本发明属于番茄耐逆性比较生物技术领域，具体涉及一种快速比较番茄品种耐高温干旱特性的方法。
背景技术
番茄(solanumlycopersicuml.)是世界性的重要蔬菜，广泛用于露地和设施栽培。然而，非生物环境因子引起的非生物胁迫会对番茄的栽培种植造成不良影响。一方面，随着全球气候变暖，高温胁迫对番茄生产的影响日趋严重，同时在番茄的越夏栽培中，高温胁迫也常常发生。另一方面，降雨不足或土壤水分缺乏引起的干旱胁迫也会对番茄的生产造成危害。高温和干旱胁迫严重限制了世界作物产量，对农业经济造成巨大损失。值得注意的是，在自然条件下，多种非生物胁迫常常同时发生，尤其是高温和干旱，高温干旱复合胁迫往往比单一胁迫对番茄的危害更大。发明人通过前期研究发现，在高温胁迫下，叶绿素荧光参数fv/fm能够比较不同番茄品种的耐受性差异[1]。在干旱胁迫下，植株叶片的失水率(waterlossrate，简写wlr，单位为％)保持不变，表明该植株保水性越好，耐旱性越强[2]。不同番茄品种对高温干旱复合胁迫的敏感程度不同[3]。然而，目前缺乏一种快速有效比较番茄幼苗耐高温干旱特性的方法[3]。
技术实现要素：
发明人研究发现，对于番茄而言，在高温干旱复合胁迫下，干旱胁迫起主导作用，即在高温干旱复合胁迫下，番茄叶片的保水性越好，则耐高温干旱的特性越强，番茄的响应在40℃处理下比36℃处理下更为明显，因此本发明采用40℃极端高温处理；同时为了防止反复灌溉引起的恢复影响实验结果，采用停止灌溉的方法进行干旱胁迫，高温干旱复合胁迫48h后，不同番茄品种表现出差异。因此，本发明目的在于提供一种快速比较番茄幼苗耐高温干旱特性的方法，利用高温干旱胁迫下番茄叶片的失水率来判断番茄受到高温干旱胁迫伤害的程度，以解决现有技术中缺乏一种快速有效比较高温干旱胁迫下番茄品种耐受性方法的问题，为番茄幼苗耐高温干旱特性的快速比较和表型分型奠定基础。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种快速比较番茄品种耐高温干旱特性的方法，包括以下步骤：
步骤(1)、将基质装入穴盘中，播种前基质浇透水，将待比较的番茄种子播于穴盆中，每孔播2粒种子，播种后覆盖一层基质；播种7-14天后，去除多余的苗，每孔保留一棵苗；
步骤(2)、播种18-23天后，将幼苗置于人工气候箱内适应培养，每天早上8:00使用日本园试配方营养液浸没穴盘；
步骤(3)、幼苗在人工气候箱内适应培养第7天，取第1片完全展开叶作为对照叶片，立即称取对照叶片鲜重fw0h-对照作为对照，常温室内自然放置1h和20h后，分别称取叶片鲜重fw1h-对照、fw20h-对照；
步骤(4)、对照叶片称重当天晚上19:00开始40℃极端高温连续处理48h，并停止灌溉，使幼苗在短时间内受到严重的高温干旱协同胁迫，从而检测幼苗对复合胁迫的耐受性；
步骤(5)、高温干旱处理后，取第1片完全展开叶，立即称取胁迫处理叶片鲜重fw0h-胁迫，室内常温自然放置1h和20h后，再次称取叶片鲜重fw1h-胁迫、fw20h-胁迫；
步骤(6)、明确叶片在短时间(1h)和长时间(20h)内的失水情况，计算对照叶片失水率和胁迫处理叶片失水率：
wlr1h-对照＝[(fw1h-对照-fw0h-对照)/fw0h-对照]*100，
wlr20h-对照＝[(fw20h-对照-fw0h-对照)/fw0h-对照]*100，
wlr1h-胁迫＝[(fw1h-胁迫-fw0h-胁迫)/fw0h-胁迫]*100，
wlr20h-胁迫＝[(fw20h-胁迫-fw0h-胁迫)/fw0h-胁迫]*100；
分别计算1h和20h对照叶片和胁迫处理叶片失水率的差值的绝对值|wlr1h-胁迫-wlr1h-对照|、|wlr20h-胁迫-wlr20h-对照|，进一步计算获得(|wlr1h-胁迫-wlr1h-对照|+|wlr20h-胁迫-wlr20h-对照|)/2的值，用于评价番茄品种的高温干旱特性；若(|wlr1h-胁迫-wlr1h-对照|+|wlr20h-胁迫-wlr20h-对照|)/2的值越小，则该番茄品种越耐高温干旱复合胁迫；(|wlr1h-胁迫-wlr1h-对照|+|wlr20h-胁迫-wlr20h-对照|)/2的值越大，则该番茄品种对高温干旱复合胁迫越敏感。
