人IL-12蛋白是一种单体蛋白，它的p35亚基和p40亚基通过一接头序列彼此连接，被表达时，此单链蛋白能够形成具有生物活性的IL-12分子。
本发明涉及一种重组载体，它包含编码人IL-12蛋白的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。
本发明涉及一种重组载体，它包含编码单链人IL-12蛋白的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接，其中单链人IL-12蛋白是一种单体蛋白，其p35和p40亚基通过一接头序列彼此连接，在表达时，此单链蛋白能够形成生物活性IL-12分子。
本发明涉及一种药物组合物，它包含一种重组载体和药学上可接受的载体或稀释剂，所述重组载体含有编码人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-10或BL-1蛋白中一个或多个的核苷酸序列，这些序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接。
本发明涉及一种药物组合物，它包含一种重组载体和药学上可接受的运载体或稀释剂，所述重组载体含有编码单链人IL-12蛋白的一条核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接，其中单链人IL-12蛋白是一种单体蛋白，其p35和p40亚基通过一接头序列彼此连接，在表达时，此单链蛋白能够形成生物活性IL-12分子。
本发明涉及治疗患有过敏反应、病原感染、癌症或自身免疫病个体的治疗方法，包括给予患者一种重组载体的步骤，所述的重组载体含有编码人IL-12蛋白的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接。
本发明涉及治疗患有过敏反应、病原感染、癌症或自身免疫病个体的治疗方法，包括给予患者一种重组载体的步骤，所述的重组载体含有编码单链人IL-12蛋白的一条核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接，其中单链人IL-12蛋白是一种单体蛋白，它的p35亚基和p40亚基通过一接头序列彼此连接，被表达时，此单链蛋白能够形成具有生物活性的IL-12分子。
本发明涉及一种加强个体内Th1型免疫应答或推动免疫应答向Th1型免疫应答转变的方法，它包括给予个体一种重组载体的步骤，该重组载体含有编码人IL-12蛋白质的核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。
本发明涉及一种加强个体内TH1型免疫应答或推动个体内的免疫应答向TH1型转变的方法，它包括给予个体一种重组载体的步骤，所述的重组载体含有编码单链人IL-12蛋白的一条核苷酸序列，该序列与在真核细胞内表达所必需的调控序列操作性连接，其中所述的单链人IL-12蛋白是一种单体蛋白，它的p35亚基和p40亚基通过一接头序列彼此连接，被表达时，单链蛋白能够形成具有生物活性的IL-12分子。
本发明提供组合物，它们含有编码一种或多种人前炎性细胞因子(IL-1α、TNF-α和TNF-β)，Th1细胞因子(IL-12、IL-15和IL-18)，和Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)蛋白的核酸序列，以此作为主要成份，还涉及用该组合物来推动或引导免疫应答的方法，即给予个体上述核酸分子。本发明涉及加强抗原特异性体液应答的方法，即同时给予IL-5或IL-8和疫苗，此疫苗引入了DNA疫苗构建物那样的靶免疫原。本发明涉及加强抗原特异性T辅助细胞增殖的方法，即同时给予IL-2、IL-5、IL-10、IL-18、TNF-α或TNF-β和疫苗，此疫苗引入了DNA疫苗构建物那样的靶免疫原。本发明还涉及加强细胞毒性应答的方法，即同时给予TNF-α或IL-5基因和疫苗，此疫苗引入DNA疫苗构建物那样的靶免疫原。
本发明提供了组合物，它们包含编码人GM-CSF的核酸分子，本发明还涉及诱导和调节免疫应答的方法，即给予或同时给予编码GM-CSF的基因构建物。本发明涉及通过同时注射GM-CSF基因和DNA疫苗构建物增强抗原特异性抗体应答和T辅助细胞增殖反应的方法。
本发明涉及基本纯的BL-1及其免疫调节片段。
本发明涉及分离的核酸分子，它们编码BL1及其免疫调节片段。
本发明涉及核酸探针和引物，它们特异性地针对编码BL1或其免疫调节片段的核酸分子。
本发明涉及寡核苷酸分子，它们由BL1编码核苷酸序列的特异性部分的互补核苷酸序列构成。
本发明涉及包含编码BL1或其免疫调节片段的核酸分子的载体。
本发明涉及重组表达载体，它们包含编码BL1或其免疫调节片段的核酸序列。
本发明涉及包含重组表达载体的宿主细胞，所述的载体包含编码BL1或其免疫调节片段的核酸序列。本发明涉及基因治疗用载体，它包含编码BL1或其免疫调节片段的核酸分子。
本发明涉及分离的抗体，该抗体结合BL1上的特异性表位。
本发明涉及制造BL1及其免疫调节片段的方法。
本发明涉及调节个体免疫应答的方法，包括给予个体BL1蛋白或其免疫调节片段，或含有编码BL1蛋白或其免疫调节片段的核苷酸序列的载体。根据本发明，含有BL1密码序列的载体足以调节此免疫应答。
本发明涉及加强和引导个体免疫应答的方法，包括给予个体用于传递免疫原和BL1蛋白或其免疫调节片段的一种疫苗组合物，或给予含有编码BL1蛋白或其免疫调节片段的核苷酸序列的载体。根据本发明，含有BL1密码序列的载体足以调节免疫应答。
附图简述

图1A和1B显示的是实施例4得出的数据。在图1A中，在首日肌内注射50μg各个cDNA表达盒。免疫后第14天，收集所有接受免疫动物的脾脏并称重。给阴性对照动物免疫。只注射Gag/Pol和只注射IL-12的小鼠的脾脏与未免疫的对照小鼠的脾脏重量相似(约100mg)。但是，注射Gag/Pol+IL-12的小鼠的脾脏其重量几乎是对照小鼠脾脏的三倍。相反，Gag/Pol+GM-CSD免疫小鼠的脾脏不增大。在图1B中，从各脾脏制备并纯化白细胞。与它们的脾脏重量差异直接对应，Gag/Pol+IL-12免疫脾脏的细胞数量超过对照脾脏的三倍以上。Gag/Pol+GM-CSF免疫小鼠脾脏的淋巴细胞数与对照脾脏的淋巴细胞数相比没有明显增加。
图2中，在首日肌内注射50μg各个cDNA表达盒。免疫后第14天，收获脾脏并摄影。脾脏的外观大小与其重量直接对应，接种了免疫原+IL-12的脾脏明显大于未接种的对照脾脏。组别(-)未接种；IL-12接种的；空载体+IL-12接种的；Gag/Pol+IL-12接种的。
图3中，同时给予IL-12两链中的一条。各质粒分别使用50μg。p35和p40亚基以及Gag/Pol都是脾脏增大所必需的。
图4中，在首日肌内注射50μg各个cDNA表达盒。收集免疫小鼠的抗血清，通过ELISA分析抗HIV-1抗原的特异性抗体反应。显示的是第28天采集的样品的ELISA结果。当稀释度为1∶100时，空载体+GM-CSF免疫组的抗血清表现出抗HIV-1 gp120蛋白的抗体反应，该反应强于仅用空载体免疫的组。另一方面，在同样时间后，用空载体+IL-12免疫的组表现出明显较弱的体液应答。
图5中，T辅助细胞的激活和增殖在诱导体液免疫(通过抗原激活的B细胞的扩增)反应中起着重要作用，同时在诱导细胞免疫(通过CD8+细胞毒性T细胞的扩增)反应中起着重要作用。首日肌内注射50μg各个cDNA表达盒。收集脾脏细胞，测试T细胞的增殖。在测试板的各孔中加入20μg/ml的重组p55蛋白，用于刺激T细胞增殖。10μg/ml凝集素PHA被用作多克隆刺激物阳性对照。刺激指数为特定蛋白刺激的细胞的放射活性水平除以介质中细胞的测得水平。PHA刺激的对照的刺激指数是58.8。
图6中，首日肌内注射50μg各个cDNA表达盒。收获脾脏，制备细胞，用这些细胞进行没有体外刺激的CTL试验。对照组只用IL-12基因盒免疫，结果靶细胞特异性溶解不超过背景水平。此外，只用Gag/Pol免疫，在50∶1的效∶靶比时观察到了低水平(3％)的特异性溶解。相反，同时给予Gag/Pol+IL-12的样品，在50∶1的效∶靶此时可看到62％的特异性裂解，当效∶靶比为12.5∶1时，经滴定为9％。用Gag/Pol+GM-CSF质粒免疫接种，结果无可测水平的CTL活性。用非相关性抗原表达牛痘苗制备的靶细胞，进行同样的CTL试验，结果没有任何明显的CTL反应。
图7中，首日肌内注射50μg各cDNA表达盒。收获脾脏，制备细胞，用这些细胞进行没有体外刺激的CTL试验。在50∶1的效∶靶比时，只用空载体免疫和用空载体+GM-CSF免疫的动物组有低水平的特异性CTL，分别为4％和1％。另一方面，用空载体+IL-12免疫的组，发现其CTL活性显著增强，达59％。用非相关性抗原表达牛痘苗制备的靶细胞，进行同样的CTL试验，结果没有任何明显的CTL反应。
图8A、8B和8C显示本发明所用的质粒。图8A显示的质粒包含IL-12单链蛋白的编码序列。图8B和图8C显示的质粒各自分别含有两亚基的编码序列。
图9显示表3。
图10中，各种细胞因子基因被克隆到表达质粒中，处于CMV启动子的控制下，并体外转染到RD细胞内。各种细胞因子的表达用免疫沉淀法或细胞因子ELISA来证实。
图11A和11B显示检测I类MHC限制的CTL试验的结果。如图11A所示，第一次DNA和pCEnv共同注射(各50μg)后2周，以同样的剂量对小鼠(4个1组)进行加强免疫。又过1周，采集接种小鼠的脾脏，分离其淋巴细胞，用靶细胞检测CTL反应，此靶细胞是用空载体-特定肽(RIHIGPGRAFYTTKN)制备的，据报道，该特定肽在balb/c小鼠中是I类MHC限制性的。如图11B所示，第一次DNA和pCGag/pol共同注射(各50μg)后2周，以同样的剂量对小鼠(4个1组)进行加强免疫。又过1周，采集免疫小鼠的脾脏，分离出淋巴细胞，测试CTL反应。通过补体溶解去除CD8+T细胞进行CTL试验。在CD8+T细胞存在下(上图)和去除CD8+T细胞后(下图)制备效应细胞。以上实验重复两次，结果类似。
图12显示评价直接抗原特异性CTL实验的结果(没有体外效应细胞刺激)。第一次DNA和pCEnv共同注射(各50μg)后2周，以同样的剂量对小鼠(4个1组)进行加强免疫。又过1周，采集免疫小鼠的脾脏，分离出淋巴细胞，用特异性(vMN462)和非特异性(vSC8)牛痘苗感染的靶细胞测试CTL反应。以上实验重复进行，结果类似。
图13概括了共同给予各种细胞因子对抗体(Y轴)，T辅助细胞(X轴)和细胞毒性T淋巴细胞反应(Z轴)的作用。各种细胞因子根据其对三种免疫反应模式的作用，绘制在3维坐标上。
图14显示BL1的核苷酸序列和推定的氨基酸序列。
图15显示BL1连接到PCR3真核表达载体内的过程，和pBBKan载体。
图16显示ELISA试验的结果。该试验比较了同时给予和没有同时给予BL1时，针对HIV抗原Nef的抗HIV抗原反应。
图17A、17B、17C和17D显示试验结果，该试验比较了同时给予和没有同时给予BL1时，针对HIV抗原Gag/Pol的抗HIV抗原免疫反应。
本发明的详细说明本文所用术语“免疫调节蛋白”指人IL-12、GM-CSF、IL-1α、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5和IL-10之一，和新的BL-1分子。
本文所用术语“IL-12基因构建物”指如下质粒包含编码人IL-12蛋白一个或两个亚基和/或免疫原性靶蛋白的编码序列，这些编码序列与在真核细胞内表达所需的调控元件操作性连接。DNA表达调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号。此外，Kozak区等其它元件也可以包含在此基因构建物中。起始信号和终止信号是必需的调控元件，它们常被认为属于编码序列。本发明基因构建物的编码序列包括功能性起始信号和终止信号。
本文所用术语“所需的IL-12蛋白”指人IL-12的一个或两个亚基，其中包括单链IL-12蛋白，在这种蛋白中两亚基由一条编码序列编码，并表达为由一接头序列连接两个亚基的单链蛋白。
本文所用术语“所需的蛋白”指由疫苗的编码序列编码的免疫原性靶蛋白，所述疫苗包含编码免疫原性靶蛋白的核酸分子。
本文所用术语“单链蛋白”和“单链IL-12蛋白”指如下单链蛋白，其中IL-12的p35亚基和p40亚基通过一段氨基酸接头互相连接，该接头足够长而且足够柔韧，允许该单链蛋白的两亚基部分相互作用，形成生物活性复合体构象，即IL-12。单链IL-12的功能与p35和p40组成的IL-12基本相同。本发明包括在使用IL-12的所有场合使用单链IL-12。此单链蛋白是由一条核苷酸序列编码的。
白细胞介素-12(IL-12)是一种异二聚体细胞因子，主要由巨噬细胞和B细胞产生。IL-12由称为p35和p40的两个不同亚基构成，(Podlaski，F.J.等，(1991)Arch.Biochem.Biophys.294(1)230-237，本文将其纳作为参考)。
不同的免疫应答涉及不同的T细胞群。具体地说，有两种不同类型的T细胞，I型T辅助细胞(Th1)和2型T细胞(Th2)，它们彼此的区别在于产生的细胞因子。发现IL-12在Th1免疫应答中起着重要作用，主要是诱导产生Th1相关性干扰素-γ(IFN-γ)。它通过诱导和释放包括IFN-γ在内的多种细胞因子来激活天然杀伤细胞(NK)和T细胞。
本发明的若干方面涉及将编码人IL-12蛋白的核酸分子用作免疫调节剂。编码人IL-12蛋白的核酸分子可以作为主要活性成份来传递，即作为基因治疗、或作为疫苗组合物的一部分或结合于其中，例如包含编码免疫原性靶蛋白核酸分子的疫苗。
有关作为主要成份的编码人IL-12蛋白的核酸分子的用途，本发明提供了推动免疫应答向Th1免疫应答发展或加强该应答的组合物和方法，即给予个体编码人IL-12蛋白的核酸分子。根据本发明的某些方面内容，过敏疾病、病原感染、癌症或自身免疫病患者可以通过给予如下核酸分子来治疗，此核酸分子包含编码人IL-12的核苷酸序列，该序列与在患者细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。此核酸分子被细胞摄入，编码人IL-12的核苷酸序列得以表达。如此由细胞产生的人IL-12具有生物活性，而且其活性诱导和/或加强了患者产生的免疫应答。在某些较好的实施方式中，编码人IL-12蛋白的核酸分子是质粒。
本发明包括编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸分子的应用，GM-CSF是一种造血生长因子，它刺激中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和嗜酸性细胞集落的形成。它还诱导红细胞系和巨核细胞祖细胞的增殖和分化。GM-CSF还提高中性粒细胞、嗜酸性细胞和巨噬细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，但是据报道它在体内对CTL应答的产生无直接作用。本发明提供了推动免疫应答的组合物和方法，即给予个体编码GM-CSF的核苷酸序列的基因构建物。此核酸分子被细胞摄入，编码GM-CSF的核苷酸序列由此被细胞表达和产生。产生的GM-CSF具有生物活性，这种活性诱导和/或加强了个体的免疫反应。在某些较好的实施方案中，编码GM-CSF的核酸分子是质粒。
本发明包括作为主要成份的编码人前炎性细胞因子(IL-1α、TNF-α和TNF-β)、Th1细胞因子(IL-2，IL-15和IL-18)和Th2细胞因子(IL-4，IL-5和IL-10)蛋白的核酸分子的用途。本发明提供了推动免疫应答方向或加强免疫应答的组合物和方法，即给予个体编码人前炎性细胞因子(IL-1α、TNF-α和TNF-β)、Th1细胞因子(IL-2，IL-15和IL-18)和Th2细胞因子(IL-4，IL-5和IL-10)的核酸分子。根据本发明的部分内容，患者接受给予包含以下核苷酸序列的核酸分子的治疗，这些核苷酸序列编码人前炎性细胞因子(IL-1α、TNF-α和TNF-β)、Th1细胞因子(IL-2，IL-15和IL-18)和Th2细胞因子(IL-4，IL-5和IL-10)，所述核苷酸序列与在患者细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。这些核酸分子被细胞摄入，编码上述蛋白的核苷酸序列得以表达如此由细胞产生的人蛋白质具有生物活性，这种活性诱导和/或加强了个体产生的免疫反应。在一些较好的实施方案中，所述的核酸分子是质粒。
有关作为编码免疫原性靶蛋白的核酸分子的一部分或与之连接的编码人IL-12蛋白的核酸分子的用途，即作为疫苗组成诱导抗免疫原性蛋白的免疫反应，编码人IL-12蛋白的核酸分子可以是疫苗的成份之一，所述疫苗包括编码免疫原性靶蛋白的核酸分子，可以是包括免疫原性靶抗原的疫苗的成份之一，或者是单独的组合物，该组合物与含有编码免疫原性靶蛋白的核酸分子的疫苗或包括免疫原性靶的疫苗同时给予。在一些较好的实施方案中，编码人IL-12蛋白的核酸分子是质粒，疫苗是包含编码免疫原性靶蛋白质粒的DNA疫苗。在一些较好的实施方案中，所述的DNA疫苗包含编码免疫原性靶蛋白和人IL-12蛋白的质粒。
IL-12可参见1990年5月17日公开的PCT申请WO90/05147，本文将其纳为参考。Wolf，S.F.等，1991，J.Immnol.146(9)3074-3081，本文将其纳为参考，揭示了编码IL-12的cDNA的核苷酸序列，和IL-12蛋白的预定氨基酸序列。天然人IL-12蛋白由p35和p40两亚基构成。这两个亚基形成具有生物活性的异二聚复合体。
根据本发明的有些实施方案，编码IL-12两亚基的核苷酸序列可位于一个质粒、非质粒核酸分子或病毒或细菌基因组上，其中编码两亚基的核苷酸序列处于各自成套调控元件的控制之下。在一些较好的实施方案中，IL-12两亚基的编码序列位于一个质粒上；各编码序列与各自的成套调控元件操作性连接。在有些实施方案中，某免疫原性靶蛋白的编码序列与调控元件操作性连接，与两亚基的编码序列位于同一质粒上。在有些实施方案中，某免疫原性靶蛋白的编码序列与调控元件操作性连接，位于分开的另一质粒上，即不在含两亚基编码序列的质粒上，这两种质粒都传递给同一患者。
根据本发明的部分实施方案，编码p35亚基的核苷酸序列位于第一质粒上，编码p40亚基的核苷酸序列位于第二质粒上，两质粒同时注射入患者的同一部位。在有些实施方案中，与调控元件操作性连接的免疫原性靶蛋白的编码序列与p35亚基的编码序列位于同一质粒上。在有些实施方案中，与调控元件操作性连接的免疫原性靶蛋白的编码序列与p40亚基的编码序列位于同一质粒上。在有些实施方案中，某免疫原性靶蛋白的编码序列与调控元件操作性连接，位于分开的另一质粒上，即不在含两亚基编码序列的质粒上，这三种质粒同时给予同一患者。
IL-12蛋白及其编码核苷酸序列可以被修饰，使得两亚基由一条核苷酸序列编码，并表达为单链(融合)蛋白质分子。根据本发明，提供了一段接头氨基酸序列，它主要连接两亚基，但是其柔韧性足以使得单链蛋白的不同部分可复合形成具有生物活性的蛋白质。图8A显示了一例单链蛋白，其中单链蛋白的编码序列处于人巨细胞病毒启动子的调控下。此单链蛋白的编码序列从5’至3’包括p35亚基的编码序列，接头的编码序列和p40亚基的编码序列，它们作为一条编码序列。在考虑的另一种安排中，单链蛋白的编码序列包括p40亚基的编码序列，接头的编码序列和p35亚基的编码序列，它们作为一条编码序列。接头必须具有足够的长度和韧性，可使单体蛋白的两个部分相对排布成为具有生物活性的复合体。
