本发明属于植物保护领域，特别涉及一种温室苗期鉴定南瓜青枯病抗性品种的方法。
背景技术
南瓜青枯病是由变形菌门β-变形菌纲伯克氏菌目伯克氏菌科雷尔氏菌属的茄科雷尔氏菌侵染引起的一种土传维管束病害。南瓜青枯病是近年来南方新发现的病害，田间病株率约25～45％，造成了严重的经济损失。由于南瓜青枯菌可长期在土壤存活，防治南瓜青枯病比较困难。
目前针对南瓜青枯病的防治措施主要包括与非寄主、茄科类作物的轮作、调节土壤酸度、及时拔除病株等栽培措施，但是防治效果不理想；利用杀菌剂如77％氢氧化铜可湿性粉剂1000倍液，或20％噻菌铜悬浮剂1000倍液、72％农用链霉素可溶性粉剂4000倍液灌根对南瓜青枯病发生可起到预防作用，但是防治效果不佳。同时由于使用农药一方面容易导致病原菌产生抗药性、污染环境等问题，另一方面也会带来农产品食用安全问题。在国家目前提倡的“化肥农药减施”方针政策指导下，急需建立经济有效的防治措施。南瓜青枯病最经济有效的防治的措施就是选育和种植抗南瓜青枯病品种。我国目前尚无高抗南瓜青枯病的南瓜品种报道，而筛选抗病品种必须建立快速、稳定、可靠的鉴定抗性品种的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种温室苗期鉴定南瓜青枯病抗性品种的方法。旨建立一种快速、稳定、可靠的南瓜青枯病接种方法，便于苗期筛选抗青枯病的南瓜种质，获得抗青枯病的材料，为抗病育种提供技术手段。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种温室苗期鉴定南瓜青枯病抗性品种的方法，包括如下步骤：
(1)培育接种用南瓜苗：将南瓜种子播种到装有已灭菌泥炭土的育苗盘中，然后将育苗盘置于25～35℃的温室大棚内培育，待长至2～3片真叶时，获得接种用南瓜苗；
(2)接种：将2～3片真叶期的接种用南瓜苗从育苗盘中拔出，并用自来水冲去南瓜苗植株根部的泥土，然后将根部浸泡到南瓜青枯菌悬浮液中，再移植到装有灭菌土的育苗盘中，每穴一株南瓜苗；其中，每次处理的南瓜苗不少于30株，重复至少4次；
(3)调查方法：接种后每周调查一次，记录接种南瓜青枯菌后的总株数和发病株数，并统计其病株率＝(发病株数/总株数)×100％，并按以下标准进行抗性水平分类：
病株率≤20％为高抗(hr)；20％＜病株率≤40％为抗病(r)；40％＜病株率≤60％为耐病(mr)；60％＜病株率≤80％为感病(s)；病株率＞80为高感(hs)。
步骤(1)中所述的温室大棚内培育的时间优选为2～3周。
步骤(1)中所述的育苗盘优选为72孔育苗盘，其规格为：54cm×28cm，穴深4cm，穴口口径3.8cm，穴底直径2.2cm。
步骤(2)中所述的浸泡的时间优选为20分钟。
步骤(2)中所述的南瓜青枯菌悬浮液为浓度为108～109cfu/ml的南瓜青枯菌悬浮液；优选为通过如下步骤制备得到：将南瓜青枯病菌菌株置于30℃的tzc平板上培养48小时，然后挑取单菌落接种到tzc培养基试管斜面，30℃条件下培养24小时，再从tzc培养基试管斜面挑取菌落接种到na液体培养基中，30℃下、150rpm/min培养24小时，得到南瓜青枯菌悬浮液。
所述的南瓜青枯病菌菌株为南瓜青枯病菌菌株rs378；优选为保存在20℃条件下的南瓜青枯病菌菌株rs378。
步骤(2)中所述的育苗盘优选为32孔育苗盘，其规格为：54cm×28cm，穴深6cm，穴口口径6cm，穴底直径3cm。
所述的温室苗期鉴定南瓜青枯病抗性品种的方法，还包括将步骤(1)中的南瓜苗和步骤(2)中接种南瓜青枯菌后的南瓜苗进行水肥管理的步骤。
步骤(3)中所述的调查的时间不少于6周，即每周调查一次，调查的次数不少于6次。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明针对目前南瓜青枯病抗病育种上没有抗性鉴定方法现状，提供一套鉴定结果准确的温室人工接种鉴定南瓜抗青枯病能力的方法，为南瓜种质资源的筛选和品种抗病性鉴定提供技术支撑，是首次在我国建立了南瓜青枯病抗性鉴定方法。
(2)本发明的接种方法操作简便，鉴定结果准确可靠不受大田环境影响，可显著区分不同品种对青枯病的抗感差异。
(3)本发明运用浸根接种的方法，接种部位和接种量一致、接种后发病均匀，结果稳定性好，可操作性强，鉴定结果与田间自然感病结果一致，有利于高抗材料筛选。