步骤(1)中，所述的基质是品氏有机基质。
所述的穴盘的长度为54cm，宽度为27cm，共50孔。
移至人工气候箱之前，番茄幼苗生长的温度、光照、水分和湿度等条件适宜，为本领域技术人员公知操作。
步骤(2)中，所述的人工气候箱型号为rdn-560e-4，来自于宁波东南仪器有限公司，共4层，每层可放置2个穴盘。
高温干旱处理前，人工气候箱内的温度设置为26/18℃，白天/黑夜为14h/10h，白天5:00-19:00，黑夜19:00-次日5:00，相对湿度为60％，光照强度为25000lux。
使用500-800ml日本园试配方营养液浸没穴盘。
本发明采用天平测定叶片鲜重，精确到小数点后四位数。叶片放置在同一地点。
本发明中每个番茄品种设置三个重复。
步骤(6)中，优选的，所述的评价番茄品种的高温干旱特性标准：(|wlr1h-胁迫-wlr1h-对照|+|wlr20h-胁迫-wlr20h-对照|)/2的值≤0.8，则该番茄基因型的耐高温干旱特性强；(|wlr1h-胁迫-wlr1h-对照|+|wlr20h-胁迫-wlr20h-对照|)/的值≥22.0，则该番茄基因型对高温干旱复合胁迫较为敏感。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明利用对照和高温干旱复合胁迫处理48h后叶片失水率(wlr)在短时间(1h)和长时间(20h)后的变化，可在短时间内快速准确比较番茄幼苗的耐高温干旱特性，对番茄耐高温干旱复合胁迫特性评价的准确率可达100％，为作物的耐高温干旱复合胁迫特性的评价和材料筛选提供有效方法，有利于作物耐逆育种。同时，本发明方法使用的每个人工气候箱最多可放置8个穴盘，每个穴盘最多可播种16个番茄品种，即一批最多可比较128个番茄品种。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种快速比较番茄幼苗耐高温干旱特性的方法：
步骤(1)、将番茄种子播于装有品氏有机基质(pindstrup，丹麦)的穴盘中，穴盘的长度为54cm，宽度为27cm，共50孔；每个孔播2粒种子，每个番茄品种播种3个孔；将穴盘置于温室或大棚内，在外界温度、光照、水分和湿度等适宜的条件下培育；播种14天后，若一个孔出2棵苗，则仅保留一棵苗；
步骤(2)、播种23天后，将穴盘置于人工气候箱内适应，人工气候箱的温度设置为26/18℃(14h/10h，白天/黑夜)，相对湿度为60％，光照强度为25000lux；人工气候箱共4层，每层放置2个穴盘；高温干旱处理前，每天早上8:00使用500ml日本园试配方营养液浸没穴盘；
步骤(3)、播种后第30天，取第1片完全展开叶作为对照叶片，立即用天平称取鲜重(即fw0h-对照，精确到小数点后四位数，同下)，室内常温自然放置1h和20h后，用相同的天平分别称取叶片鲜重(即fw1h-对照、fw20h-对照)。
步骤(4)、对照叶片称重当天晚上19:00开始40℃高温处理48h(14h/10h，白天/黑夜)，相对湿度为60％，光照强度为25000lux，并停止灌溉；
步骤(5)、高温干旱处理48h后，取第1片完全展开叶作为胁迫处理叶片，立即用与步骤(3)相同的天平称取鲜重(即fw0h-胁迫)，室内常温自然放置1h和20h后，用相同的天平分别称取叶片的鲜重(即fw1h-胁迫、fw20h-胁迫)。
步骤(6)、计算叶片的失水率，即：
wlr1h-对照＝[(fw1h-对照-fw0h-对照)/fw0h-对照]*100，
wlr20h-对照＝[(fw20h-对照-fw0h-对照)/fw0h-对照]*100，
wlr1h-胁迫＝[(fw1h-胁迫-fw0h-胁迫)/fw0h-胁迫]*100，
wlr20h-胁迫＝[(fw20h-胁迫-fw0h-胁迫)/fw0h-胁迫]*100；
比较对照和胁迫下不同番茄品种叶片失水率的变化，即分别计算1h和20h对照和胁迫叶片失水率的差值(wlr1h-胁迫-wlr1h-对照和wlr20h-胁迫-wlr20h-对照)。每个品种三个重复，求(|wlr1h-胁迫-wlr1h-对照|+|wlr20h-胁迫-wlr20h-对照|)/2的值用于该品种的高温干旱特性的评价。