根据本发明的部分实施方案，将编码单链IL-12蛋白(两亚基由接头连接成单体蛋白)的核苷酸序列掺入质粒、非质粒核酸分子或病毒或细菌基因组内，并与在真核细胞内表达所必需的调控元件操作性连接。在较好的实施方案中，编码单链IL-12蛋白(两亚基由接头连接成单体蛋白)的核苷酸序列掺入一个质粒中。在有些实施方案中，免疫原性靶抗原的编码序列与调控元件操作性连接，与单链IL-12蛋白的编码序列位于同一质粒上。在有些实施例中，免疫原性靶抗原的编码序列与调控元件操作性连接，位于分开的另一质粒上，即不在含有单链蛋白编码序列的质粒上，这两种质粒都给予同一患者。
根据本发明的部分内容，涉及疫苗接种(尤其是DNA疫苗)的改进方法和组合物，其中编码免疫原性靶蛋白的DNA被给予患者，该DNA被摄入患者体内并表达，产生针对该免疫原的免疫应答。根据本发明内容，编码各种免疫调节蛋白的DNA被同时传递给患者，该DNA的表达产生免疫调节蛋白，该蛋白调控免疫应答的程度和方向，以诱导特异性免疫应答，使得免疫接种经改进后与因各种疾病而异的保护作用的关系更密切。
已经发现，在经接种个体表达靶抗原的细胞内同时产生IL-12蛋白出人意料地增强了针对靶抗原的免疫应答。通过提供可表达形式的编码IL-12蛋白的核苷酸序列，能在接种个体的细胞内表达靶抗原而起作用的疫苗，例如DNA疫苗、重组载体疫苗和减毒疫苗，得到了改进。
在产生抗原的细胞内同时产生IL-12加强了针对抗原的细胞免疫力。所以，本发明提供了一种改进疫苗，即提供一段编码IL-12的核苷酸序列，该序列与在接种者内表达所必需的调控元件操作性连接，该序列作为诸如DNA疫苗、无毒重组载体疫苗和减毒活疫苗的组成部分。
本发明通过同时传递编码GM-CSF的基因构建物诱导和调节了免疫应答。将GM-CSF基因与DNA疫苗构建物共同注射，加强了抗原特异性抗体应答和T辅助细胞增殖反应。
本发明通过同时传递编码前炎性细胞因子(IL-1α、TNF-α和TNF-β)，Th1细胞因子(IL-2、IL-15和IL-18)，和Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)的基因构建物诱导和调节了免疫应答。
本发明的某些部分通过同时传递IL-5或IL-18显著加强了抗原特异性体液免疫应答。
本发明的某些部分通过同时传递IL-2、IL-15、IL-10、IL-18、TNF-α或TNF-β加强了抗原特异性T辅助细胞的增殖。
本发明的某些部分通过同时传递TNF-α或IL-15基因加强了细胞毒性反应。
所以，当T细胞介导的应答是首要的应答，而体液反应不需要甚至是不利时，则宜将IL-12基因作为免疫调节者与特异性DNA免疫原同时递送。另一方面，为了构建例如针对胞外细菌的疫苗，可以同时注射以IL-4、IL-5或IL-10基因。而且，当CD4+T辅助细胞和抗体在保护作用中都起着更为重要的作用时，可以同时递送GM-CSF和IL-12。最后，当三种免疫应答都很重要时，可以同时注射TNF-α，以综合加强抗体、T辅助细胞和CTL应答。
人IL-1α的核苷酸和氨基酸序列是众所周知的，可参见Telford等，(1986)Nucl.Acids.Res.149955-9963，Furutani等，(1985)Nucl.Acids.Res.143167-3179，March等，(1985)Nature 315641-647和登录号Swissprot PO1583，本文将其纳为参考。
人IL-2的核苷酸和氨基酸序列是众所周知的，可参见Holbrook等(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA811634-1638，Fujita等(1983)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA807437-7441，Fuse等(1984)，Nucl.Acids.Res.129323-9331，Taniguchi等(1983)，Nature 302305-310，Maede等(1983)Biochem.Biophys.Res.Comm.1151040-1047，Devos等(1983)Nucl.Acids.Res.114307-4323和登录号Swissprot PO1585，本文将其纳为参考。
人IL-4的核苷酸和氨基酸序列是众所周知的，可参见Arai等(1989)，J.Immunol.142274-282，Otsuka等(1987)，Nucl.Acids.Res.15333-344，Yokota等(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA835894-5898，Noma等(1984)，Nature319640-646，Lee等(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 832061-2063和登录号Swissprot 05112(鼠IL-4的登录号是Swissprot 07750)，本文将其纳为参考。
人IL-5的核苷酸和氨基酸序列是众所周知的，可参见Campbell等(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846629-6633，Tanabe等(1987)，J.Biol.Chem.26216580-16584，Campbell等(1988)，Eur.J.BioChem.171345-352，Azuma等(1986)，Nucl.Acids.Res.149149-9158，Yokota等(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847388-7392和登录号Swissprot PO5113，本文将其纳为参考。
人IL-10的核苷酸和氨基酸序列是众所周知的，可参见Viera等(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881172-1176和登录号Swissprot P22301。
人IL-15的核苷酸和氨基酸序列是众所周知的，可参见Grabstein等(1994)，Science264965-968和登录号Swissprot U03099，本文将其纳为参考。
人IL-18的核苷酸和氨基酸序列是众所周知的，可参见Ushio等(1996)J.Immunol.1564274-4279和登录号Swissprot D49950，本文将其纳为参考。
人TNF-α的核苷酸和氨基酸序列是众所周知的，可参见Pennica(1984)Nature312724-729和登录号Swissprot PO1375，本文将其纳为参考。
人TNF-β的核苷酸和氨基酸序列是众所周知的，可参见Gray(1984)Nature312721-724和登录号Swissprot PO1374，本文将其纳为参考。
有关DNA疫苗可参见美国专利5,593,972，美国专利5,589,466，PCT/US90/01515，PCT/US93/02338，PCT/US93/048131和PCT/US94/00899，以及各专利和已颁布专利申请所引用的优先权申请，这些都被本文纳为参考。除了以上专利申请中所述的传递方法之外，其它传递DAN的方法可参见美国专利4,945,050和5,036,006，，本文将其纳为参考。
本发明的一个改进涉及到除了产生由DNA疫苗核酸序列编码的靶抗原之外，还含有同时产生免疫调节蛋白的基因材料。
本发明涉及将遗传物质引入个体细胞的方法，以诱导针对该遗传物质所编码的蛋白或肽的免疫应答反应。所述方法包括给予所述个体组织单一核酸分子或组合物，所述的单一核酸分子包含编码靶蛋白的核苷酸序列和编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，所述的组合物包括两种核酸分子，一种包含编码靶蛋白的核苷酸序列，另一种包含编码免疫调节蛋白的核苷酸序列。提供的核酸分子可以是质粒DNA、重组载体核酸分子或减毒疫苗内的遗传物质部分。
根据本发明，所提供的是给予个体预防性和/或治疗性免疫接种的组合物和方法，以抵抗某种病原或异常的疾病相关细胞。遗传物质编码的靶蛋白，是与靶向的病原或细胞上的某免疫原性蛋白至少具有一个相同表位的肽或蛋白质，而且，遗传物质还编码免疫调节蛋白。遗传物质由个体的细胞表达，并作为免疫原性靶引发针对它的免疫应答。所引发的免疫应答与靶向的病原或细胞反应，而且具有广泛的免疫基础不仅引发体液免疫，而且引发细胞免疫应答的输入输出枝。本发明的方法可用于赋予预防性或治疗性免疫力。所以，免疫方法包括保护个体免受病原攻击或避免特殊细胞出现或增殖的方法，以及包括治疗病原感染、超增殖性疾病或自身免疫病患者的方法。
本文所用术语“靶蛋白”指由本发明基因构建物编码的肽和蛋白质，它们起着引起免疫应答的靶蛋白作用。“靶蛋白”指能够引发针对它的免疫反应的蛋白。靶蛋白是免疫原性蛋白，它与免疫反应所针对的病原或不良类型细胞(例如癌细胞或与自身免疫病有关的细胞)的蛋白至少具有一个相同表位。针对靶蛋白的免疫反应将为个体提供保护和治疗以抵御与靶蛋白有关的特定感染或疾病。靶蛋白不一定与所需免疫反应所针对的蛋白完全相同。但是，靶蛋白必须能够诱导与所需免疫应答所针对的蛋白发生交叉反应的免疫应答。
本发明可用于引发针对某靶蛋白(即与病原体或个体自身的“异常”细胞特异性相关的蛋白)的广泛免疫应答。本发明可用于免疫个体以抵抗病原性物质和生物，由此，针对某病原蛋白的免疫应答提供了抵抗该病原的保护性免疫力。本发明可用于抵抗超增殖性疾病和紊乱(例如癌症)，即引发针对与超增殖细胞特异性相关的靶蛋白的免疫应答。本发明可用于抵抗自身免疫病和紊乱，即引发针对与参与自身免疫状态的细胞特异性相关的靶蛋白的免疫应答。
根据本发明，编码靶蛋白和免疫调节蛋白的DNA或RNA被引入个体的组织细胞中，并表达，由此产生靶蛋白。编码靶蛋白和免疫调节蛋白的DNA或RNA序列与在个体的细胞内表达所必须的调控元件相连接。DNA表达所需的调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号。此外，此基因构建物中还可包含诸如Kozak区之类的其它元件。
本文所用术语“可表达形式”，指这样的基因构建物，它包含与靶蛋白或免疫调节蛋白编码序列操作性连接的必需的调控元件，从而能够在个体的细胞内表达编码序列。
本文所用术语“有一个相同的表位”指某些蛋白质含有与另一蛋白的表位至少一个完全相同或基本相似的表位。
本文所用术语“基本相似表位”在此表示所述表位所具有的结构与某蛋白的某表位不完全相同，但是能够引发与该蛋白发生交叉反应的细胞或体液免疫反应。
基因构建物包含一段核苷酸序列，它编码靶蛋白和/或免疫调节蛋白，该序列与基因表达所需的调控元件操作性连接。根据本发明，还提供基因构建物的组合，即其中之一包含可表达形式的编码靶蛋白的核苷酸序列，另一构建物则包含可表达形式的编码免疫调节蛋白的核苷酸序列。将包含基因构建物组合的DNA或RNA分子引入活细胞，使DNA或RNA得以表达，并产生靶蛋白和免疫调节蛋白。结果产生针对靶蛋白的加强免疫应答。
当遗传构建物被细胞摄取时，它们留在细胞内作为功能性的染色体外分子，和/或整合到细胞的染色体DNA中。可以将DNA以质粒形式作为单独的遗传物质引入细胞。或者，可将能够与染色体整合的线性DNA引入细胞。在将DNA引入细胞时，可以加入促进DNA整合到染色体中的反应试剂。也可以在DNA分子内包含促进整合的DNA序列。或者，可以将RNA引入细胞。也可以考虑提供一种线性小染色体，它具有着丝粒、端粒和复制起始位点。基因构建物可以作为遗传物质部分留存在生活于细胞内的减毒活微生物或重组微生物载体内。基因构建物可以是重组病毒疫苗的基因组部分，此时，遗传物质或者整合到细胞染色体内，或者留存在染色体外。
遗传构建物包括核酸分子基因表达所必需的调控元件。这些元件包括启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。此外，为了表达编码靶蛋白或免疫调节蛋白的基因，常需要加强子。这些元件必须与编码所需蛋白的序列操作性连接，而且这些调控元件必须在所给予的个体内有效。
起始密码子和终止密码子一般认为应包含在编码所需蛋白的核苷酸序列内。但是，这些元件在给予基因构建物的个体内应是有功能的。起始密码子和终止密码子必须与编码序列在同一读码框内。
所用的启动子和聚腺苷酸化信号在个体的细胞内必须是有功能的。
可用于实施本发明，尤其是用于产生人用基因疫苗的启动子实例包括但不限于猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)的启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)的启动子如HIV长末端重复启动子、Moloney病毒启动子、ALV启动子、巨噬细胞病毒(CMV)的启动子例如CMV中早期启动子、EB病毒的启动子、罗丝肉瘤病毒(RSV)的启动子和例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸、人金属硫蛋白等人基因的启动子。
可用于实施本发明，尤其是用于生产人用基因疫苗的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。需指出的是，本发明使用的是位于pCEP4质粒(Invitrogen，San Diego CA)内的SV40聚腺苷酸化信号，文中称为SV40聚腺苷酸化信号。
除了DNA表达必需的调控元件外，DNA分子内可以包含其它元件。这些其它元件包括加强子。加强子可以选自但不限于人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸和诸如CMV、RSV和EBV等病毒的加强子。
为了使构建物保留在染色体外和在细胞内产生构建物的多份拷贝，可以提供具有哺乳动物复制起始位点的遗传构建物。Invitrogen(San Diego CA)的质粒pCEP4和pREP4含有EB病毒复制起始位点和编码核抗原EBNA-1的区域，它们产生高拷贝游离复制产物而不整合。
在有关免疫接种应用的较好实施方案中，被传递的核酸分子包括编码靶蛋白、IL-12蛋白和进一步加强抗靶蛋白免疫应答的其它蛋白的基因的核苷酸序列。例如编码细胞因子和淋巴因子的基因，所述的因子例如α干扰素、γ干扰素、血小板生长因子(PDGF)、G-CSF、GM-CSF、TNF、上皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和B7.2。在有些实施方案中，用于免疫接种组合物的遗传构建物中宜包含GM-CSF的基因。
如果出于某种理由需要消灭接受该遗传构建物的细胞，可以加入作为细胞解离靶子的其它元件。可以在遗传构建物中包含可表达形式的疱疹胸腺嘧啶激酶(tk)基因。可以给予个体药物gangcyclovir，该药将选择性地杀灭所有产生tk的细胞，由此提供了选择性破坏具有遗传构建物的细胞的方法。
为了尽可能扩大蛋白质的生产，可以选择调控序列使得它们适合于在给予构建物的细胞内表达基因。而且，可以选用在细胞内转录效率最高的密码子。本领域一般技术人员能够制造在细胞内具有功能的DNA构建物。
两类骨架的实例包括一类用于双质粒系统，一类用于单质粒系统。在双质粒系统内，一个质粒具有可表达形式的靶蛋白编码序列，另一质粒具有可表达形式的IL-12编码序列。在单质粒系统内，同一质粒同时包含了可表达形式的靶蛋白编码序列和IL-12编码序列。
本发明方法的步骤包括将核酸分子给予个体的组织。在某些较好的实施方案中，核酸分子的给药途径是肌内、鼻内、腹膜内、皮下、真皮内、静脉内、通过气雾途径给予肺组织或通过局部使用或灌洗给予粘膜组织，所述粘膜组织选择阴道、直肠、尿道口腔颊部和舌下。
在有些实施方案中，核酸分子与促进剂(facilitator)一起传递给细胞。促进剂又称多核苷酸功能加强子或基因疫苗促进剂。有关促进剂可参见1993年1月26日提交的美国专利申请08/008,342，1993年3月11日提交的美国专利申请08/029,336，1997年1月14日提交的美国专利5,593,972和1994年1月26日提交的国际专利申请PCT/US94/00899，以上均被本文纳为参考。此外，促进剂还可参见1995年9月28日提交的PCT/US95/12502和1995年3月30日提交的PCT/US95/04071，以上均被本文纳为参考。与核酸分子联用的促进剂可以与核酸分子混合给予，或者在给予核酸分子的同时、之前或之后分开给予。此外，具有转染剂和/或复制剂和/或促炎剂作用的其它物质，和可以在有或没有促进剂存在下同时给予的其它物质包括生长因子、细胞因子和淋巴因子，例如α干扰素、γ干扰素、血小板生长因子(PDGF)、G-CSF、GM-CSF、TNF、上皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和B7.2，以及成纤维细胞生长因子，免疫刺激性复合物(ISCOMS)之类表面活性剂，弗氏不完全佐剂，LPS同类物(包括单磷酸脂A)，胞壁酰肽，醌同类物和诸如角鲨烯和角鲨烯之类的泡囊，和透明质酸。
在较好的实施方案中，本发明遗传构建物与选自以下组别的促进剂配制在一起或联用苯甲酸酯、脒、氨甲酸乙酯及其盐酸盐，例如局部麻醉剂家族的那些。
部分优选实施方案中的促进剂可以是具有以下结构之一的化合物Ar-R1-O-R2-R3或Ar-N-R1-R2-R3或R4-N-R5-R6或R4-O-R1-N-R7其中，Ar是苯、对氨基苯、间氨基苯、邻氨基苯、取代苯、取代对氨基苯、取代间氨基苯、取代邻氨基苯，氨基苯化合物中的氨基可以是氨基、C1-C5烷基胺、C1-C5、C1-C5二烷基胺，取代化合物中的取代基可以是卤素、C1-C5烷基和C1-C5烷氧基；R1是C＝O；R2是C1-C10烷基，包括支链烷基；R3是氢原子、胺、C1-C5烷基胺、C1-C5、C1-C5二烷基胺；R2可能与R3形成一个环烷基，一个C1-C10烷基取代的环烷基，环脂族胺、C1-C10烷基取代的环脂族胺、杂环、C1-C10烷基取代的杂环(包括C1-C10烷基N-取代的杂环)；R4是Ar、R2或C1-C5烷氧基、环烷基、C1-C10烷基取代的环烷基，环脂族胺、C1-C10烷基取代的环脂族胺、杂环、C1-C10烷基取代的杂环和C1-C10烷氧基取代的杂环(包括C1-C10烷基N-取代的杂环)；R5是C＝NH；
R6是Ar、R2或C1-C5烷氧基、环烷基、C1-C10烷基取代的环烷基，环脂族胺、C1-C10烷基取代的环脂族胺、杂环、C1-C10烷基取代的杂环和C1-C10烷氧基取代的杂环(包括C1-C10烷基N-取代的杂环)；R7是Ar、R2或C1-C5烷氧基、环烷基、C1-C10烷基取代的环烷基，环脂族胺、C1-C10烷基取代的环脂族胺、杂环、C1-C10烷基取代的杂环和C1-C10烷氧基取代的杂环(包括C1-C10烷基N-取代的杂环)；酯的实例包括苯甲酸酯，例如哌罗卡因、美普卡因和异布卡因；对氨基苯甲酸酯，包括普鲁卡因、丁卡因、丁胺卡因、丙氧卡因和氯普鲁卡因；间氨基苯甲酸酯，例如美布他明和primacaine；和对乙氧基苯甲酸酯，例如对乙氧卡因。苯胺的实例包括利多卡因、依替卡因、甲哌卡因、布吡卡因、吡咯卡因和丙胺卡因。此类化合物的其它实例包括辛可卡因、苯佐卡因、达克罗宁、普莫卡因、丙美卡因、布它卡因、奥布卡因、卡波卡因、甲基布吡卡因、Butasin picrate、非那卡因、Diothan、Luccaine、Intracaine、Nupercaine、美布卡因、匹多卡因、珍尼柳酯和植物源二环化合物，例如可卡因、肉桂酰可卡因、吐昔林和cocaethlene，以及所有以上化合物与盐酸的复合物。