(4)本发明的鉴定方法所需时间显著减少，利用本发明的鉴定方法所需时间约为8～9周，而田间鉴定方法所需时间更长，约为12～20周。
(5)本发明的方法适合同时对大批量南瓜材料抗青枯病鉴定和筛选，有利于提高抗病材料的筛选效率。
附图说明
图1是田间南瓜青枯病自然发病症状与温室接种青枯菌后南瓜发病的症状的照片图；其中，图a为田间南瓜青枯病自然发病症状；图b为温室接种青枯菌后南瓜发病的症状。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实例1
一、试验材料
以3个南瓜品种材料(袖珍蜜本南瓜、蜜本南瓜和大果蜜本南瓜)为研究对象，采用浸根接种法和注射接种法处理不同南瓜品种，分析不同方法接种南瓜品种后青枯病发病差异。
二、试验方法
1、接种菌体制备
将保存在20℃条件下的南瓜青枯病菌菌株(rs378；doi:10.3389/fpls.2017.01794，即参考文献：xshe，lyu，glan，ytang，zhe.identificationandgeneticcharacterizationofralstoniasolanacearumspeciescomplexisolatesfromcucurbitamaximainchina.《frontiersinplantscience》,2017,8:1794)。在tzc平板上活化，30℃条件下培养48小时，然后挑取单菌落接种到tzc培养基试管斜面，30℃条件下培养24小时，再从tzc培养基试管斜面挑取新鲜菌落接种到na液体培养基中，30℃下150rpm/min培养24小时，将rs378菌液用水配制成浓度为108～109cfu/ml的悬浮液备用。
2、供试南瓜品种材料准备
培育接种用南瓜苗：72孔育苗盘(54cm×28cm，穴深4cm，穴口口径3.8cm，穴底直径2.2cm)用75％酒精进行表面消毒，装入已灭菌的泥炭土(mby-荷兰进口捷菲jiffy705型/0-8mm含肥泥炭土)，播种鉴定材料，每穴1～2颗种子，每份鉴定材料播300颗种子以上(保证接种时用苗240株)，置于25～35℃温室大棚内生长2～3周，水肥常规管理，待长至2～3片真叶期时进行接种鉴定。
3、接种方法(2人操作完成)
①浸根接种法：将2～3片真叶期南瓜苗从育苗盘中拔起，用自来水冲去植株根部的泥土，然后将根部浸入南瓜青枯菌悬浮液中20分钟，再移植于盛灭菌土的32孔育苗盘中(54cm×28cm，穴深6cm，穴口口径6cm，穴底直径3cm)，每穴一株苗，每次处理30株，4次重复(i、ii、iii、iv次)，接种移植后各处理的水肥按常规管理。
②注射接种法：用容量为1毫升的一次性无菌注射器(江西洪达医疗器械集团有限公司)将南瓜青枯菌悬浮液注射到2～3真叶期南瓜苗茎基部(距离育苗盘穴口约1cm)，接种菌液量为500μl/株，每次处理30株，4次重复(i、ii、iii、iv次)，接种移植后各处理的水肥按常规管理。
4、接种时间统计
浸根接种法从将2～3片真叶期南瓜苗从育苗盘中拔起开始计时，浸根接种后所有南瓜苗全部移植到32孔育苗盘中停止计时，分别记录拔苗所用时间、洗苗时间以及移植时间。
注射接种法记录完成每个品种4次重复120株苗接种所需要的时间。
5、调查方法
接种后每周调查一次，记录各处理的发病株数。当各处理的病情基本稳定、无新病株出现时(6周左右)，统计其病株率：病株率＝(发病株数/总株数)×100％。
三、实验结果与分析
接种结果如表1所示，用浸根接种法和注射接种法处理的同个南瓜品种平均病株率虽有不同，但是差异不显著，说明两种接种方法均可行；但是注射法接种同个南瓜品种的4次重复处理间的病株率差异较大，说明该方法不同人操作差异较大。
接种所需时间如表2所示，用浸根法和注射法接种1个南瓜品种所需时间差异不大，但随着品种数的增加，浸根法接种南瓜所需时间少，而注射法接种南瓜所需时间多。
表1浸根法和注射法接种南瓜统计结果
表2浸根法和注射法接种南瓜所需时间统计结果
实施例2
一、试验材料
以1个中抗南瓜品种材料(印度南瓜)为研究对象，采用浸根接种法鉴定其对南瓜青枯病的抗性。
二、试验方法
1、接种菌体制备
将保存在20℃条件下的南瓜青枯病菌菌株(rs378)在tzc平板上活化，30℃条件下培养48小时，然后挑取单菌落接种到tzc培养基试管斜面，30℃条件下培养24小时，再从tzc培养基试管斜面挑取新鲜菌落接种到na液体培养基中，30℃下150rpm/min培养24小时，将rs378菌液用水配制成浓度为108～109cfu/ml的悬浮液备用。