步骤(7)、当进行多个番茄品种耐高温干旱特性的比较时，若|wlr1h-胁迫-wlr1h-对照|和|wlr20h-胁迫-wlr20h-对照|的平均值越小，则该番茄品种越耐高温干旱复合胁迫；|wlr1h-胁迫-wlr1h-对照|和|wlr20h-胁迫-wlr20h-对照|的平均值越大，则该番茄品种对高温干旱复合胁迫越敏感。
对25个不同番茄品种幼苗的耐高温干旱特性进行比较，每个品种3个重复(表1)。如表1，高温干旱复合胁迫处理后，17和22号的(|wlr1h-胁迫-wlr1h-对照|+|wlr20h-胁迫-wlr20h-对照|)/2的值最小(0.8)；19号的(|wlr1h-胁迫-wlr1h-对照|+|wlr20h-胁迫-wlr20h-对照|)/2的值最大(22.0)。结合高温干旱处理不同时间段的叶片失水率得出，在这25个番茄品种中，17和22号品种对高温干旱胁迫具有一定的耐受性，而19号品种对高温干旱胁迫较为敏感。
表1不同番茄品种幼苗的失水率
注：1-8、11-12、20-22号番茄品种是通过引进国外优良番茄种质资源，经过多代自交纯化后，与国内已有优良番茄材料杂交获得。9号为金陵梦玉番茄品种，10号为金陵粉玉番茄品种，13号为苏粉12号番茄品种，14号为苏粉14号番茄品种，15号为金陵靓玉番茄品种，16-19号为野生醋栗番茄，23号为欧贝番茄品种，24号为金陵墨玉番茄品种，25号为阿里郎番茄品种。
对比例1
前人采用幼苗生长量评价番茄幼苗耐高温干旱特性[3,4]。高温干旱胁迫下，番茄植株外部生长反应与幼苗生长量的响应基本一致[4]，耐高温干旱的番茄出现胁迫的外部症状较轻，同时干鲜重下降值较少。
高温干旱处理4天后，通过肉眼观察植株表型及幼苗生长量的方法来判断番茄对高温干旱的耐受性，对实施例1中的2个番茄品种(对高温干旱敏感的19号番茄；耐高温干旱的22号番茄)进行比较，具体步骤为：
(1)、材料的准备同实施例1方法的步骤(1)-(2)，幼苗在人工气候箱内适应培养第7天，处理前称取幼苗地上部分(子叶节以上)的干鲜重作为对照，每个品种三个重复；
(2)、在人工气候箱进行38/26℃(14h/10h，白天/黑夜)高温处理，并停止灌溉；
(3)、高温干旱处理4天后对植株进行肉眼观察，并称取幼苗地上部分(子叶节以上)的干鲜重，计算干鲜重生长量，即鲜重生长量＝(处理后鲜重-处理前鲜重)/处理前鲜重，干重生长量＝(处理后干重-处理前干重)/处理前干重，每个品种三个重复。
比较结果为：38/26℃高温干旱处理早期(2天后)，22号番茄幼苗未出现萎蔫症状，19号番茄中上部叶片出现枯萎症状；38/26℃高温干旱处理后期(4天后)，19号整个植株出现干旱、枯萎甚至死亡的症状，而22号番茄出现较轻的萎蔫症状。同时，高温干旱处理后，19和22号幼苗鲜重分别下降了68.9％和60.2％；19和22号幼苗干重分别下降了30.5％和23.9％，对耐高温干旱胁迫具有一定耐受性的22号的干鲜重下降值显著小于19号。综上所述，22号番茄的耐高温干旱特性优于19号。
参考文献：
[1]rongzhou,xiaqingyu,katrineh.kjaer,evarosenqvist,carl-ottoottosen,zhenwu.screeningandvalidationoftomatogenotypesunderheatstressusingfv/fmtorevealthephysiologicalmechanismofheattolerance[j].environmentalandexperimentalbotany,2015,118:1-11.
[2]闫慧茹.棉花ghwrky17转录因子参与aba信号途径及干旱、高盐胁迫反应[d].山东农业大学.2013.
[3]张本源,蒋燕.不同番茄品种幼苗对高温干旱的抗性差异[j].长江蔬菜,2010,17:49-50.
[4]蒋燕,孟玲,赵会杰.高温干旱处理对番茄不同品种幼苗生长的影响[j].北方园艺,2007,1:1-5.