在优选实施方案中，促进剂是布吡卡因。布吡卡因与甲哌卡因的区别在于以N-丁基取代了甲哌卡因的N-甲基。化合物在N位可能具有C1-C10。化合物可以卤素取代，例如普鲁卡因和氯普鲁卡因。较好的是苯胺。
促进剂在基因构建物之前、同时或之后给予。可以将促进剂与遗传构建物配制在同一组合物中。
布吡卡因-盐酸的化学名称是2-哌啶甲酰胺(2-piperidinecarboxamide)，1-丁基-N-(2，6-二甲基苯)-一盐酸，一水合物，其市场来源广泛，包括AstraPharmaceutical Product Inc.(Westboro，MA)和Sanofi Winthrop Pharmaceuticals(New York，NY)，Eastman Kodak(Rochester，NY)，被用于制药。市售的布吡卡因有时与羟苯甲酸甲酯和肾上腺素配制在一起，有时则不。以上所述的制剂均可使用。购来用于制药的浓度为0.25％，0.5％和0.75％，这些可用于本发明。如需要可以制成引发所需效果的其它浓度，尤其是0.05％至1.0％之间的浓度。根据本发明，给予约250g至10mg布吡卡因。在有些实施方案中，给予250g至7.5mg。在有些实施方案中，给予0.05mg至5.0mg。在有些实施方案中，给予0.5mg至3.0mg。在有些实施方案中，给予5至50g。例如，在有些实施方案中，在给予疫苗之前、同时或之后，在同一部位给予配制在同一等渗药用载体内的50μl至2ml，较好的是50μl至1500μl，更好的是约1ml布吡卡因-盐酸的0.25-0.50％溶液和0.1羟苯甲酸甲酯。在有些实施方案中，在给予疫苗之前、同时或之后，在同一部位给予配制在等渗药用载体内的50μl至2ml，较好的是50μl至1500μl，更好的是约1ml布吡卡因-盐酸的0.25-0.50％溶液。可以给予布吡卡因和任何其它作用类似的化合物，尤其是相关的局部麻醉剂家族中的那些化合物，其浓度应能够有效促进细胞摄入遗传构建物。
在本发明的有些实施方案中，在给予遗传构建物之前，个体先接受促进剂注射。例如，在给予遗传构建物之前约1周至10天时间，先给个体注射促进剂。在有些实施方案中，在给予遗传构建物约1至5天前，有时是24小时之前和之后给个体注射促进剂。或者，只要被使用，促进剂可以在给予遗传构建物的同时、几分钟前或之后给予。所以，可将促进剂与遗传构建物合并在一个药物组合物中。
在有些实施方案中，给予遗传构建物而不给予促进剂，即使用不含促进剂的制剂，所用的给药方法为不将遗传构建物与促进剂联用。
本发明中传递给细胞的核酸分子可以作为蛋白质的遗传模板，所述蛋白用作预防性和/或治疗性免疫接种剂。在较好的实施方案中，核酸分子包含在动物细胞内转录和翻译所述蛋白编码区必需的调控序列。
本发明可用于免疫接种个体以抵抗病原，例如病毒、原核生物和病原性真核生物，例如单细胞病原生物和多细胞寄生物。本发明特别适用于免疫接种个体以抵抗感染细胞的病原和无包被(not encapculated)病原，例如病毒、淋病、李司忒菌属和志贺菌属等原核生物。此外，本发明还可用于免疫接种个体以抵抗病原体，这些病原体在其生命周期内有一阶段是胞内病原。本文所用术语“胞内病原体”指这样的病毒或病原生物，其繁殖或生命周期中至少部分存在于宿主细胞内，并由此产生或导致产生病原蛋白。表1列出了根据本发明可制备针对性疫苗的某些病毒科和属。在疫苗中可使用这样的DNA构建物，它们所含DNA序列编码的多肽具有至少一个表位与表中病原抗原上的表位相同或基本相似。而且，本发明还可用于免疫个体以抵抗其它病原体，包括原核和真核的原虫病原，以及多细胞寄生物，例如表2所列的那些。
为了生产提供抗病原感染保护作用的基因疫苗，必需在基因构建物中包括编码免疫原性蛋白(作为靶蛋白)的基因编码序列，所述的蛋白能够引起针对它的保护性免疫应答。不论病原是胞内感染(对此，本发明尤其适用)还是胞外感染，不可能所有的病原性抗原都引发保护性应答。因为DNA和RNA都较小，而且较容易生产，本发明还提供了多价病原性抗原免疫接种的额外优点。用于基因疫苗的基因构建物可以包括编码多种病原性抗原的基因物质。例如，可将数个病毒基因包括在一个构建物中，由此提供了多种靶标。
表1和表2列出了部分病原性因子或生物的名单，可以制备针对它们的基因疫苗以保护个体避免被它们所感染。在某些优选实施方案中，免疫个体抵抗病原的方法针对的是HIV、HTLV或HBV。
本发明的另一方面内容提供了一种给予基础广泛的保护性免疫应答来抵抗以超增殖性疾病为特征的超增殖性细胞的方法，还涉及治疗超增殖性疾病患者的方法。术语“超增殖性疾病”指以细胞的超增殖为特征的疾病或紊乱。超增殖性疾病的例子包括各种形式的癌症和牛皮癣。
已经发现，将包含编码免疫原性“超增殖细胞”相关蛋白核苷酸序列的基因构建物引入个体细胞，结果在个体的受免疫细胞内生成了这些蛋白。术语“超增殖性蛋白”指与超增殖性疾病相关的蛋白。为了用于抗超增殖性疾病免疫接种，需给予个体包含编码超增殖性疾病相关蛋白核苷酸序列的基因构建物。
为了使超增殖相关蛋白成为有效的靶免疫原，该蛋白必需只在超增殖细胞内产生，或在超增殖细胞内的产生水平高于正常细胞。靶抗原包括这样的蛋白、其片段和肽，至少包含一个上述蛋白中的表位。有时，超增殖相关蛋白是编码某蛋白的基团发生突变的产物。突变基因编码的蛋白与正常蛋白几乎相同，仅因细微的氨基酸序列差异产生了一个正常蛋白上没有的表位。这样的靶蛋白包括由诸如myb，myc，fyn之类致癌基因和转位基因bcr/abl，ras，src，p53，neu，trk编码的蛋白和EGRF。除了作为靶抗原的癌基因产物之外，用于抗癌治疗和保护性治疗的靶蛋白还包括B细胞淋巴瘤产生的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，它们在一些实施例中也用作靶抗原来治疗自身免疫病。还可以使用其它肿瘤相关蛋白作为靶蛋白，例如在肿瘤细胞内含量很高的蛋白，包括单克隆抗体17-1A识别的蛋白和叶酸结合蛋白。
虽然本发明可用于免疫个体以抵抗一种或多种形式的癌症，本发明尤其适用于对个体进行预防性免疫接种，所述个体具有发展成某种癌症的倾向或曾经患有癌症因而怀疑复发。遗传学和基因技术以及流行病学的发展使得确定个体发生癌症的可能性和进行这方面的风险评估成为可能。采用遗传筛选和/或家族健康史，有可能预测某个体发生数种癌症中任何一种的可能性。
相类似的，那些已经患上了癌症的个体和接受治疗去除癌症的或处于缓解期的个体尤其易于复发。作为治疗方法的组成部分，为了战胜复发，可以针对已确诊的癌症对个体进行免疫接种。这样，一旦得知某个体曾患有某种癌症并有复发的危险，他们可以经免疫接种使得免疫系统作好准备以抵抗任何将出现的癌症。
本发明提供了一种治疗超增殖性疾病患者的方法。在这种方法中，引入基因构建物起着免疫治疗的作用，即引导和促进个体的免疫系统抵抗产生靶蛋白的超增殖细胞。
本发明提供了治疗自身免疫病患者的方法，即提供基础广泛的保护性免疫应答，抵抗与自身免疫相关的靶抗原，它包括细胞受体和产生针对“自身”的(self-derected)抗体的细胞。
T细胞介导的自身免疫病包括类风湿关节炎(RA)，多发性硬化症(MS)，Sjogren综合征，肉样瘤病，胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，自身免疫甲状腺炎，反应性关节炎，僵硬性脊椎炎，硬皮病，多肌炎，皮肌炎，牛皮癣，脉管炎，韦格纳氏肉芽肿病，节段性回肠炎和溃疡性结肠炎。上述疾病的特征均在于T细胞受体结合内源性抗原，由此引发与自身免疫病有关的炎性级联反应。针对T细胞可变区的免疫接种将引发包括CTL在内的免疫应答，消灭那些T细胞。
就RA而言，已经特性描述了数种参与该疾病的T细胞受体(TCR)的特异性可变区。这些TCR包括Vβ-3，Vβ-14，Vβ-17和Vα-17。这样，用编码至少一个以上蛋白的DNA构建物免疫接种，将引发针对参与RA的T细胞的免疫应答。参见Howell，M.D.等，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810921-10925；Paliard，X.等，1991 Science 253，325-329；Williams.W.C.等1992.J.Clin.Invest.90326-333；以上均被本文纳为参考。
就MS而言，已经特性描述了数种参与该疾病TCR的特异性可变区。这些TCR包括Vβ-7和Vα-10。这样，用编码至少一个以上蛋白的DNA构建物免疫接种，将引发针对参与MS的T细胞的免疫应答。参见Wucherpfennig，K.W.等，1990 Science2481016-1019；Oksenberg，J.R.等，1990 Nature 345344-346；以上均被本文纳为参考。
就硬皮病而言，已经特性描述了数种参与该疾病TCR的特异性可变区。这些TCR包括Vβ-6，Vβ-8，Vβ-14和Vα-16，Vα-3C，Vα-7，Vα-14，Vα-15，Vα-16，Vα-28和Vα-12。这样，用编码至少一个以上蛋白的DNA构建物免疫接种，将引发针对参与硬皮病的T细胞的免疫应答。
为了治疗T细胞介导的自身免疫病患者，尤其是TCR可变区尚待特性分析的疾病患者，可以进行滑液活检。可以提取含有T细胞的样品，用标准技术鉴定其TCR的可变区。利用以上信息就可以制备基因疫苗。
B细胞介导的自身免疫病包括狼疮(SLE)，格雷夫斯病，重症肌无力，自身免疫溶血性贫血，自身免疫血小板减少症，哮喘，冷球蛋白血症原发性胆管硬化和恶性贫血。上述疾病的特征均在于抗体结合内源抗原，并引发与自身免疫病相关的炎性级联反应。用针对这些抗体的可变区疫苗免疫将引发包括CTL在内的免疫应答，由此消灭产生这些抗体的B细胞。
为了治疗B细胞介导的自身免疫病患者，必需鉴定出参与自身免疫活性的那些抗体的可变区。可以进行活检，获取炎症部位的抗体样品。用标准技术鉴定这些抗体的可变区。利用这一信息就可以制备出基因疫苗。
以SLE为例，某抗原被认为是DNA。这样，可以对接受抗SLE免疫的患者的血清筛选抗DAN抗体，然后制备出包括编码血清中抗DNA抗体可变区的DNA构建物的疫苗。
TCR和抗体的可变区的一般结构特征是众所周知的。一般可用已知技术来找到编码特定TCR或抗体的DNA序列，所述技术可参见Kabat等，1987，Sequenceof Proteins of Immunological Interest U.S.Department of Health and Human Services，Bethesda MD，本文将其纳为参考。此外，克隆抗体的功能性可变区的常用方法可参见Chaudhary，V.K.等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871066，本文将其纳为参考。
除利用可表达形式的免疫调节蛋白编码序列来改进基因疫苗外，本发明还涉及改进的减毒活疫苗和利用重组载体传递编码抗原的外源基因的改良疫苗。减毒活疫苗和利用重组载体传递外源抗原的疫苗的实例可参见美国专利4,722,848；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734和5,482,713，以上均被本文纳为参考。本发明提供的基因构建物包括编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，所述序列与可在受接种者体内发挥功能以有效表达的调控序列操作性连接。将基因构建物掺入减毒活疫苗和重组疫苗中，产生本发明所述的改进疫苗。
本发明提供了一种免疫接种个体的改良方法，它包括将基因构建物作为疫苗组合物的组成部分传递给个体的细胞，所述的疫苗组合物包括DNA疫苗，减毒活疫苗和重组疫苗。基因构建物包括编码免疫调节蛋白并与可在受免疫者体内发挥功能引发表达的调控序列操作性连接。改良的疫苗可产生加强的细胞免疫反应。
在本发明的部分内容中，编码人免疫调节蛋白的核酸分子是作为治疗基因传递的，即不同时给予靶免疫原或编码免疫原性靶蛋白的核酸分子。这种基因疗法由于推动免疫应答的免疫调节蛋白的功能而引起。
作为治疗基因而传递的基因构建物是编码人IL-12的核酸分子，这样的基因构建物以质粒为佳。也可考虑其它基于核酸的载体，例如重组病毒、重组微生物和线性核酸分子，这些对于本领域一般技术人员来说都是熟知的。用来给予个体，将摄入个体组织并表达的质粒是众所周知的。考虑到的重组载体包括重组牛痘病毒载体，重组腺病毒载体和重组逆转录病毒载体。考虑到的重组微生物包括重组BCG载体和重组沙门菌载体。可将线性核酸分子和质粒DNA分子包裹在微球体和脂质体内。
在某些优选实施方案中，编码人免疫调节蛋白的质粒是如前所述的基因构建物。从本质上说，可以将同样的组合物和方法用于基因治疗，(所述的基因编码人免疫调节蛋白)，如同包含编码人免疫调节蛋白的基因构建物的基团免疫组合物和方法所述的那样，其区别在于基因治疗组合物不包括免疫靶蛋白的编码序列。本发明公开的内容旨在参照上述基因构建物说明编码人免疫调节蛋白的基因治疗。将用上述基因构建物来说明基因治疗，所述构建物包括编码人免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与在个体内表达所必需的调控元件操作性连接。可将这样的构建物给予个体来改变和/或推动免疫应答。
例如，可以传递IL-12来治疗过敏、癌症、自身免疫病或感染患者。编码IL-12的基因构建物与或不与促进剂一起给予。在某些实施方案中，该基因构建物是与一种或多种前述促进剂联用的。在部分实施方案中，此基因构建物单独传递，不含任何促进剂。在某些优选实施方案中，编码IL-12的基因不与任何促进剂在一起。在部分实施方案中，此基因构建物是利用无针注射器给予的。在某些实施方案中，编码IL-12的基因是利用微粒来传递的。部分实施方案中，编码IL-12的基因在传递时无任何固体粒子。
本发明所述的药物组合物，即基因疫苗或基因治疗组合物，包含1ng至1000μg的DNA。在某些优选实施方案中，该组合物包含10ng至约800μg的DNA。在某些优选实施方案中，该组合物包含0.1至500μg的DNA。在部分优选实施方案中，该组合物包含1至350μg的DNA。在某些优选实施方案中，该组合物包含25至250μg的DAN。在某些优选实施方案中，该组合物包含约100μg的DNA。
本发明药物组合物是根据给药方式来配制的。本领域一般技术人员可方便地配制出包含基因构建物的药物组合物。如果选用肌内注射来给药，宜使用等渗制剂。一般说来，用于调节渗透压的添加剂包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。有时，以使用磷酸盐缓冲液之类的等渗溶液为宜。稳定剂有明胶和白蛋白。在某些实施方案中，制剂中加有血管收缩药。本发明药物制品无菌而且无热原。
本发明方法可用于人和兽。所以，本发明涉及给哺乳动物、鸟类和鱼类的基因免疫。本发明方法特别适用于包括人、牛、绵羊、猪、马、狗和猫在内的哺乳动物。
本发明揭示了一种新的免疫调节剂，人BL1。其DNA序列和预计的氨基酸序列见图14。该蛋白及其片段与将免疫原引入个体的疫苗组合物同时使用时能加强免疫应答。术语“免疫调节性片段”指BL1的片段，它比图14中的全长序列短，但保留了全长化合物的免疫调节活性。根据本发明，BL1基因序列的传递将产生免疫调节作用。在某些实例中，虽然没有测得蛋白质的表达，但是免疫应答仍然受到共传递的影响，这表明传递BL1 DNA是调节和引导免疫应答的关键步骤。如前所述，本发明公开内容旨在揭示BL1 DNA在不考虑蛋白质产生的免疫调节性组合物和方法中的用途。因此，本发明公开内容涉及采用BL1 DNA和包含它的载体作为免疫调节剂，和在免疫调节组合物中作为主要活性药物或作为与免疫原或编码免疫原的DNA联用的辅剂，用于操纵和引导免疫应答。
BL1 DNA编码的蛋白可以分离和纯化；可以产生结合该蛋白抗体的杂交瘤；编码该蛋白的cDNA先被分离、测序、掺入到包括表达载体的载体中，这些载体被引入宿主细胞然后重组表达蛋白。将编码免疫原的载体与上述载体共给予将加强抗该免疫原的免疫应答。
BL1的发现为设计和应用加强、推动和引导免疫应答的疫苗方案提供了手段。
分离编码BL1的cDNA可用作起始材料来构建能够产生BL1或其免疫调节性片段的重组表达载体。将该cDNA导入到包括表达载体的载体内，将载体引入宿主细胞，然后重组表达该蛋白。可将核酸分子或其片段用作探针来检测BL1编码序列的存在。这类探针特异性地与BL1编码序列杂交。术语“特异性BL1序列”在此指BL1特有的序列。所含核苷酸序列与编码BL1的cDNA特异性片段互补的核酸分子可用作反义分子和引物来分别抑制mRNA的转录和扩增遗传序列。
BL1由图14中的cDNA编码，并具有图14中的预定氨基酸序列。BL1编码序列可常规合成，BL1蛋白可用重组DNA方法来生产或用标准蛋白质合成技术来合成。
采用标准技术和容易得到的起始材料，可以制备出编码BL1的核酸分子。本发明涉及包含编码BL1核苷酸序列的分离的核酸分子。本发明涉及包含编码图14中氨基酸序列或其免疫调节性片段的核苷酸序列的分离的核酸分子。在部分实施方案中，该核酸分子由编码BL1的核苷酸序列构成。在部分实施方案中，该核酸分子包含图14编码序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，该核酸分子由图14中的核苷酸序列构成。本发明的分离核酸分子可用于制备构建物和重组表达载体。
BL1的特异性探针或引物具有至少16个核苷酸，以至少24个为宜。这些探针或引物通过标准杂交技术用于筛选cDNA文库。
编码BL1的cDNA可用来设计PCR引物，用于扩增核酸序列。PCR技术为本领域一般技术人员所常用，它在诊断方面的应用是众所周知而且得到了认可的。实施PCR技术的方法参见“PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplication”，Innis，M.A.等编辑，Academic Press Inc.，San Diego，CA(1990)，本文将其纳为参考。PCR技术的应用参见“聚合酶链反应”Erlich，H.A.等编辑，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，本文将其纳为参考。
有些简单的规则有助于设计出有效的引物。典型的引物长18-28个核苷酸，g+c组成占50％至60％。最好，整个引物都与它必需与之杂交的序列互补。较好的是，引物产生100至200碱基对的PCR产物。但是，有可能产生50碱基对至10kd或更长的产物。
PCR技术能够迅速产生核酸序列的多份拷贝，它是通过提供与一个核酸分子中的序列杂交的5’端和3’端引物，并提供游离核苷酸和酶，该酶用游离核苷酸填入与两引物之间核苷酸序列互补的碱基，由此产生DNA的互补链。该酶将填充引物毗邻的互补序列。如果5’端和3’端的引物都与核酸分子同一片段互补链上的核苷酸序列杂交，结果是特定双链产物的指数扩增。如果只有一条引物与核酸分子杂交，线性扩增将产生不同长度的单链产物。
本发明涉及包含编码BL1核苷酸序列的载体或重组表达载体，BL1具有图14的氨基酸序列。术语“重组表达载体”在此指这样的质粒、噬菌体、病毒颗粒或其它载体，它们含有被引入合适的宿主后引导BL1编码序列表达所必需的遗传元件。本领域一般技术人员可用标准技术和容易得到的起始材料将编码BL1的核酸分子插入表达载体中，该编码序列与必需的调控序列操作性连接。表达载体是众所周知而且容易购得的。表达载体的实例包括质粒、噬菌体、病毒载体和其它核酸分子或含有可用于转化宿主细胞和促进编码序列表达的媒质的核酸分子。在部分实施方案中，该重组表达载体包含图14中的核苷酸序列。本发明的重组表达载体最好是质粒。