2、供试南瓜品种材料准备
培育接种用南瓜苗：72孔育苗盘(54cm×28cm，穴深4cm，穴口口径3.8cm，穴底直径2.2cm)用75％酒精进行表面消毒，装入已灭菌的泥炭土(mby-荷兰进口捷菲jiffy705型/0-8mm含肥泥炭土)，播种鉴定材料，每穴1～2颗种子，每份鉴定材料播150颗种子以上(保证接种时用苗120株)，置于25～35℃温室大棚内生长2～3周，水肥常规管理，待长至2～3片真叶期时进行接种鉴定。
3、接种方法
将2～3片真叶期南瓜苗从育苗盘中拔起，用自来水冲去植株根部的泥土，然后将根部浸入南瓜青枯菌悬浮液中20分钟，再移植于盛灭菌土的32孔育苗盘中(54cm×28cm，穴深6cm，穴口口径6cm，穴底直径3cm)，每穴一株苗，每次处理30株，4次重复(i、ii、iii、iv次)，接种移植后各处理的水肥按常规管理。
4、调查方法
接种后每周调查一次，记录各处理的发病株数。当各处理的病情基本稳定、无新病株出现时(6周左右)，统计其病株率：病株率＝(发病株数/总株数)×100％。按以下标准进行抗性水平分类。
5、南瓜对青枯病的抗性标准：
病株率≤20％为高抗(hr)
20％＜病株率≤40％为抗病(r)
40％＜病株率≤60％为中抗(mr)
60％＜病株率≤80％为感病(s)
80＜病株率为高感(hs)。
三、实验结果与分析
如图1所示温室接种青枯菌后南瓜发病的症状与田间南瓜青枯病自然发病症状一致。鉴定结果如表3所示，这个南瓜品种的平均病株率为50.83％，属于中抗材料。该实例鉴定结果与该材料的田间实际发病情况一致，表明温室南瓜苗期青枯病抗性接种鉴定法是一种接种效率高、结果准确的方法。
表31个南瓜品种温室苗期对青枯病的抗性水平鉴定结果
实施例3
一、实验材料
以11份南瓜品种材料为研究对象，采用浸根接种法鉴定其对南瓜青枯病的抗性。
二、试验方法
1、接种菌体制备
将保存在20℃条件下的南瓜青枯病菌菌株(rs378)分别在tzc平板上活化，30℃条件下培养48小时，挑取单菌落接种到tzc培养基试管斜面，30℃条件下培养24小时，再从tzc培养基试管斜面挑取新鲜菌落接种到na液体培养基中，30℃下150rpm/min培养24小时，将rs378菌液用水配制成浓度为108～109cfu/ml的悬浮液备用。
2、供试南瓜品种材料准备
72孔育苗盘(54cm×28cm，穴深4cm，穴口口径3.8cm，穴底直径2.2cm)用75％酒精表面消毒，装入已灭菌的泥炭土(mby-荷兰进口捷菲jiffy705型/0-8mm含肥泥炭土)，播种鉴定材料，每穴1～2颗种子，每份鉴定材料播150颗种子以上(保证接种时用苗120株)，置于25～35℃温室大棚内生长2～3周，水肥常规管理，待长至2～3片真叶期进行接种鉴定。
3、接种方法
将2～3片真叶期南瓜苗从育苗盘中拔起，用自来水冲去植株根部的泥土，然后将根部浸入南瓜青枯菌悬浮液中20分钟，再移植于盛灭菌土的32孔育苗盘中(54cm×28cm，穴深6cm，穴口口径6cm，穴底直径3cm)，每穴一株苗，每处理30株，4次重复(i、ii、iii、iv次)，接种移植后各处理的水肥按常规管理。
4、调查方法
接种后每周调查一次，记录各处理的发病株数。当各处理的病情基本稳定、无新病株出现时(6周左右)，统计其病株率：病株率＝(发病株数/总株数)×100％。按以下标准进行抗性水平分类。
5、南瓜对青枯病的抗性标准：
病株率≤20％为高抗(hr)
20％＜病株率≤40％为抗病(r)
40％＜病株率≤60％为中抗(mr)
60％＜病株率≤80％为感病(s)
80％＜病株率为高感(hs)。
三、实验结果与分析
本实例结果如表4所示，在鉴定的11份品种中，1个品种平均病株率≤40％，属于抗病品种；1个品种平均病株率在40％～60％之间，属于中抗品种；5个品种平均病株率在60％～80％之间，属于感病品种；4个品种平均病株率>80％，属于高感品种。本实例结果表明该温室南瓜苗期青枯病抗性接种鉴定法可广泛用于南瓜种质资源的筛选和品种抗病性鉴定。
表411个南瓜品种温室苗期对青枯病的抗性水平鉴定结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。