本发明涉及包含重组表达载体的宿主细胞，所述载体包括编码BL1的核苷酸序列。在部分实施方案中，宿主细胞包含一重组表达载体，该载体包含图14的核苷酸序列。用于生产蛋白质重组表达系统的宿主细胞是众所周知而且容易购得的。这些宿主细胞的实例包括诸如大肠杆菌之类的细菌细胞，以S.cerevisiae为例的酵母细胞，以S.frugiperda为例的昆虫细胞，以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为例的非人哺乳动物组织培养细胞，和以Hela细胞为例的人组织培养细胞。
在部分实施方案中，本领域一般技术人员能够利用熟知的技术将DAN分子插入市售的用于常用表达系统的表达载体中。例如市售质粒pSE420(Invitrogen，San Diego，CA)可用来在大肠杆菌中生产BL1。市售质粒pYES2(Invitrogen，SanDiego，CA)可用来在S.cerevisiae酵母菌株中的生产。市售MAXBACTM全杆状病毒表达系统可用来在昆虫细胞内的生产。市售质粒pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen.San Diego.CA)可用于在哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞中的生产。本领域一般技术人员可利用这些市售表达载体和系统或其它，利用常规技术和容易购得的起始材料来生产hVIP。(参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning aLaboratory Mannual，第二版，Cold Spring Harbor Press(1989)，本文将其纳为参考)。这样，所需的蛋白即可以在原核系统内生产也可以在真核系统内生产，产生多种加工形式的蛋白质。
本领域一般技术人员可利用其它市售表达载体或系统，或利用已知方法和容易购得的起始材料来生产载体。适用于多种宿主，包含必需的调控序列(例如启动子和聚腺苷酸化信号，最好还有加强子)的表达系统很容易得到，而且是本领域已知的。参见Sambrook等，Molecular Cloning a Laboratory Mannual，第二版，ColdSpring Harbor Press(1989)。
包含编码BL1的DNA的表达载体被用于转化相容性宿主，然后培养该宿主，并将其保持在可发生外源DNA表达的条件下。根据本领域技术人员所知，通过裂解细胞或从培养液中由培养物回收如此生产出的本发明的蛋白。本领域一般技术人员可用熟知的技术来分离上述表达系统产生的BL1。利用上述特异性结合BL1的抗体从天然来源中纯化BL1的方法也可同样用于纯化重组DNA技术生产的BL1。
基因构建物的实例包括与启动子操作性连接的BL1编码序列，所述启动子如前所述在人体内具有功能，或在构建物将转染的细胞系内具有功能。组成型启动子实例包括巨细胞病毒或SV40的启动子。诱导型启动子实例包括小鼠乳腺白血病病毒或金属蛋白启动子。
除了用重组技术生产BL1外，还可用自动化肽合成仪来生产BL1。该技术为本领域一般技术人员所熟知，并可用于生产具有取代的衍生物，这种取代是DNA编码蛋白生产中无法提供的。
编码BL1的核酸分子可利用多种传递成分中的任意一种来传递，例如直接给予质粒，重组病毒表达载体或其它合适的传递手段，从而影响它们向个体或相容性宿主细胞内的引入和在其中的表达。一般说来，病毒载体可以是DNA病毒，例如重组腺病毒和重组牛痘病毒，或RNA病毒，例如重组逆转录病毒。其它重组载体包括能够感染细胞并表达重组基因的原核生物。除了重组载体之外，也可考虑使用其它传递成分，例如包埋在脂质体中、运铁蛋白介导的转染和其它受体介导的方法。本发明旨在包括上述其它形式的表达载体和其它合适的传递手段，它们具有同等的作用，而且已经陆续为本领域所知道。
本发明还涉及非人转基因哺乳动物，它们具有包含编码BL1核苷酸序列的重组表达载体。用于生产重组蛋白的非人转基因动物，所需的表达载体以及生产转基因动物的方法，这些都是已经熟知的。一般说来，转基因动物包含重组表达载体，载体中含有编码BL1核苷酸序列，它与一个哺乳动物细胞特异性启动子操作性连接，因而使得编码序列只在哺乳动物细胞内表达，并可从动物的乳汁中回收由此表达的重组蛋白。本领域一般技术人员根据以下参考文献采用标准技术即可生产出生产BL1的转基因动物，所述文献有1989年10月10日授权于Wagner的美国专利4,873,191和1988年4月12日授权于Leder的美国专利4,736,866，以上均由本文纳为参考。较适合的动物是山羊、绵羊或啮齿类动物(具体地说是大鼠和小鼠)。
可以将BL1蛋白或用于其生产的表达载体配制成药物组合物。
本发明的药物组合物包括与核酸分子联合的传递组份，还包含药学上可接受的载体或媒介，例如盐水。任何能够成功传递核酸的介质均可使用。本领域技术人员很容易理解，可用于本发明的药学上可接受的介质是多种多样的。合适的药学上可接受的运载体可参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，A.Osol，这是本领域的一本标准参考书，本文在此纳为参考。本发明的药物组合物可以通过各种方式来给予，只要能够使得活性药物到达靶细胞。由于口服时，肽易被消化，为获得良好的吸收，一般使用肠胃外给药，例如静脉、皮下、透皮、肌内。静脉输注可以借助于输液泵来进行。可以将本发明的药物组合物配制成乳液。或者，可以配制成气雾剂以适合鼻内用或吸入。有时，也可能需要局部使用。
给药剂量随以下因素而不同药物动力学特征；给药方式和途径；接受者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度；联用疗法的种类；治疗频度。通常，肽剂量为每50kg体重1至3000mg以每50kg体重10至1000mg为宜；以每50kg体重25至800mg更好。一般，每人每日分1到6次给予8至800mg，或利用缓释剂型，可有效达到所需的效果。局部使用的制剂包括透皮贴、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴液、栓剂、喷雾剂、液化剂和粉末。可能必需或者宜用常规药学载体、水溶液、粉末或油性基质、增稠剂等。口服组合物包括粉末或药丸、以水或非水介质配成的悬浮液或溶液、胶囊、小药囊或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散辅助剂或粘合剂也许需要。用于肠胃外、静脉、鞘内或脑室内给药的组合物可包含无菌水溶液(其中含有缓冲剂)、稀释剂和其它合适的添加剂，以无菌和无热原为佳。根据本发明，适用于静脉给药的药物组合物是无菌且无热原的。
就肠胃外给药而言，本发明的肽可以配制成溶液、悬浮液、乳液或冷冻干燥粉末，并与药学上可接受的肠胃外载体结合。这类媒介例如水、盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水相媒介，例如固定的油。媒介或冻干粉末中可含有维持渗透压的添加剂(例如氯化钠、甘露醇)和维持化学稳定性的添加剂(例如缓冲剂和保存剂)。制剂用常规技术灭菌。例如，如下制备注射用肠胃外组合物将1.5％(重量)活性成份溶解在0.9％氯化钠溶液中。
本发明药物组合物可以通过各种方法给予，只要该方法能够使活性药物到达动物体内药物的作用部位。本发明药物组合物可经许多途径给药，这取决于所需的治疗是局部性的还是全身性的，还取决于需要治疗的部位。给药途径可以是局部(包括眼用、阴道用、直肠用、鼻用、透皮)，口服或肠胃外。肠胃外包括静脉滴注、皮下、腹膜内或肌内注射、肺给药(例如吸入或吹入)，或者鞘内或者脑室内给药。
产生结合BL1抗体的杂交瘤，此抗体本身被用于分离和纯化BL1以及包含它的蛋白质复合物。此外，抗体是BL1活性的特异性抑制剂。采用已知技术和容易购得的起始材料，可将特异性结合hVIP的抗体用来从天然来源中纯化该蛋白质。这类抗体在用DNA重组技术生产蛋白时还可用来从产物中纯化该蛋白质。
本文所用术语“抗体”指完整的全抗体、其Fab片段和F(ab)2片段。完整的全抗体包括鼠单克隆抗体之类的单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。结合某表位的抗体可用于以常规技术(例如亲和性层析，即抗体不与其它蛋白发生交叉反应)从天然来源或重组表达系统中分离和纯化蛋白质。这类抗体可以用来检测样品中有否所述的蛋白质，并确定细胞是否表达蛋白质。
抗体的生产方法，完整全抗体、其Fab片段和F(ab)2片段的蛋白质结构，以及编码这些分子的基因序列的组成都是熟知的，可参见Harlow，E.和D.Lane(1988)ANTBODIESA Laboratory Mannual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY，本文将其纳为参考。简而言之，给小鼠注射BL1或其免疫原性片段。取出小鼠的脾脏，分离脾细胞，与无限繁殖小鼠细胞融合。培养该杂交细胞或杂交瘤，挑选出分泌抗体的细胞。分析抗体，如果发现它特异性地结合BL1，则对产生该抗体的杂交瘤进行培养以连续生产提供抗体。
以下实施例包括了本发明内容的代表性实施例。这些实施例并不是为了限定本发明的范围，而是为了进行说明。此外，本发明的许多内容可用以下实施例来概括。但是，以上说明并不是要限定本发明的范围，而是将本发明的许多内容说清楚。本领域一般技术人员很容易理解本发明其它方面和实施方案。
实施例实施例1以下列出了可用于本发明方法的构建物。载体pBade.puro用作起始材料来产生后面列出的多种构建物，它最早是由Morgenster，J.P和H.Land构建和报道的，参见1990，Nucl.Acids Res.18(12)3587-3596，本文将其纳为参考。pBade.puro质粒尤其适合用来在哺乳动物细胞内表达外源基因。将需要表达的DNA序列插入克隆位点，处于Moloney鼠白血病病毒(Mo MuLV)的长末端重复序列(LTR)启动子调控之下。该质粒含有抗嘌呤霉素选择标记。
质粒pBa.Vα3-IL-12含有2.7kb EcoRI基因组片段，该片段编码T细胞受体Vα3结构域，该结构域包含L、V和J片段，它们被克隆入pBabe.puro的EcoRI位点，该质粒还含有IL-12编码序列，该序列与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接。T细胞受体衍生的靶蛋白用于免疫接种以抵抗和治疗T细胞介导的自身免疫病和clonotypic T细胞淋巴瘤和白血病。
质粒pBa.gagpol-vpr-IL-12包含克隆入pBabe.puro中的gag/pol和vif基因。缺失vpr基因。该质粒含有这些HIV病毒基因，它们编码HIV靶蛋白，还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列，该质粒可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。HIV DNA序列公开在Reiz，M.S.，1992 AIDS Res.Human Retro.81549中，本文将其纳为参考。该序列可向GenbankNoM17449获取，本文将其纳为参考。
质粒pM160含有2.3kb的PCR片段，该片段编码HIV-I/3B包膜蛋白，和rev/tat基因，它们都被克隆在pMAMneoBlue中。而nef区缺失。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，和与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列，该质粒可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。HIV-1/3B的DNA序列公开在Fisher，A.，1985 Nature 316262中，本文将其纳为参考。该序列可向Genbank NoK03455获取，本文将其纳为参考。
质粒pBa.VL-IL-12含有PCR片段，该片段编码抗DNA抗体的VL区，克隆在pBabe.puro的XbaI和EcoRI位点上，还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。该抗体衍生的靶蛋白是靶蛋白的一个实例，可用于免疫接种以抵抗和治疗B细胞介导的自身免疫病和clonotypic B细胞淋巴瘤和白血病。克隆抗体上功能性可变区的通用方法可参见Chaudhary，V.K.等，1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA871066，本文将其纳为参考。
质粒pOspA.B-IL-12含有编码博氏疏螺旋体Borrelia burgdorferi引起莱姆(Lym)病的螺旋体的OspA和OspB抗原的编码区，克隆在pBabe.puro的BamHI和Sall位点上，该质粒还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。参见Williams，W.V.等，1992 DNA and Cell.Biol.11(3)207，本文将其纳为参考。该质粒含有这些病原基因，它们编码靶蛋白，可用于免疫接种抵抗莱姆病。
质粒pBa.Rb-G-IL-12含有PCR产生的片段，它编码狂犬病毒G蛋白，该片段克隆在pBabe.puro的BamHI位点上，该质粒还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。含有编码狂犬G蛋白的该病原基因的质粒可用于免疫接种以抵抗狂犬病。其DNA序列公开在Genebank NoM32751中，本文将其纳为参考。还可参见；Anilionis A.等，1981 Nature 294275，本文将其纳为参考。
质粒pBa.HPV-L1包含PCR产生的片段，编码人乳头瘤病毒(HPV)(包括HPV毒株16、18、31和33)的L1衣壳蛋白，克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位点，另外还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。该质粒可用于免疫接种以抵抗HPV感染和由它引起的癌症。其DNA序列公开在Genebank NoM15781中，本文将其纳为参考。另可参见Howley，P.，1990Fields Virology，Vol.2，Channock，R.M等编辑，第58章，1625；Shah，K.和P.Howley，1990 Fields Virology，Vol.2，Channock，R.M等编辑，第59章，以上均被本文纳为参考。
质粒pBa.HPV-L2-IL-12含有PCR产生的片段，这些片段编码人乳头瘤病毒(HPV)(包括HPV毒株16、18、31和33)的L2衣壳蛋白，克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位点上，另外还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。该质粒可用于免疫接种以抵抗HPV感染和由它引起的癌症。其DNA序列公开在Genebank NoM15781中，本文将其纳为参考。另可参见Howley，P.，1990 Fields Virology，Vol.2，Channock，R.M等编辑，第58章，1625；Shah，K.和P.Howley，1990 Fields Virology，Vol.2，Channock，R.M等编辑，第59章，以上均被本文纳为参考。
质粒pBa.MNp7-IL-12包含PCR产生的片段，它编码HIV MN gag(核心蛋白)序列的编码区，克隆在pBabe.puro的BamHI位点上，另外还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。Reiz，M.S.，1992 AIDS Res.Human Retro.81549，本文将其纳为参考。该序列可向Genebank NoM17449获取，本文将其纳为参考。
质粒pGA732-2-IL-12含有GA733-2肿瘤表面抗原，从结肠癌细胞系SW948克隆到pCDM8载体内(Seed，B.和A.Aruffo，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA843365，本文将其纳为参考)的BstXI位点上，另含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。该肿瘤相关性靶蛋白代表了可用于免疫接种以抵抗和治疗癌症之类超增殖性疾病的靶蛋白。GA733-2抗原是抗结肠癌的有用靶抗原。有关GA733-2抗原的报道参见Szala，S.等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA873542-3546，本文将其纳为参考。
质粒pT4-pMV7-IL-12含有编码人CD4受体的cDNA，克隆在pMV7载体的EcoRI位点上，另含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。CD4靶蛋白可用于免疫接种以抵抗和治疗T细胞淋巴瘤。质粒pT4-pMV7可向AIDS Repository，Catalog No.158获取。
质粒pDJGA733-IL-12含有GA733肿瘤表面抗原，克隆在pBabe.puro的BamHI位点上，另外还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。该肿瘤相关性靶蛋白代表了用于免疫接种以抵抗和治疗癌症之类超增殖性疾病的靶蛋白。GA733抗原是抗结肠癌的有用靶抗原。
质粒pBa.RAS-IL-12含有Ras编码区，它先从pZIPneoRAS中亚克隆并克隆到pBabe.puro的BamHI位点上，另外还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。该Ras靶蛋白代表了细胞质信号分子。克隆Ras的方法参见Weinberg 1984 Mol.Cell.Biol.41577，本文将其纳为参考。Ras编码质粒可用于免疫接种以抵抗和治疗癌症之类的超增殖性疾病；尤其是，Ras相关性癌症，例如膀胱、肌肉、肺、脑和骨的癌症。
质粒pBa.MNp55-IL-12含有PCR产生的片段，它编码p55编码区，其中包括HIV MN gag前体(核心蛋白)序列，克隆在pBabe.puro的BamHI位点上，另外还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。Reiz，M.S.1992，AIDS Res.Human Retro.81549，本文将其纳为参考。该序列可向Genebank NoM17449获取，本文将其纳为参考。
质粒pBa.MNp24-IL-12含有PCR从pMN-SF1模板上产生的片段，编码p24编码区，其中包括HIV MN gag全编码区，克隆在pBabe.puro的BamHI位点和EcoRI位点，另外还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。Reiz，M.S.，1992，AIDS Res.Human Retro.81549，本文将其纳为参考。该序列可向Genebank NoM17449获取，本文将其纳为参考。
质粒pBa.MNp17-IL-12含有PCR产生的片段，它编码p17编码区，其中包括HIV MN gag(核心蛋白)序列，克隆在pBabe.puro的BamHI位点和EcoRI位点，另外还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。Reiz，M.S.，1992，AIDS Res.Human Retro.81549，本文将其纳为参考。该序列可向Genebank NoM17449获取，本文将其纳为参考。
质粒pBa.SIVenv-IL-12含有一段2.71kb的PCR产生的片段，是从pBR322中含SIV239的构建物扩增得到的，克隆在pBabe.puro的BamHI位点和EcoRI位点，另外还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。该质粒可向AIDS Research and Reference Reagent Program获取，目录号为No.210。
质粒pcTSP/ATK.env-IL-12含有编码完全HTLV包膜编码区的PCR产生的片段，这些编码区来自HTLV-1/TSP和ATK分离株，亚克隆在pcDNA1/neo载体中，另外还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。质粒pcTSP/ATK.env报道于1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA853599，本文将其纳为参考。HTLV env靶蛋白可用于免疫接种以抵抗和治疗HTLV感染和T细胞淋巴瘤。
质粒pBa.MNgp160-IL-12含有一段2.8kb的PCR产物片段，是由pSP72中含MNenv的构建物扩增得到的，克隆在pBabe.puro的BamHI位点和EcoRI位上点，另外还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。Reiz，M.S.，1992 AIDS Res.Human Retro.81549，本文将其纳为参考。此序列可向Genebank No.M17449获取，本文将其纳为参考。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。
质粒pC.MNp55-IL-12含有一段1.4kb的PCR产生的片段，是由MN分离株的gag结构域扩增得到的，克隆在pCEP4载体内。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因和与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。该质粒可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。Reiz，M.S.，1992 AIDS Res.Human Retro.81549，本文将其纳为参考。序列可向Genebank No.M17449获取，本文将其纳为参考。序列可向Genebank No.M17449获取，本文将其纳为参考。
质粒pC.Neu-IL-12含有一段3.8kb的DNA片段，该片段含有切割自LTR-2/erbB-2构建物并亚克隆到pCEP4载体的人neu癌基因编码区，另含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。pC.Neu质粒由DiFiore在1987，Science 237178中进行了报道，本文将其纳为参考。neu癌基因靶蛋白代表了可用作免疫接种以抵抗和治疗癌症之类超增殖性疾病(尤其是结肠、乳房、肺和脑部的癌)的靶蛋白的生长因子受体。
质粒pC.RAS-IL-12含有一段1.4kb的DNA片段，该片段所含的ras癌基因编码片段首先从pZIPneoRAS中亚克隆到pCEP4的BamHI位点上，另含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。pC.RAS质粒的报道参见Weinberg 1984 Mol.Cell.Biol.41577，本文将其纳为参考。该ras靶蛋白代表了细胞质信号分子。Ras编码质粒可用于免疫接种以抵抗和治疗癌症之类超增殖性疾病；尤其是与ras相关的癌症，例如膀胱、肌肉、肺、脑和骨部位的癌。
质粒pNLpuro-IL-12含有HIV gag/pol和SV40-puro插入物。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，还含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。它可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。实施例2质粒pCSIL-12含有与CMV启动子和SV40聚腺苷酸化序列操作性连接的IL-12编码序列。实施例3本发明某些实施例中的组合物可以通过将质粒pCSIL-12与以下质粒中任何一种组合来制备。
质粒pBa.Vα3是一个7.8kb的质粒，含有一段2.7kb的EcoRI基因组片段，它编码T细胞受体包含L、V和J节段的Vα3结构域，克隆在pBabe.puro的EcoRI位点。T细胞受体衍生的靶蛋白可用于免疫接种以抵抗和治疗T细胞介导的自身免疫病和clonotypic T细胞淋巴瘤和白血病。
质粒pBa.gagpol-vpr是一个9.88kb的质粒，含有HIV/MN的gag/pol和vif基因，克隆在pBabe.puro内。缺失vpr基因。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。HIV DNA序列公开在Reiz.M.S.，1992，AIDS Res.Human Retro.81549，本文将其纳为参考。序列可向Genebank No.M17449获取，本文将其纳为参考。
质粒pM160是一个11.0kb的质粒，含有2.3kb的编码HIV-I/3B包膜蛋白和rev/tat基因的PCR片段，克隆在pMAMneoBlue中。缺失nef基因。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV和AIDS。HIV-1/3B的DNA序列公开在Fisher，A.，1995 Nature 316262中，本文将其纳为参考。序列可向Genebank No.K03455获取，本文将其纳为参考。
质粒pBa.VL是一个5.4kb的质粒，含有编码抗DNA抗体的VL区的PCR片段，克隆在pBabe.puro的XbaI和EcoRI位点上。抗体衍生的靶蛋白代表了可用于免疫接种以抵抗和治疗B细胞介导的自身免疫病和clonotypic B细胞淋巴瘤和白血病的靶蛋白。克隆抗体的功能性可变区的通用方法可参见Chaudhary，V.K.等，1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA871066，本文将其纳为参考。
质粒pOspA.B是一个6.84kb的质粒，含有编码博氏疏螺旋体(引起莱姆病的螺旋体)的OspA和OspB抗原的编码区，克隆在pBabe.puro的BamHI和SalI位点上。Williams，W.V.等，1992，DNA和Cell.Biol.11(3)207，本文将其纳为参考。该质粒包含编码靶蛋白的病原基因，可用于免疫接种抵抗莱姆病。
质粒pBa.Rb-G是一个7.10kb的质粒，含有编码狂犬病毒G蛋白的PCR产物片段，克隆在pBabe.puro的BamHI位点上。含有编码狂犬G蛋白病原基因的该质粒，可用于免疫接种抵抗狂犬病。该DNA序列公开在Genebank No.M32751中，本文将其纳为参考。还可参见Anilionis，A.等，1981，Nature 294275，本文将其纳为参考。
质粒pBa.HPV-L1是一个6.80kb的质粒，含有编码人乳头瘤病毒(HPV)(包括HPV毒株16、18、31和33)的L1衣壳蛋白的PCR片段，克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位点上。该质粒可用于免疫接种以抵抗HPV感染和由其引起的癌症。此DNA序列公开在Genebank No.M15781中，本文将其纳为参考。还可参见Howley，P.，1990，Feilds Virology，Vol.2，Channock，R.M等编辑，第58章1625和Shah，K.和P.Howley，1990，Feilds Virology，Vol.2，Channock，R.M等编辑，第59章，均被本文纳为参考。
质粒Ba.HPV-L2是一个6.80bk的质粒，含有编码人乳头瘤病毒(HPV)(包括HPV毒株16、18、31和33)L2衣壳蛋白的PCR片段，克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位点上。该质粒可用于免疫接种以抵抗HPV感染和由它引起的癌症。此DNA序列公开在Genebank No.M15781中，本文将其纳为参考。还可参见Howley，P.，1990，Feilds Virology，Vol.2，Channock，R.M等编辑，第58章1625和Shah，K.和P.Howley，1990，Feilds Virology，Vol.2，Channock，R.M等编辑，第59章，均被本文纳为参考。
质粒pBa.MNP7是一个5.24kb的质粒，含有包括HIV MN gag(核心蛋白)序列的p7编码区的PCR片段，克隆在pBabe.puro的BamHI位点上。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。Reiz，M.S.，1992 AIDS Res.Human Retro.81549，本文将其纳为参考。该序列可向Genbank NoM17449获取，本文将其纳为参考。
质粒pGA733-2是一个6.3kb的质粒，含有GA-733-2肿瘤表面抗原，从结肠癌细胞系SW948中克隆到pCDM8载体(参见Seed B.和A.Aruffo，1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA843365，本文将其纳为参考)的BstXI位点上。该肿瘤相关性靶蛋白代表了用于免疫接种以抵抗和治疗癌症之类超增殖性疾病的靶蛋白。GA733-2抗原是有用的抗结肠癌靶抗原。GA733抗原的报道参见Szala.S等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 873542-3546，本文将其纳为参考。
质粒pT4-pMN7是一个11.15kb的质粒，含有编码人CD4受体的cDNA，克隆在pMV7载体的EcoRI位点上。CD4靶蛋白可用于免疫接种以抵抗和治疗T细胞淋巴瘤。质粒pT4-pMN7可向AIDS Repository获取，目录号No.158。
质粒pDJGA733是一个5.1kb的质粒，含有GA733肿瘤表面抗原，克隆在pBabe.puro的BamHI位点。该肿瘤相关性蛋白代表了用于免疫接种以抵抗和治疗癌症之类超增殖性疾病的靶蛋白。GA733抗原是有用的抗结肠癌靶抗原。
质粒pBa.RAS是一个6.8kb的质粒，含有Ras编码区，首先从pZIPneoRAS中亚克隆并克隆到pBabe.puro的BamHI位点上。该ras靶蛋白代表了细胞质信号分子。克隆ras的方法可参见Weinberg 1984 Mol.Cell.Biol.41577，本文将其纳为参考。ras编码质粒可用于免疫接种以抵抗和治疗癌症之类超增殖性疾病；尤其是与ras有关的膀胱、肌肉、肺、脑和骨的癌症。
质粒pBa.MNp55是一个6.38kb的质粒，含有编码p55编码区的PCR片段，该编码区包括HIVNM gag前体(核心蛋白)序列，克隆在pBabe.puro的BamHI位点上。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。Reiz，M.S.，1992 AIDS Res.Human Retro.81549，本文将其纳为参考。该序列可向Genbank NoM17449获取，本文将其纳为参考。
质粒pBa.MNp24是一个5.78kb的质粒，它含有PCR从pMN-SF-1模板上产生的片段，编码p24编码区，其中包括HIV MNgeg全编码区，克隆在pBabe·puro的BamHI和EcoRI位点上。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDA。Reiz，M.S.，1992 AIDS ResHumanRetro.81549，纳入本文作参考。序列可向Genebark No17449获取，也纳入本文作参考。
质粒pBa.MNp17是一个5.5kb的质粒，含有一段编码包括HIV gag(核心蛋白)序列在内的p17编码区的PCR片段，克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位点。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种以抵抗和治疗HIV感染和AIDS。Reiz，M.S.，1992 AIDS Res.Human Retro.81549，本文将其纳为参考。该序列可向Genbank NoM17449获取，本文将其纳为参考。
质粒pBa.SIVenv是一个7.8kb的质粒，含有一段从pBR32内含SIV239的构建物扩增得到的2.71PCR片段，克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位点上。该质粒可向AIDS Research and Reference Reagent Program获取；目录号210。
质粒pcTSP/ATK.env是一个8.92kb的质粒，含有的一段编码完整的HTLV-1/TSP和ATK分离株的HTLV包膜编码区的PCR片段，亚克隆在pcDNA1/neo载体中。有关质粒pcTSP/ATK.env的报道参见1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA853599，本文将其纳为参考。HTLV env靶蛋白可用于免疫接种以抵抗和治疗HTLV感染和T细胞淋巴瘤。
质粒pBa.MNgp160是一个7.9kb的质粒，含有一段从pSP72中含MNenv的构建物扩增得到的2.8kb PCR片段，克隆在pBabe.puro的BamHI和EcoRI位点。Reiz，M.S.，1992 AIDS Res.Human Retro.81549，本文将其纳为参考。该序列可向Genbank NoM17449获取，本文将其纳为参考。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种抵抗和治疗HIV感染和AIDS。
质粒pC.MNp55是一个11.8kb的质粒，含有一段从MN分离株gag区扩增得到的1.4kb PCR片段，克隆在pCEP4载体内。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种抵抗和治疗HIV感染和AIDS。Reiz，M.S.，1992AIDS Res.Human Retro.81549，本文将其纳为参考。该序列可向GenbankNoM17449获取，本文将其纳为参考。
质粒pC.Neu是一个14.2kb的质粒，含有一段包含人neu癌基因编码区的3.8kb DNA片段，该编码区切割自LTR-2/erbB-2构建物，亚克隆在pCEP4载体内。有关pC.Neu质粒的报道参见DiFiore 1987 Science237178，本文将其纳为参考。neu癌基因靶蛋白代表了一种生长因子受体，它们可用作靶蛋白来免疫接种抵抗和治疗癌症之类的超增殖性疾病；尤其是结肠、乳房、肺和脑部的癌症。
质粒pC.RAS是一个11.7kb的质粒，含有一段包含ras癌基因编码区的1.4kbDNA片段，该编码区先从pZIPneoRAS中亚克隆到pCEP4载体的BamHI位点。有关质粒pC.RAS的报道参见Weinberg 1984 Mol.Cell.Biol.41577，本文将其纳为参考。ras靶蛋白代表了细胞质信号分子。编码ras的质粒可用于免疫接种抵抗和治疗癌症之类超增殖性疾病，尤其是膀胱癌、肌肉癌、脑癌和骨癌等与ras相关的癌症。
质粒pNLpuro是一个15kb的质粒，含有HIV gag/pol和SV40-puro插入片段。该质粒含有编码HIV靶蛋白的这些HIV病毒基因，可用于免疫接种抵抗和治疗HIV感染和AIDS。实施例4为了改进疫苗，特异性地引导免疫应答可能是十分重要的。据报道，在包括传染病、自身免疫病和过敏在内的多种疾病类型中，免疫反应的类型(Th1还是Th2)是十分重要的。为了诱导抗HIV感染的强而稳定的细胞介导免疫应答，在免疫时联用免疫佐剂和免疫调节剂(例如细胞因子)可加强细胞免疫应答，并引导抗原依赖性免疫应答由Th2型向Th1型转变。
为了基因改进体内的免疫应答，将人细胞因子基因(IL-12或GM-CSF基因)与HIV构建物一同传递。对因这些基因与HIV-1DNA疫苗共同传递而引起的免疫应答进行了检查，并对细胞免疫的诱导(尤其是抗病毒的CTL应答)进行了研究。
分别将IL-12和GM-CSF基因克隆到表达载体内，处于CMV启动子调控下。然后该基因质粒表达盒和HIV-1的DNA疫苗盒(参见前文，或美国专利申请08/642,045，申请于1996年5月6日，本文将其纳为参考)一起注射到小鼠体内。对这些基因佐剂盒共同免疫接种在抗原特异性免疫应答强度方面的免疫学效果进行了分析。见到与IL-12共传递降低了体液应答，同时，与IL-12共接种中度加强了体液应答。用IL-12或GM-CSF共接种都发现了抗原特异性T辅助细胞增殖的增加。重要的是，用直接CTL试验观察到IL-12基因共同给予诱导了显著的CTL。相反，在同样的研究中，采用GM-CSF基因，几乎没有观察到对CTL诱导的任何效果。这些结果证明使用DNA疫苗产生了特异性免疫应答。这些结果还显示该方法在以分子特异性方式阐明基本免疫功能方面的用途。材料和方法小鼠6至8周龄的Balb/c雌小鼠购自Harlan Sprague Dawley，Inc.(indianapolis，Indiana)。这些小鼠被关在温控，光控(light-cycled)室内。根据National Institute ofHealth和University of Pennsylvania的指导原则看护它们。试剂制备DNA疫苗制剂pCMN160、pCGN160、pCGag/Pol。将IL-12和GM-CSF基因克隆和插入到带有CMV启动子的表达载体内。重组牛痘苗(vMN462，vVK1，VVgag和vSC8)得自NIH AIDS Research and Reference Reagent Program。DNA接种使用改进的DNA接种法，它能够运用质粒在体内传递基因而提高体内的蛋白质表达水平。具体地说，在Balb/c小鼠股四头肌中用27号针头注射0.25％的布吡卡因-HCl(Sigma，St.Louis)溶液100μl。2天后，在同一注射部位注射50μg所研究的DNA构建物(以磷酸盐缓冲液配成溶液)。各种基因表达盒的共同给予包括在注射前将所选的质粒混合。FACS分析细胞(1×105)用FACS缓冲液(含1％BSA和0.1％叠氮钠的PBS)洗涤3次，在饱和条件下，与FITC和/或PE交联mAbs一起冰上孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤3次后，用FACScan(Becton Dickinson)分析细胞。ELISA如现有技术所述，以0.1M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)将gp120或gp41(Intracel Corp.Cambridge，MA)配成2μg/ml溶液，加入微滴孔中吸附4℃放置过夜。用PBS-0.05％吐温-20洗涤测试板，用3％BSA的PBS溶液和0.05％吐温-20于37℃封闭1小时，然后与制造商建议的HRP-交联山羊抗小鼠IgG或IgA(Sigma，St.Louis，MO)稀释液一起孵育。用TM缓冲液(Sigma)洗涤和冲洗(develope)测试板。在Dynatech MR5000测试板读数仪上读取450nm处的OD值。T细胞增殖试验收获小鼠的脾脏，从中制备淋巴细胞。将分离的细胞悬液重悬至1×106细胞/毫升。在96孔平底板的每孔中加入100μl的等份，内含1×105细胞。各孔加入10μl浓度为20μg/ml的蛋白质，一式三份。这些细胞在5％CO2中37℃培养3天。每孔中加入1μCi氚化胸腺嘧啶，细胞37℃培养12至18小时。收获测试板，在β测试板读数仪(Wallac，Turku，Finland)上测定掺入的氚化胸腺嘧啶的量。为了确保细胞健康，10μg/ml PHA被用作多克隆刺激剂阳性对照。细胞毒性T淋巴细胞试验进行一次5小时的铬51释放CTL试验。从脾脏收获淋巴细胞，去除红细胞，并用新鲜的培养基洗涤数次，制备成效应细胞。用3×106个p815细胞37℃感染16小时，制备牛痘苗感染的靶细胞。靶细胞用100μCi/ml的Na251CrO4进行90分钟的标记，并用于培养刺激脾细胞37℃4至6小时。进行CTL测试，效应细胞∶靶细胞(E∶T)之比从50∶1至12.5∶1。收获上清液，在LKB Clini Gammaγ-计数仪上计数。用以下公式计算特异性裂解的百分比100×{实验释放-自发释放}÷{最大释放-自发释放}最大释放是在含1％ Triton X-100的培养基中裂解靶细胞而测定的。如果“自发释放”计数超过“最大释放”的20％，则该试验视为无效。结果小鼠脾脏的表型共同接种之后，各试验组小鼠的脾脏看起来不相同。所以，对收集的所有接种小鼠的脾脏进行称重和目测。图1A显示了这些动物脾脏的重量。尽管注射单一制剂的对照小鼠与非接种对照小鼠的脾脏重量相近(约100mg)，注射了Gag/Pol+IL-12基因的小鼠，其脾脏的重量是对照脾脏的3倍。另一方面，用Gag/Pol+GM-CSF接种的小鼠，其脾脏没有增大。需要指出的是，单用Gag/Pol或单用IL-12接种的小鼠，都没有造成脾脏的明显增大。只有当共同注射抗原和IL-12基因盒时，才造成脾肿大，提示这是两种基因产物的组合效果。而且，如图1B所示，来自Gag/Pol+IL-12脾脏的淋巴细胞数量是对照脾脏的3倍。同样，与对照脾脏细胞数相比，Gag/Pol和IL-12免疫的小鼠脾脏在淋巴细胞数量上都没有明显的增加。代表性脾脏的照片见图2。与各自的重量相对应，抗原+IL-12脾脏比其它脾脏大数倍。根据现有报道，IL-12的p35链在许多类型细胞中都有组成型表达。所以，可能只有一条p40链和DNA免疫原造成了这一效果。为了检测这一点，将IL-12异二聚体基因(p35和p40)之一分别与Gag/Pol共同给予。如图3所示，两者都没有引起脾脏肿大。以上数据表明，将IL-12的p35和p40基因一起与DNA疫苗共同注射，引起脾脏肿大和相应的脾细胞数量增加。以上数据支持以下观点，这些质粒在体内进入了同一个细胞，协调了所有三种组成p35链、p40链和独特抗原的转录，从而诱导了所见的生物学变化。FACS分析为了进一步对肿大脾脏的细胞组成进行特征分析而进行了FACS分析。如表3显示，用针对CD3的抗体和针对B220、CD4和CD8的抗体进行脾细胞双染色的FACS。根据结果显示，与非免疫对照脾脏中的B细胞百分比(25.43％)相比，包膜+IL-12或Gag/Pol+IL-12构建物免疫接种组的B220阳性B细胞百分比略为下降(分别为17.46％和21.62％)。此外，与非免疫对照脾脏中的百分比(13.69％)相比，包膜+IL-12或Gag/Pol+IL-12构建物免疫组的CD8+T细胞百分比略为升高(分别为21.72％和16.88％)。体液应答收集免疫小鼠的抗血清，用ELISA分析抗HIV-1抗原的特异性抗体反应。图4显示的是免疫接种后第28天所收集样品的ELISA结果。当稀释度为1∶100时，pCEnv+pCGM-CSF免疫组的抗血清显示出的抗HIV-1 gp120蛋白的抗体反应比单用pCEnv免疫的组大。另一方面，经过同样长的时间，pCEnv+pCIL-12免疫组的体液反应明显较小。在重复实验中，IL-12普遍抑制特异性抗体反应达10-20％，而GM-CSF则表现出正作用。这样的体液应答可能与FACS分析所确定的脾细胞中B细胞数量所见的变化有关。T细胞增殖T辅助淋巴细胞的激活和增殖在通过扩展抗原激活的B细胞诱导体液免疫应答和通过扩展CD8+细胞毒性T淋巴细胞诱导细胞免疫应答中起着重要作用。DNA免疫后2周，收集免疫小鼠的脾脏，分离出淋巴细胞。然后如前所述测试这些细胞的T细胞增殖。图5显示用编码HIV-1 gag/pol(pCGag/Pol)的DNA疫苗免疫的小鼠和用pCGag/Pol和IL-12或GM-CSF共同免疫的小鼠的增殖试验结果。重组p55蛋白和20μg/ml凝集素PHA被用作多克隆刺激剂阳性对照。如所显示，幼稚小鼠脾脏对照组有低背景水平的增殖反应，稀释度为1∶2时的刺激指数为1.2，单用pCGag/Pol免疫组可观察到中等水平的增殖反应，稀释度1∶2时的刺激指数为9.2。用pCGag/Pol和IL-12基因共同免疫的组和用pCGag/Pol和GM-CFS共同免疫的组，可观察到增殖反应的急遽增大，刺激指数分别为17.1和15.6。没有体外刺激的CTL试验为了进一步研究细胞活性的增强而进行了直接CTL试验。如前所述免疫小鼠，收集脾脏细胞，但是不对脾细胞进行体外刺激诱导进行CTL试验。在收获脾脏的当天进行该试验，测定特异性痘苗感染和非特异性痘苗感染靶细胞的铬释放。pCGag+IL-12免疫的脾细胞观察到特异性CTL活性显著增加(图6)。单用IL-12基因盒免疫的对照组结果靶细胞特异性溶解不超过背景水平。此外，单用Gag/Pol免疫50∶1效∶靶比，可观察到低水平的特异性溶解(3％)。相反，Gag/Pol+IL-12共同给予的标本在效∶靶比为50∶1时，特异性裂解为62％，而在12.5∶1时，滴度为9％。另一方面，用Gag/Pol质粒和GM-CSF质粒免疫结果没有可测得的CTL活性。从用HIV-1包膜构建物和细胞因子基因共同免疫的小鼠也可观察到相似的结果(图7)。单用包膜和用包膜+GM-CSF免疫的组只有低水平的特异性CTL，分别为4％和1％。另一方面，包膜+IL-12免疫组的CTL活性显著增强，溶解率达59％。在Gag/Pol和包膜共同免疫组中(图6和图7)，对用非相关抗原表达痘苗制备的靶细胞进行同样的CTL试验，结果没有明显的CTL溶解。所以，抗原和IL-12DNA共同免疫引起的CTL活性显著加强并不是由NK活性引起的，因为以上结果是抗原特异性的。讨论据报道，用不同的治疗靶标和传递技术，体内接种DNA疫苗都产生了免疫应答。
许多疫苗的重要特征可能在于诱导细胞介导的免疫力。例如，在自然感染过程中，抗HIV-1的CTL反应出现相当早，而且暂时性地呈现与病毒定居点的建立相关联性。CTL T细胞在寻靶和摧毁病毒感染细胞而清除病毒中起着重要作用。通过推进特异性CTL反应来引导抗病毒蛋白的免疫反应将使得诱导针对病毒内多种靶抗原的更加广谱的免疫应答成为可能。比起AIDS患者，在健康的受感染患者中更易测得抗病毒的CTL活性，而且据报道，特异性CTL随着病程的进展而降低，这清楚地将CTL反应与较好的临床状态联系了起来。在这方面，一种具有高特异性CTL应答和低抗体应答的南美猕猴能够受到保护免受嵌合性SIV/HIV(SHIV)的攻击，而具有低CTL和高抗体应答的猴虽能控制病毒的复制，但是不能受到完全保护。特异性CTL反应似乎对维持HIV-1感染在无症状阶段有所贡献。所以，通过DNA免疫接种诱导强烈的体内HIV-1特异性CTL应答可能在最终保护宿主避免HIV感染的发展中起重要作用。
将HIV-1的DNA疫苗通过与作为基因佐剂的IL-12和GM-CSF共同传递能够增强免疫应答，尤其是CTL应答，对此进行了研究。将IL-12基因和GM-CSF基因克隆到表达载体内，和HIV-1的DNA疫苗盒一起注射给小鼠。编码IL-12的质粒与HIV-1的DNA疫苗共同免疫接种，引起抗原特异性CTL应答的显著增强。与GM-CSF的共传递表现为增强体液免疫，而与IL-12的共传递则抑制体液反应约20％。
将细胞因子基因佐剂与HIV-1的DNA疫苗共传递具有许多显著的免疫效应。首先，注射DNA疫苗和IL-12基因的小鼠其脾脏的大小和重量几乎是对照脾脏的3倍。此外，这些脾脏中的白细胞是对照脾脏中白细胞数量的2倍以上。以上结果与以前的发现相一致，即小鼠体内给予重组IL-12引起脾肿大。Car等发现，在野生型小鼠中，注射IL-12引起脾脏重量增加5倍。以上IL-12在野生型小鼠中诱导产生的变化与IFN-γ血清水平的显著增高有关。但是，在IFN-γ受体缺陷型小鼠中，给予IL-12也诱导产生类似质量的脾肿大(达正常大小的2倍)。这些早期研究都报道注射IL-12蛋白引起脾脏肿大。体内传递少量IL-12基因诱导的脾肿大程度与已发表的用重组IL-12蛋白作的研究相当。据报道，给小鼠体内注射重组IL-12可能对接受注射的小鼠有一定程度的毒性作用，例如体重减轻甚至死亡。重要的是注意到，共同给予IL-12基因诱导了脾脏肿大，但是接受注射的小鼠没有任何可见的不良变化。这提示，和质粒接种造成的自然加工持续性低水平传递可能在临床上是有利的。本发明在此展示了一种用于诱导明显的系统性免疫应答但是没有毒性作用的DNA传递方法。
除了诱导脾脏肿大之外，通过IL-12与DNA疫苗的共同给予可以操纵从Th2到Th1的特异性免疫应答。在这方面，DNA疫苗与IL-12的共同传递降低特异性抗体反应，而与GM-CSF的共传递则加强特异性抗体反应。以上结果与先前所报道的IL-12在引导免疫应答由Th2型向Th1型转变中是关键细胞因子相一致。这些抗体的结果也与脾细胞的FACS数据相符，在所述数据中，用免疫原(HIV-1包膜或Gag/Pol)和IL-12基因免疫的小鼠其B220+B细胞百分数减少。此外，与细胞因子共传递可观察到对T细胞明显的抗原特异性刺激作用。抗原特异性增殖是CD4辅助T细胞诱导的良好指证，这看来是两种细胞因子具有的特性。
为了进一步阐明对DNA共免疫的T细胞应答而进行了不对收获的脾细胞进行体外刺激的直接CTL试验。CTL应答的加强是证明能够将DNA免疫引起的免疫应答从由Th2转向Th1的重要证据。用DNA疫苗与IL-12共同免疫的动物组观察到特异性CTL应答的明显增强。总之，体内共同给予编码免疫原的基因和引起Th1型免疫应答的关键细胞因子IL-12的基因，经T细胞增殖和CTL试验测定，表现出加强的细胞免疫应答。
共同传递免疫学上重要的分子的基因来帮助引导和操纵免疫应答的类型和方向(例如引导反应由Th2型转化为Th1型)可用来在临床上引发更有效的免疫应答。IL-12基因与DNA免疫原的共同给予中等程度地抑制了体液应答，而极大地加强了CTL应答。此外，还诱导了脾脏肿大，这是给予小鼠体内重组IL-12蛋白的特征。所以，本发明表明，体内传递DNA既可用于生产新一代更有效的疫苗又可作为对免疫功能机理进行分子解析的分析工具。实施例5为了进一步体内引导免疫应答，对广谱细胞因子基因和HIV-1 DNA免疫原性构建物共传递对免疫应答的诱导和调节作用进行了研究。选择与细胞因子基因共传递是因为细胞因子在免疫作用中起着重要的调节和信号作用。虽然除免疫系统细胞以外的许多细胞可产生和释放细胞因子，但淋巴细胞产生的细胞因子因其在调节免疫系统细胞的作用而具有特殊的意义。例如，IL-1、IFN-γ和IL-12的存在将Th0前体细胞激活成为Th1炎性T细胞。另一方面，IL-4、IL-5或IL-10的释放使得Th0前体细胞转变成武装的Th2辅助细胞。此外，前炎性细胞因子IL-1、IFN-α和IFN-β在诱发炎性反应中起着积极作用。
对前炎性细胞因子(IL-1α、TNF-α和IFN-β)、Th1细胞因子(IL-2、IL-15和IL-18)和Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)共同传递的作用进行了研究。具体地说，这些前炎性细胞因子、Th1和Th2细胞因子的基因被分别克隆到表达载体中，处于巨细胞病毒(CMV)启动子调控之下。然后将这样的基因质粒表达盒与HIV-1D DNA疫苗盒如前文所述一起注射小鼠体内。分析了这些基因佐剂盒共注射对抗原特异性免疫应答的方向和强度产生的免疫学作用。
将细胞因子基因与DNA免疫原基因盒共注射能够调节抗原特异性免疫应答。更广泛地说，这种将作为媒介的具有免疫学重要意义的基因共同传递的策略能够产生新一代的DNA疫苗，增强了它们在临床效率和应用上的潜能。
材料和方法DNA质粒采用标准技术和容易购得的起始材料制备表达HIV-1包膜蛋白和gag/pol蛋白的DNA疫苗构建物pCEnv和pCGag/Pol。用标准技术和容易得到的起始材料将人IL-1α、IL-2、IL-5、IL-10、IL-15、TNF-α、TNF-β和小鼠的IL-4和IL-18的基因克隆到pCDNA3表达载体(Invitrogen，Inc.，San Diego，CA)中。据报道，人IL-1α、IL-2、IL-5、IL-10、IL-15、TNF-α和TNF-β在小鼠细胞内具有活性。使用Qiagen Maxi Prep试剂盒(Qiagen，Santa Clara，CA)在细菌内生产质粒DNA并纯化。试剂和细胞系人横纹肌肉瘤(RD)和小鼠肥大细胞瘤p815细胞系获自ATCC(Rockville，MD)。表达HIV-1包膜、gag/pol和半乳糖苷酶的的重组疫苗vMN462、vVK1和vSC8获自NIH AIDS Research and Reference Reagent Program。HIV-1包膜肽(RIHIGPGRAFYTTKN)是用标准技术和容易得到的起始材料合成的。重组Pr55或gp120蛋白得自Quality Biological(Gaithersburg，MD)。重组p24蛋白购自Intracell(Cambridge，MA)。针对IL-1α、IL-2、IL-5、IL-10、IL-15、TNF-α和TNF-β的抗体得自R&D Systems(Minneapolis，MN)。细胞因子构建物的表达在转染入RD细胞后，采用免疫沉淀法或细胞因子ELISA来证实细胞因子构建物的表达。细胞经PBS洗涤两次，在无血清、无甲硫氨酸和半胱氨酸的DMEM中饿养一小时，然后用200μCi/ml(1,200Ci/mmole)的35S蛋白标记混合物(NEN/DuPont)标记。在0-5ml的RIPA缓冲液(50mM Tris HCl pH7.6；150mMNaCl；0.2％Triton X-100；0.2％脱氧胆酸；0.1％SDK和1mM PMSF)中冰上裂解标记细胞，然后15000rpm离心10分钟进行澄清。澄清后的裂解液与相关抗体(R&D Systems)冰上孵育90分钟。抗原抗体复合物加入A蛋白琼脂糖凝胶，40℃振摇混合90分钟。用含有高浓度盐和BSA的缓冲液充分洗涤后将蛋白质沉淀重悬在50μl 1X样品缓冲液中，100℃加热3至5分钟。取一份蛋白质样品进行SDS 12％-PAGE。为了进行荧光自显影，将凝胶浸泡在含10％甘油的1M水杨酸钠中15分钟，干燥，用Kodak X-omat-AR胶片进行放射性自显影。收集转染的RD细胞的上清液，用细胞因子ELISA试剂盒(Pharmingen，San Diego，CA和R&DSystem)测试表达。小鼠DNA接种在6至8周龄balb/c小鼠(Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis，IN)的股四头肌部位注射50μg各种感兴趣的DNA构建物，这些构建物配制在磷酸盐缓冲液(PBS)和0.25％布吡卡因-HCl(Sigma，St.Louis，MO)中。各种基因表达盒的共同给予包括将所选的各种质粒混合，然后注射，每次100μg。ELISAp24或gp120蛋白以0.1碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)中稀释成2μg/ml，取50μl4℃过夜吸附到微滴板的孔上。测试板用PBS-0.05％吐温-20洗涤两次，在37℃用3％BSA 0.05％吐温-20的PBS溶液封闭1小时。用0.05％吐温-20稀释小鼠抗血清，并37℃孵育1小时，然后与HRP-交联山羊抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)一起孵育。用3’3’5’5’TMB(Sigma)缓冲液洗涤和冲洗。在Dynatech MR5000测试板读数仪上读取测试板在450nm处的光密度值。T辅助细胞增殖试验从脾脏收获淋巴细胞，去除红细胞并用新鲜培养液介质洗涤数次制备效应细胞。将分离细胞重悬成5×106细胞/毫升。取含5×105细胞的100μl等份立即加入96孔平底微滴板的各孔内。在测试孔中加入重组Pr55或gp120蛋白，最终浓度分别为5μg/ml和1μg/ml，一式三份。这些细胞在5％CO2中37℃培养3天。在各孔中加入1μCi氚化胸腺嘧啶，细胞37℃培养12至18小时。收获测试板，在β测试板读数仪(Wallac，Turku，Finland)上测定掺入的氚化胸腺嘧啶量。用以下公式计算刺激指数刺激指数(SI)＝(试验值/自发值)自发值的测试孔内包括作为非相关蛋白对照的10％胎牛血清。此外，用pCEnv或对照免疫的动物一般对Pr55蛋白的SI为1。相类似，pCGag/pol或对照一般对gp120蛋白的SI为1。为了确保细胞健康，将PHA或con A(Sigma)用作多克隆刺激物阳性对照。PHA或con A对照样品的SI为20至40。细胞毒性T细胞试验用痘苗感染的靶细胞或肽处理过的靶细胞进行5小时的51铬释放CTL试验。分别进行了体外有效应物刺激和无效应物刺激的该试验。在体外刺激的试验中，用相关的痘苗(包膜的vMN462和gag/pol的vVK1)感染的细胞刺激效应细胞，并用0.1％戊二醛或1M的包膜特异性肽(RIHIGPGRAFYTTKN)，将5×106细胞/毫升在CTL培养基中固定4至5天。CTL培养基由1∶1的Iscove改进的Dulbecco培养基(Gibco-BRL，Grand Island，NY)和Hanks平衡盐溶液(Gibco-BRL)(含有10％胎牛血清(Gibco-BRL)和10％不含Con A(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA)的RAT-T-STIM)组成。在37℃以10至20的感染复数(MOI)对3×106个p815细胞进行5至12小时的感染，由此制备痘苗感染的靶细胞。将p815细胞与1μM浓度的肽一起孵育制备肽处理的靶细胞。进行标准铬释放试验，即用100μCi/mlNa251CrO4对靶细胞进行60至120分钟的标记，将该细胞与受刺激效应脾细胞一起37℃培养4至6小时。测定CTL溶解，效应细胞∶靶细胞(E∶T)之比从50∶1至12.5∶1。收获上清液，在LKB CliniGammaγ计数仪上计数。用以下公式测定特异性溶解百分比100×{试验释放量-自发释放量}÷{最大释放量-自发释放量}最大释放量是以含1％Triton X-100的培养液溶解靶细胞而测定的。如果“自发释放”超过“最大释放”的20％，则该试验视为无效。CD8+T细胞的补体溶解用抗CD8单克隆抗体(Pharmingen，San Diego，CA)处理，然后与兔补体(Sigma)一起37℃孵育45分钟，将CD8+T细胞从脾细胞中除去。
结果细胞因子基因盒的表达将细胞因子基因分别克隆到pCDNA3质粒表达载体内(图10)。通过对整个插入片段(在5’末端和3’末端)的序列分析来确认这些细胞因子表达盒。此外，将这些细胞因子体外转染到RD细胞内，根据前文的材料与方法部分所述，通过使用相关抗体的免疫沉淀或通过细胞因子ELISA来证实这些构建物的表达。细胞因子基因共同注射后的体液免疫应答收集用pCGag/po1免疫的小鼠的抗血清，用ELISA分析抗HIV-1抗原的特异性抗体应答。
在这些实验中，在当天和第14天，肌肉注射共同给予50μg的各种DNA。注射前，和注射后28天，小鼠(每组4只)放血，收集血清。作连续稀释1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600和1∶3200。ELISA的背景光密度低于0.015。重复这些实验结果相似。如数据所显示的，用抗p24 gag蛋白的ELISA测定了接种组的抗体的终点效价，还用抗gp120包膜蛋白的ELISA测定了接种组的抗体终点效价。以下数据是在DNA免疫后第28天收集的血清中产生的gag/pol-特异性抗体效价抗p24抗体效价单用pCGag/pol 400pCGag/pol+IL-1α 1600pCGag/pol+TNF-α 1600pCGag/pol+TNF-β 1600pCGag/pol+IL-23200pCGag/pol+IL-15 800pCGag/pol+IL-18 3200pCGag/pol+IL-43200pCGag/pol+IL-53200pCGag/pol+IL-10 1600与IL-2、IL-4、IL-5和IL-18共注射的组具有最高的终点效价水平。与单用pCGag/pol免疫的组相比，与IL-1α、TNF-α、TNF-β和IL-10共注射显著加强了体液免疫应答。用pCEnv免疫的组中，也观察到了类似的结果。
抗gp120抗体效价单用pCEnv 200pCEnv+IL-1α800pCEnv+TNF-α800pCEnv+TNF-β400pCEnv+IL-2 800pCEnv+IL-1 5400pCEnv+IL-1 8800pCEnv+IL-4 1600pCEnv+IL-5 1600pCEnv+IL-101600同样，与IL-4、IL-5和IL-10共注射的组的血清见有最高的终点效价水平。T辅助细胞的产生T辅助淋巴细胞的激活和增殖在诱导通过B细胞产生的体液免疫应答和通过CD8+毒性T细胞产生的免疫应答中起着重要作用。小鼠接受了两种DNA免疫(均为50μg)，间隔2周。在加强免疫注射后的第一周，将小鼠杀死，收获脾脏，分离淋巴细胞，测试T辅助细胞的增殖。前炎性细胞因子共注射用共注射pCEnv或pCGag/pol和前炎性细胞因子IL-1α、TNF-α和TNF-β小鼠的脾脏进行增殖试验。共注射前炎性细胞因子IL-12、TNF-α和TNF-β后，评价T辅助细胞的增殖反应，该实验方法如下所述。在第一次pCEnv DNA(均为50μg)免疫后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)进行加强免疫。在又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，进行抗重组gp120蛋白(最终浓度为5和1μg/ml)的测试。在第一次pCGag/pol和DNA(均为50μg)共注射后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)进行加强免疫。在又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，进行抗Pr55蛋白(最终浓度为5和1μg/ml)的测试。这些实验重复了2次，结果类似。得出以下数据
抗原特异性T细胞增殖反应gp120蛋白5μg/ml 1μg/ml单用pCEnv 2.2 1.3pCEnv+IL-1α2.3 0.1pCEnv+TNF-α6.1 2.7pCEnv+TNF-β3.1 1.8对照 0.5 0.2gp24蛋白5μg/ml 1μg/ml单用pCGag/pol 2.4 0.8pCGag/pol+IL-1α2.8 1.4pCGag/pol+TNF-α12.42.2pCGag/pol+TNF-β4.0 1.9对照 0.6 0.8以上数据显示，在对照组中有背景水平的增殖作用，在单用pCEnv或单用pCGag/pol免疫的组中有中等水平的增殖反应。即使与pCEnv或pCGag/pol共同注射了IL-1α的组，也没有引起T辅助细胞增殖反应的增加，但是pCEnv+TNF-β共注射的组导致T辅助细胞增殖反应的明显增强，当gp120蛋白浓度为5μg/ml时刺激指数为3.1。与此相似，当Pr55蛋白浓度为5μg/ml时，共注射pCGag/pol+TNF-β产生4.0的刺激指数。pCEnv+TNF-α和pCGag/pol+TNF-α共注射观察到甚至更高的T辅助细胞增殖水平，刺激指数分别为6.1和12.4(蛋白质浓度均为5μg/ml)。Th1细胞因子共注射对共传递Th1细胞因子IL-2、IL-15和IL-18进行了研究。pCEnv+IL-18和pCGag/pol+IL-18共注射组的刺激指数分别为4.4和10.0(蛋白浓度各为5μg/ml)。给小鼠共注射IFN-γ诱导性Th1细胞因子IL-12和IL-18后评价T辅助细胞的增殖反应，该实验方法如下。在第一次pCEnv和DNA(均为50μg)免疫后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，进行抗重组gp120蛋白(最终浓度为5和1μg/ml)的测试。在第一次pCGag/pol和DNA(均为50μg)免疫后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，进行抗Pr55蛋白(最终浓度为5和1μg/ml)的测试。这些实验重复了2次，结果类似。得出以下数据gp120蛋白5μg/ml 1μg/ml单用pCEnv 2.21.3pCEnv+IL-184.40.8pCEnv+IL-127.83.8对照 0.50.2gp24蛋白5μg/ml 1μg/ml单用pCGag/pol 2.40.8pCGag/pol+IL-1810.0 2.1pCGag/pol+IL-1212.0 3.8对照 0.60.8此外，pCEnv+IL-2和pCGag/pol+IL-2共注射的刺激指数分别为6.0和12.0(蛋白质浓度均为5μg/ml)。但是，共传递IL-15引起较为缓和的T辅助细胞增殖反应增强。给小鼠共注射IL-2受体依赖性Th1细胞因子IL-2和IL-15，然后评价T辅助细胞的增殖反应，该实验方法如下。在第一次pCEnv和DNA(均为50μg)免疫后两周，以相同的剂量给小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，进行抗重组gp120蛋白(最终浓度为5和1μg/ml)的测试。在第一次pCGag/pol和DNA(均为50μg)共注射后两周，以相同的剂量给小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，进行抗Pr55蛋白(最终浓度为5和1μg/ml)的测试。这些实验重复了2次，结果类似。得出以下数据
gp120蛋白5μg/ml 1μg/ml单用pCEnv 2.21.3pCEnv+IL-2 6.02.1pCEnv+IL-152.32.0对照 0.50.2gp24蛋白5μg/ml 1μg/ml单用pCGag/pol 2.40.8pCGag/pol+IL-2 12.0 2.5pCGag/pol+IL-152.60.6对照 0.60.8Th2细胞因子共注射除对前炎性细胞因子和Th1细胞因子共注射进行检测之外，还研究了Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-10与pCEnv和pCGag/pol共传递的效果。与单用pCEnv或pCGag/pol免疫的组相比，与IL-4或IL-5共注射的两组都表现出中等程度的T辅助细胞增殖反应加强。共注射以Th2细胞因子IL-5和IL-10后评价T辅助细胞增殖反应，此实验方法如下。在第一次pCEnv和DNA(均为50μg)免疫后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，进行抗重组gp120蛋白(最终浓度为5和1μg/ml)的测试。在第一次pCGag/pol和DNA(均为50μg)免疫后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，进行抗Pr55蛋白(最终浓度为5和1μg/ml)的测试。这些实验重复了2次，结果类似。得出以下数据gp120蛋白5μg/ml 1μg/ml单用pCEnv 2.2 1.3pCEnv+IL-4 3.8 2.9pCEnv+IL-5 2.4 1.8pCEnv+IL-104.5 2.3对照 0.5 0.2
gp24蛋白5μg/ml 1μg/ml单用pCGag/pol2.40.8pCGag/pol+IL-4 5.03.1pCGag/pol+IL-5 3.12.4pCGag/pol+IL-10 8.02.4对照 0.60.8共注射IL-10对T辅助细胞增殖的加强更明显，其刺激指数分别为4.5和8.0(蛋白质浓度均为5μg/ml)。细胞毒性T淋巴细胞的产生为了进一步研究细胞免疫作用的加强而进行了细胞毒性T淋巴细胞(CTL)试验，使用的是用pCEnv和pCGag/pol免疫的小鼠的脾细胞。小鼠接受两次DNA免疫(每次50μg)，间隔为2周。在加强免疫后一周，将小鼠处死取出脾脏，分离淋巴细胞，测试CTL反应。分别进行了两种试验，即先刺激和不刺激效应淋巴细胞，然后测试特异性和非特异性痘苗感染或肽处理靶细胞的铬释放。为了计算靶细胞的特异性溶解率，将特异性靶细胞(感染了vMN462或vVK1)溶解百分比减去非特异性靶细胞(感染了vSC8)溶解百分率。效应细胞体外刺激的CTL反应为了评价细胞毒性T淋巴细胞反应，在共注射各种细胞因子后得出以下数据抗原特异性CTL反应50∶1 25∶112.5∶1pCEnv 10％4％ 3％pCEnv+IL-1α 14％10％ 6％pCEnv+TNF-α 30％23％ 18％pCEnv+TNF-β 20％16％ 13％pCEnv+IL-2 22％16％ 4％pCEnv+IL-15 46％28％ 10％pCEnv+IL-12 35％24％ 19％pCEnv+IL-18 22％16％ 13％pCEnv+IL-4 4％ 4％ 7％pCEnv+IL-5 13％11％ 9％pCEnv+IL-10 13％8％ 3％对照3％ 2.0％ 3％50∶1 25∶112.5∶1pCGag/pol 12％11％ 7％pCGag/pol+IL-1α 16％8％ 1％pCGag/pol+TNF-α 29％20％ 7％pCGag/pol+TNF-β 12％13％ 3％pCGag/pol+IL-2 14％11％ 10％pCGag/po1+IL-15 30％21％ 7％pCGag/pol+IL-12 38％24％ 15％pCGag/pol+IL-18 19％15％ 4％pCGag/pol+IL-4 2％ 2％ 2％pCGag/pol+IL-5 0％ 3％ 2％pCGag/pol+IL-10 6％ 6％ 0％对照3.3％ 2.8％ 4.5％共注射前炎性细胞因子IL-1α、TNF-α和TNF-β后评价细胞毒性T淋巴细胞反应，在此实验中，在第一次DNA与pCGag/pol(均为50μg)共注射后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，用特异性痘苗(vVK1)和非特异性痘苗(vSC8)感染的靶细胞测试CTL反应。在第一次pCEnv和DNA(均为50μg)共注射后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，用特异性痘苗(vNM462)和非特异性痘苗(vSC8)感染的靶细胞测试CTL反应。这些实验重复了2次，结果类似。
共注射IFN-γ诱导的Th1细胞因子IL-12和IL-18后评价细胞毒性T淋巴细胞反应，在此实验中，在第一次DNA与pCGag/pol(均为50μg)共注射后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，用特异性痘苗(vVK1)和非特异性痘苗(vSC8)感染的靶细胞测试CTL反应。在第一次pCEnv和DNA(均为50μg)共注射后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，用特异性痘苗(vNM462)和非特异性痘苗(vSC8)感染的靶细胞测试CTL反应。这些实验重复了2次，结果类似。
共注射IL-2受体依赖性Th1细胞因子IL-2和IL-15后评价细胞毒性T淋巴细胞反应，在此实验中，在第一次DNA与pCGag/pol(均为50μg)共注射后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，用特异性痘苗(vVK1)和非特异性痘苗(vSC8)感染的靶细胞测试CTL反应。在第一次pCEnv和DNA(均为50μg)共注射后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离出淋巴细胞，用特异性痘苗(vNM462)和非特异性痘苗(vSC8)感染的靶细胞测试CTL反应。这些实验重复了2次，结果类似。
共注射以Th2细胞因子IL-5和IL-10后评价细胞毒性T淋巴细胞反应，在此实验中，在第一次DNA与pCGag/pol(均为50μg)共注射后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，用特异性痘苗(vVK1)和非特异性痘苗(vSC8)感染的靶细胞测试CTL反应。在第一次pCEnv和DNA(均为50μg)共注射后两周，以相同的剂量对小鼠(每组4只)加强免疫。又一周后，采集免疫小鼠脾脏，分离淋巴细胞，用特异性痘苗(vNM462)和非特异性痘苗(vSC8)感染的靶细胞测试CTL反应。这些实验重复了2次，结果类似。共注射前炎性细胞因子将pCEnv或pCGag/pol与前炎性细胞因子IL-1α、TNF-α和TNF-β共同注射小鼠，得到CTL试验结果的数据，从对照动物观察特异性杀伤的到背景水平，单用pCEnv免疫的动物表现出低水平的CTL反应。用pCEnv+IL-1α或pCEnv+TNF-β共注射，对CTL活性有中等程度的提高。另一方面，用pCEnv+TNF-α共注射后，可观察到对表达HIV包膜痘苗(vNM462)感染的靶细胞的特异性杀伤有更明显的加强。当效靶比(E∶T)为50∶1时，共注射pCEnv+TNF-α后，特异性靶细胞溶解率超过30％。与此类似，小鼠用pCGag/pol+TNF-α免疫后，对表达HIV-1gag/pol痘苗(vVK1)感染的靶细胞的抗原特异性CTL溶解显著加强(当E∶T为50∶1时的裂解率为29％)，而用pCGag/pol+IL-1α或pCGag/pol+TNF-β共注射只导致CTL反应的轻度增加。Th1细胞因子共注射研究了Th1细胞因子和DNA疫苗共同传递的效果。
获得单用pCEnv免疫和共注射了Th1细胞因子IL-12和IL-18小鼠的CTL试验结果。与共给予IL-12不同，共注射IL-18对CTL反应的增强更缓和。共给予IL-2也引起CTL反应的中等程度加强。另一方面，用pCEnv+IL-15共免疫后，观察到了CTL反应更显著的加强，特异性溶解率为46％。相类似的，经pCGag/pol++IL-15共注射的小鼠抗原特异性CTL溶解也显著加强(30％)。Th2细胞因子共注射在研究前炎性细胞因子和Th1细胞因子共传递的效果之外，还研究了共注射Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-10对CTL反应水平的作用。虽然与这些细胞因子的共注射加强了T辅助细胞增殖反应，但将IL-4、IL-5或IL-10与pCEnv或pCGag/pol共注射并不导致CTL反应的任何特异性加强作用。测定CTL反应中的I类MHC限制作用为了确定共注射TNF-α和IL-15引起的CTL反应增强是否缘于CD8+I类MHC限制性刺激，用HIV-1包膜肽(RIHIGPGRAFYTTNK)进行CTL试验，该肽已被证明是balb/c小鼠I类MHC限制性CTL的一个独特表位。小鼠接受两次各为50μg的DNA构建物免疫，间隔2周，在第二次免疫后1周，收获脾脏。用包膜特异性肽体外刺激脾细胞后进行CTL试验。与IL-15和TNF-α共注射后，见到CTL反应都显著加强，E∶T为50∶1时的特异性杀伤分别为25％和32％(图11)。在通过补体溶解从效应细胞群中去除CD8+T细胞后，测定CTL活性证实了这一观察。用50μg的各质粒免疫小鼠两次，间隔时间同上。进行CTL试验，一组如前所述处理效应细胞，另一组去除CD8+T细胞。如图11B所示，去除CD8+T细胞抑制了共注射IL-15和TNF-α后抗原特异性CTL的加强。以上结果显示，细胞毒活性的加强是抗原特异性的，I类MHC限制性的和CD8+T细胞依赖性的。直接CTL反应(不体外刺激效应细胞)对共注射IL-15和TNF-α诱导的直接CTL反应水平进行了研究，因为从这两个共给予组观察到了恒定的高水平CTL反应(进行了体外刺激)。在分离脾细胞的当天进行铬释放试验。与共注射IL-12所见的直接CTL不同，pCEnv与TNF-α或IL-15共注射后没观察到诱导直接CTL活性(图12)。
讨论任何免疫接种策略的总目标都是用最少的免疫接种诱导强烈而持久的病原特异性免疫应答。但是，一种病原与保护作用之间的关系可能随病因的变化而变化，而且，可以通过引导免疫应答来达到结局的改善。例如，认为高水平的特异性抗体应答对避免乙型肝炎病毒感染的保护作用十分重要，而避免淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染的保护作用则主要是由T细胞介导应答来介导的。可以通过调节所诱导免疫应答的方向和强度来改进DNA疫苗策略的设计，以使保护作用与靶病原之间的关系更为相宜。
作为一种新的免疫接种方法，核酸免疫已在多种动物模型中被证明，能在体内诱导抗原特异性体液免疫和细胞免疫应答。控制免疫应答的方向和强度的策略，可以生产出临床上更有效的疫苗。更好的控制由疫苗或免疫治疗产生的免疫应答的特定类型和方向可以通过与细胞因子和共刺激性分子之类免疫学上有重要意义的分子的基因共同传递来实现。
作为免疫网络的引发者和调节者，细胞因子在免疫反应和炎性反应中起着重要作用。根据它们在免疫系统的独特功能，这些细胞因子可以进一步分为前炎性细胞因子、Th1细胞因子和Th2细胞因子。前炎性细胞因子IL-1、TNF-α和TNF-β作为宿主对损伤和感染反应的起动者起着重要的作用。IL-1通过诱导T细胞产生IL-2和上调IL-2R间接激活T细胞。IL-1还通过诱导B细胞的分化、生长和IgG合成来影响B细胞。至少存在两种形式的IL-1，分别称为IL-1α和IL-1β，它们表现出相似的活性。TNF-α和TNF-β是密切相关的蛋白(氨基酸残基同源性约为30％)，它们结合相同的细胞表面受体。TNF-α是由活化的巨噬细胞、单核细胞和嗜中性细胞、活化的淋巴细胞和NK细胞产生的，而TNF-β则是由淋巴细胞产生的。TNF-α和TNF-β还牵涉到革兰阴性菌感染引起的败血性休克和类风湿关节炎。而且，TNF-α被认为在调节其它前炎性细胞因子中起着关键作用。
Th1细胞因子调节细胞或T细胞介导的免疫应答。IFN-γ、即原型Th1细胞因子是由Th1、CD8+和NK细胞产生的，而且已被证明具有抗病毒作用和免疫调节作用，例如上调I类和II类MHC抗原。已经发现，一种新的细胞因子，IFN-γ诱导性因子(IGIF)或IL-8，在受刺激PBMC中抑制IL-10产生的同时增加IFN-γ的产生。在人外周血单个核细胞(PBMC)中，IL-18还加强天然杀伤(NK)细胞的活性，这一点与其结构上无关细胞因子IL-12类似。IL-2主要是由外部刺激而激活的T细胞产生的；它对于抗原特异性T细胞的增殖的克隆扩展至关重要。IL-2通过与3条链(α、β和γc)构成的一受体系统的相互反应在T细胞的活化中起关键作用。IL-15，一种新鉴定的IL-12同系物，是一种多效细胞因子，具有与IL-2类似的T细胞刺激活性。
Th2细胞因子调节体液或抗体介导的免疫应答。IL-5是一种二聚体细胞因子，控制B细胞分化成为产生抗体的浆细胞。已经证明，IL-5诱导鼠或人B细胞产生抗原特异性的IgA。此外，IL-5还促进嗜伊红性粒细胞的生长和增殖。虽然最初显示IL-10是由Th2 T细胞集落产生的，但它也由B细胞和单核细胞产生。作为原型Th2细胞因子，IL-10已被证明能抑制促分裂原活化的单核细胞产生IL-1α、IL-16、IL-18和TNF-α之类细胞因子，而且抑制IFN-γ的巨噬细胞激活作用。据报道，IL-10可能在HIV-1感染中起作用；与非感染个体的PBMC相比，无症状HIV阳性个体的PBMC中IL-10 mRNA水平上调，而且IL-10水平提高。此外，已证明，IL-10降低了体外人巨噬细胞中病毒复制。
研制了前炎性、Th1和Th2细胞因子的表达盒，分析它们在DNA疫苗诱导的免疫应答中起体内调节物作用的能力。将细胞因子基因与DNA免疫原构建物一起肌内注射传递到小鼠体内，分析它们对所诱导的免疫应答的方向和强度的作用。与IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IL-18共注射，观察到抗体反应的显著加强。与TNF-α、TNF-β、IL-12、IL-10和IL-18共注射，引起T辅助细胞增殖反应的显著加强，而与IL-5和IL-15的共注射则引起较缓和的T辅助细胞增殖反应加强。而且，在所有的共注射组合中，只有TNF-α与IL-15共注射引起类似于IL-12共注射的CTL水平加强(特异性溶解率高于30％)。与仅用DNA免疫原免疫的动物组相比，与TNF-β、IL-12和IL-18共注射引起较缓和的CTL反应增强。如同与IL-12或CD86共注射所见，与TNF-α和IL-15共注射所见的CTL反应增强受到I类MHC和CD8+T细胞的限制。
IL-18据称具有与IL-12相似的活性。例如，IL-18增强了人外周血单个核细胞(PBMC)培养中自然杀伤(NK)细胞的活性，这一点与其结构上不相关的细胞因子IL-12相似。IL-18还增强伴刀豆球蛋白A(Con A)刺激的PBMC产生IFN-γ，同时抑制IL-10的产生。还观察到，IL-18通过IL-12非依赖性途径诱导IFN-γ。虽然与IL-12共传递显著加强了T细胞介导应答水平同时中等程度降低体液应答，但是与IL-18的共给予却没有见到类似的作用。相反，IL-18共给予显著提高抗体效价。此外，与IL-12共传递显著加强CTL不同，IL-18共注射不诱导类似水平的CTL加强。IL-18的免疫调节特性似乎与IL-10的相似。
除了IL-12和IL-18共给予的体内作用有差异之外，与IL-2共注射和与IL-15共注射也导致免疫应答的方向和强度有所不同。IL-2和IL-15曾报道具有类似的生物活性，包括具有相同的IL-2受体γ链和相同的T细胞刺激信号机制。与IL-2共给予导致显著增强抗体应答和T辅助细胞增殖反应，而IL-15共注射则导致显著加强CTL反应。这种差异也许可以用IL-15的多效性来解释。例如，IL-15曾报道在类风湿关节炎中通过激活滑液T细胞而显著诱导TNF-α的产生。另一方面，IL-2诱导的TNF-α水平却低得多。以上体内数据提示，这两种分子以不同方式参与激活信号机制。
Th2细胞因子可用于改进Th2免疫应答，而不影响T细胞介导应答的水平。IL-4、IL-5和IL-10据称是强Th2细胞因子。IL-4、IL-5和IL-10共传递引起抗体应答水平和T辅助细胞增殖反应水平的显著提高。另一方面，CTL反应的水平没有提高。以上结果显示，利用IL-4、IL-5和IL-10共给予可以人为改造Th2型应答。
一个重要发现是TNF-α和IL-15的多功能免疫调节剂作用。
研究了多种免疫学上具有重要意义的细胞因子对DNA接种诱导宿主免疫应答的作用。如图13所概括的，通过共给予细胞因子基因，可以人为诱导独特类型的免疫应答。这种细胞因子基因佐剂系统强调在新的水平上调控特异性免疫应答的诱导，以使得免疫过程产生的保护作用随疾病不同而具有更适宜的关系。这种对疫苗和免疫治疗的精确调控是前所未有的。结果，控制免疫应答的方向和程度将有利于各种各样的免疫策略。例如，在以T细胞介导应答为主，而体液应答不需要甚至有害的情况下，可以选用IL-12基因作为免疫调节剂与特异性DNA免疫原共传递。相反，为了建靶向对胞外细菌的疫苗，可共注射以例如IL-4、IL-5或IL-10基因。而且，如果CD4+T辅助细胞和抗体在保护作用中都起重要作用，可共传递GM-CSF和IL-2。最后，如果这三种类型的免疫应答都是关键性的，可共注射TNF-α，综合加强抗体、T辅助细胞和CTL应答。实施例6通过PCR反应，利用合适的限制性酶，将图14的插入片段BL1克隆和连接到PCR3真核表达载体即载体pBBKan(如图15)内。将BL1构建物与不同的HIV-1抗原共同给予，测定其在小鼠体内的免疫调节作用。图16和17A、B、C和D中的结果表明，BL1内的DNA片段在与HIV-1抗原共免疫时加强了免疫应答。所观察到的是在脾脏肿大和抗体与CTL应答加强方面的不同效果。
表1小RNA病毒科鼻病毒属(医用)造成50％的普通感冒。
Etheroviruses(医用)包括脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，埃可(ECHO)病毒，人肠道病毒例如甲肝病毒。
Apthoviruses(兽医用)这些是足口腔病毒。
靶抗原VP1，VP2，VP3，VP4，VPGCalcivirus科Norwalk组病毒属(医用)这些病毒是流行性胃肠炎的重要致病因子。披膜病毒科α病毒属(医用和兽医用)其实例包括Senilis病毒、RossRiver病毒和东方和西方马脑炎病毒。
呼肠孤病毒属(医用)风疹病毒。黄病毒科例如(医用)登革热病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑膜炎病毒和虱传脑炎病毒。丙肝病毒(医用)这些病毒不属于任何科，但被认为或者是披膜病毒或者是黄病毒。大部分类似于披膜病毒科。冠状病毒科(医用和兽医用)传染性支气管炎病毒(禽)猪可传递胃肠炎病毒(猪)猪血凝脑脊髓炎病毒(猪)猫传染性腹膜炎病毒(猫)猫小肠冠状病毒(猫)狗冠状病毒(狗)人呼吸道冠状病毒引起约40％普通感冒。EX.224E，0C43。注意冠状病毒可能引起非甲、非乙和非丙肝的肝炎。
靶抗原E1-又称M蛋白或基质蛋白E2-又称S蛋白或刺突蛋白E3-又称HE或血细胞凝集elterose糖蛋白(并不存在于所有的冠状病毒中)N-核衣壳弹状病毒科Vesiliovirus属狂犬病病毒(医用和兽医用)狂犬病靶抗原G蛋白，N蛋白线状病毒科(医用)出血热病毒，例如Marburg病毒和Ebola病毒副粘病毒科副粘病毒属(医用和兽医用)腮腺炎病毒，新城疫病病毒(重要的鸡致病原)麻疹病毒属(医用和兽医用)麻疹病毒、狗瘟热肺病毒(医用或兽医用)呼吸道合胞病毒正粘液病毒科(医用)流感病毒环蛇属病毒科(Bungavirus)环蛇病毒属(医用)加利福尼亚脑炎，LA Crosse白蛉热病毒属(医用)Rift峡谷热汉坦病毒属Puremala是一种hemahagin热病毒内罗毕病毒属(兽医用)内罗毕绵羊病还有许多未归类的环蛇属病毒属沙粒病毒科(医用)LCM，拉沙热病毒呼肠孤病毒科呼肠孤病毒属可能是一种人病原轮状病毒儿童急性胃肠道炎环状病毒属(医用和兽医用)科罗拉多虱传热病毒、Lebombo(人)、马脑炎病毒、蓝舌病毒逆转录病毒科致癌病毒亚科(兽医用和医用)猫白血病病毒、HTLVI和HTLVII慢病毒亚科(医用和兽医用)HIV，猫免疫缺陷病毒、马传染病病毒、贫血病毒泡沫病毒亚科乳多空病毒科多瘤病毒亚科(医用)BKU和JCU病毒乳头瘤病毒亚科(医用)与癌症或乳头瘤的恶性发展有关的许多种病毒腺病毒(医用)EX AD7，ARD.，O.B.-引起呼吸道疾病部分腺病毒，例如275，引起肠炎细小病毒科(兽医用)猫细小病毒引起猫肠炎猫肠炎病毒狗细小病毒猪细小病毒疱疹病毒科α疱疹病毒亚科单纯疱疹病毒属(医用)HSVI，HSVII水痘病毒属(医用和兽医用)假狂犬病-水痘-带状疱疹病毒β疱疹病毒亚科巨细胞病毒属(医用)HCMV，Muromegalovirusγ疱疹病毒亚科淋巴隐病毒属(医用)EBV-(Burkitts淋巴细胞)，Rhadinovirus痘病毒科带状痘病毒亚科(医用-兽医用)天花病毒属牛痘属副痘病毒属-(兽医用)山羊痘病毒属-兽医用兔痘病毒属猪痘病毒属Entemopoxviridue亚科肝DNA病毒科乙型肝炎病毒未分类的δ肝炎病毒表2细菌病原革兰阳性病原球菌包括肺炎球菌；葡萄球菌；和链球菌。
革兰阴性病原球菌包括脑膜炎球菌和淋球菌。
病原性革兰阴性肠道杆菌包括肠杆菌；假单孢菌，不动杆菌和eikenilla；类鼻疽；沙门菌；志贺菌；嗜血杆菌；软下疳；布鲁杆菌病；土拉菌热；巴斯德菌；链杆菌属；念珠菌和螺菌属；产单核细胞李斯特菌；猪红斑单毒丝菌；白喉杆菌；霍乱杆菌；炭疽杆菌；杜诺凡菌；和巴尔通氏体。
病原性厌氧菌包括破伤风杆菌；肉毒菌和其它羧菌；结核菌；麻风杆菌和其它分枝杆菌。病原性螺旋体病包括梅毒；密螺旋体病；；雅司疹；品它病和地方流行性梅毒；和钩端螺旋体病。由较高级病原菌和病原性真菌引起的其它感染包括放线菌病；诺卡菌病；隐球菌病，酵母菌病，组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠菌病，曲霉病，和毛霉菌病；孢子丝菌病，巴西芽生菌病，petriellidosis，球拟酵母菌属，足分枝菌病和着色芽生菌病；和皮肤真菌病。
立克次体感染包括立克次体的和立克次体病。
支原体和衣原体感染的病例包括支原体肺炎；性病性淋巴肉芽肿；鹦鹉热；和产期衣原体感染。真核细胞病原由致病性原虫和蠕虫引起的感染包括阿米巴病；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形体病；肺泡子虫病；隆突；巴贝虫病；贾第鞭毛虫病；旋毛虫病；马来丝虫病；血吸虫病；线虫；吸虫；和绦虫感染。
权利要求
1.一种质粒，包含的核苷酸序列编码a)免疫调节蛋白，选自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α，TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1，该序列与调控元件操作性连接；和b)编码免疫原的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的质粒，其中所述的免疫原是与调控元件操作性连接的靶蛋白，所述的靶蛋白是病原性抗原、癌相关抗原或与自身免疫病相关细胞连接的抗原。
3.根据权利要求1所述的质粒，其中所述的免疫原是HIV-1抗原。
4.根据权利要求1所述的质粒，其中所述的免疫调节蛋白是单链IL-12。
5.根据权利要求1所述的质粒，它包含与调控元件操作性连接的编码多种免疫调节蛋白质的核苷酸序列，所述免疫调节蛋白选自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α，TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1，其中各核苷酸序列编码一个免疫调节蛋白。
6.根据权利要求1所述的质粒，它包含多份编码所述免疫调节蛋白的核苷酸序列。
7.一种药物组合物，它包含权利要求1所述的质粒。
8.一种免疫接种个体抵抗病原的方法，它包括给予所述个体权利要求1所述的质粒。
9.一种组合物，它包含一种或多种质粒，包括第一质粒，它包含与调控元件操作性连接的编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，所述的免疫调节蛋白选自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α，TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1，和第二质粒，它包含编码免疫原的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的组合物，所述的第二质粒编码的免疫原选自病原性抗原、癌相关抗原或与自身免疫病相关细胞连接的抗原。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述的免疫原是HIV-1抗原。
12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述的免疫调节蛋白质是单链IL-12。
13.根据权利要求9所述的组合物，其中所述的第一质粒包含与调控元件操作性连接的编码多种某免疫调节蛋白的核苷酸序列，所述的免疫调节蛋白选自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α，TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1。
14.根据权利要求9所述的组合物，它还包含第三质粒，所述的第三质粒包含与调控元件操作性连接的编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，所述的免疫调节蛋白选自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α，TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1。
15.根据权利要求9所述的组合物，其中所述的第一质粒包含多份编码所述免疫调节蛋白的核苷酸序列。
16.一种药物组合物，它包含权利要求9所述的组合物。
17.一种免疫接种个体抵抗病原的方法，包括给予所述个体权利要求9所述的组合物。
18.一种重组疫苗，它包含与调控元件操作性连接的编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，这些免疫调节蛋白选自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α，TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1，该重组疫苗还包含编码免疫原的核苷酸序列。
19.根据权利要求18所述的重组疫苗，其中所述的免疫原选自病原性抗原、癌相关抗原或与自身免疫病相关细胞连接的抗原。
20.根据权利要求18所述的重组疫苗，其中所述的疫苗是重组的牛痘疫苗。
21.根据权利要求18所述的重组疫苗，其中所述的免疫调节蛋白是单链IL-12。
22.根据权利要求18所述的重组疫苗，其中所述的免疫原是病原性抗原。
23.根据权利要求18所述的重组疫苗，它还包含分别与调控元件操作性连接的编码多份一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，所述的免疫调节蛋白选自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α，TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1。
24.根据权利要求18所述的重组疫苗，它包含编码所述免疫调节蛋白的多份核苷酸序列。
25.一种免疫接种个体抵抗病原的方法，包括给予所述个体权利要求18所述的重组疫苗。
26.一种减毒活病原，它包括与调控元件操作性连接的编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，所述的免疫调节蛋白选自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α，TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1。
27.根据权利要求26所述的减毒活病原，包括与调控元件操作性连接的编码多份免疫调节蛋白的核苷酸序列，所述的免疫调节蛋白选自IL-12、GM-CSF、IL-1、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18和BL-1，其中所述各序列分别编码一种免疫调节蛋白。
28.根据权利要求26所述的活性减毒病原，它包含多份编码所述免疫调节蛋白的核苷酸序列。
29.一种免疫接种个体抵抗病原的方法，包括给予所述个体权利要求26所述的减毒活病原。
30.一种质粒，它包含编码单链IL-12的核苷酸序列。
31.一种基本纯的BL-1蛋白，具有图14的氨基酸序列，或其免疫调节片段。
32.一种重组表达载体，它包含编码权利要求21所述蛋白的核苷酸序列。
33.根据权利要求22所述的重组表达载体，它包含图14中的核苷酸序列。
34.一种分离的抗体，它结合权利要求21所述蛋白上的表位。
35.根据权利要求24所述的抗体，该所述的抗体是单克隆抗体。
36.一种药物组合物，它包含权利要求22所述的核酸分子和药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明揭示了改进型的疫苗,它包含与调控元件操作性连接的核苷酸序列,所述序列编码的是IL－12、GM－CSF、IL－1、TNF－α,TNF－β、IL－2、IL－4、IL－5、IL－10、IL－15、IL－18和/或BL－1。改进型疫苗包括DNA疫苗、用于传递外源抗原的重组疫苗和减毒活疫苗。本发明还揭示了免疫接种个体的方法。还揭示了药物组合物,该组合物包含编码一种或多种免疫调节蛋白的核酸分子,所述的调节蛋白选自IL－12、GM－CSF、IL－1、TNF－α,TNF－β、IL－2、IL－4、IL－5、IL－10、IL－15、IL－18和BL－1。本发明还揭示了一种免疫调节蛋白,BL－1,和编码BL－1的核酸分子。还揭示了制造和使用BL－1的方法。
文档编号C07K14/54GK1242045SQ9718089
公开日2000年1月19日 申请日期1997年10月23日 优先权日1996年10月23日
发明者J·J·基姆, 王宾, J·D·博耶, D·B·韦纳, V·阿亚沃 申请人:宾夕法尼亚州立大学托管会