本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及一种苦参碱和布氏白僵菌联用的杀虫药及其应用。
背景技术：
布氏白僵菌（beauveriabrongniartii）是一种昆虫病原真菌，作为活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的作用机理、对环境无污染、无残留的特点，可以作为某些对杀虫剂产生抗药性的昆虫的防治替代品。
斜纹夜蛾（spodopteralitura(fabricius)）是一种世界性分布的重要农业害虫，主要为害棉花、烟草、大豆、香芋、花生、芝麻、莲藕和十字花科蔬菜等，具有间歇暴发成灾的特性。近年来，随着我国种植业结构的变化，蔬菜种植面积不断扩大，再加上气候变暖，斜纹夜蛾发生为害逐年加重，常常导致作物严重减产，甚至颗粒无收。
长期以来，国内外对斜纹夜蛾的防治以化学农药为主，但长期大量频繁以及不合理的用药，导致斜纹夜蛾对氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机氯、有机磷和苏云金杆菌等多种杀虫剂均产生了不同程度的抗药性。而日益增强的抗药性和农药残留，使生态环境造成污染、大量天敌遭到杀伤、人畜健康受到威胁，甚至削弱了生态系统中自然控制因素对斜纹夜蛾的控制作用，致其连年爆发。采用农药复配技术或混合施用技术是克服或延缓抗药性的一个重要方法。
采用农药复配技术或混合施用技术是克服或延缓病虫害抗药性的重要方法之一。目前，有以多种杀菌剂轮流使用、混合使用防治斜纹夜蛾的方法，但该防治方法存在着化学药剂使用量较高、农药残留量较大、病害易产生交互抗药性、防治效果较差等问题，而且由于复配剂中复配组分存在着较严格的相互制约，因此，在防治斜纹夜蛾时如何做到高效、无污染、无残留的防治，是当前解决实际问题的关键，也是研制农药复配剂的关键。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有斜纹夜蛾防治技术的缺陷和不足，提供一种高效、无污染、无残留的具有协同增效作用的苦参碱和布氏白僵菌联用的杀虫药。本发明通过对苦参碱和布氏白僵菌复配效果进行研究发现，所述杀虫药复配后能够表现出显著的协同增效作用，提高防治效果，并可明显减低化学农药单剂的使用剂量、减少环境污染，有效解决现有农药易产生抗性、药效不明显等问题。
本发明的目的是提供一种布氏白僵菌菌株sb010。
本发明的另一个目的是提供一种苦参碱和布氏白僵菌联用的杀虫药。
本发明再一个目的是提供由上述苦参碱和布氏白僵菌联用的杀虫药在防治夜蛾科害虫方面的应用。
本发明的目的通过下述技术方案来实现：
一种布氏白僵菌菌株sb010，该菌株于2018年4月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），其保藏编号为gdmccno：60359。
该菌株是beauveriabrongniartiisb010，最初在土壤中分离而来，为中国本土菌株，并非从国外引进，能很好地适应本地的自然环境。
本发明还提供了一种苦参碱和布氏白僵菌联用的杀虫药，以苦参碱和布氏白僵菌为主要活性成分。
优选地，所述布氏白僵菌为所述布氏白僵菌菌株sb010。
优选地，苦参碱在杀虫药中的终浓度为0.05～1.5mg/ml。
更优选地，苦参碱在杀虫药中的终浓度为0.5～1.0mg/ml。
优选地，布氏白僵菌在杀虫药中的终浓度为1×105～1×109分生孢子/ml。
更优选地，布氏白僵菌在杀虫药中的终浓度为1×108～1×109分生孢子/ml。
优选地，所述布氏白僵菌为布氏白僵菌孢子悬浮液。
优选地，所述苦参碱为苦参碱水剂，水剂中苦参碱的浓度为1%～10%。
更优选地，所述水剂中苦参碱的浓度为5%。
优选地，所述杀虫药由1%～10%苦参碱水剂和1×105～1×109分生孢子/ml布氏白僵菌孢子悬浮液复配而成。
优选地，苦参碱水剂和布氏白僵菌孢子悬浮液的体积比为1：8～9。
更优选地，由5%苦参碱水剂和1×108～1×109分生孢子/ml布氏白僵菌孢子悬浮液复配而成，苦参碱水剂和布氏白僵菌孢子悬浮液的体积比为1：8～9。
为了更好地实现本发明，更进一步优选地，所述苦参碱和布氏白僵菌的用量比，按照如下标准进行：采用浓度为0.5mg/ml的苦参碱和1×108分生孢子/ml的布氏白僵菌菌液，按照1：9的体积比进行复配。
为了更好地实现本发明，更进一步优选地，所述苦参碱和布氏白僵菌的用量比，按照如下标准进行：采用浓度为1.0mg/ml的苦参碱和1×109分生孢子/ml的布氏白僵菌菌液，按照1：9的体积比进行复配。
为了更好地实现本发明，更进一步优选地，所述苦参碱和布氏白僵菌的用量比，按照如下标准进行：采用浓度为0.5mg/ml的苦参碱和1×108分生孢子/ml的布氏白僵菌菌液，按照2：8的体积比进行复配。
为了更好地实现本发明，更进一步优选地，所述苦参碱和布氏白僵菌的用量比，按照如下标准进行：采用浓度为1.0mg/ml的苦参碱和1×109分生孢子/ml的布氏白僵菌菌液，按照2：8的体积比进行复配。
另外，优选地，所述杀虫药是指防治夜蛾科害虫的农药。
即本发明提供了一种防治夜蛾科害虫的农药，其以苦参碱和布氏白僵菌为主要活性成分。
本发明经过大量探究和探索实验发现，苦参碱和布氏白僵菌联用能够产生显著的协同增效作用，对夜蛾科害虫具有显著的防治效果。
因此，上述苦参碱和布氏白僵菌联用的杀虫药，在作为或制备防治夜蛾科害虫农药方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述夜蛾科害虫为斜纹夜蛾。
本发明所述的杀虫药起杀虫作用的主要是苦参碱和布氏白僵菌的混合物，两者按照配方，按比例制备获得方便施用的效果即可。可以根据需要配以辅剂进行制备。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的杀虫剂中的苦参碱和布氏白僵菌产生了显著的协同增效作用，经长期的侵染生物学研究和室内生物测定，该布氏白僵菌与苦参碱的联合使用对斜纹夜蛾等夜蛾科害虫有很好的防治效果，在夜蛾科害虫的生物防治中具有非常强的应用潜力。
2、本发明的杀虫药防治效果好、可减少化学农药使用量，兼具低毒、抗药性低的特点，适应了有机食品生产的需求，对环境无污染、无残留，有利于延缓夜蛾科害虫抗药性的发生和发展。
附图说明
图1为bloc扩增电泳图，泳道1为菌株sb010，泳道m为dnamarker（dl2000），由dna片断100、250、500、750、1000和2000bp构成。
图2为菌株sb010的系统发育树。
图3为kepleretal.构建的beauveriabrongniartii系统发育树。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。本发明实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1布氏白僵菌sb010的筛选鉴定
1、采集分离白僵菌
布氏白僵菌菌株sb010最初在土壤中分离而来，为中国本土菌株。
采集土壤样品，采样时取表土下10～15cm处土壤100g左右，用塑料袋封装后带回实验室处理。土壤样品过筛去掉石粒和杂物，然后取净土10g悬浮于90ml0.1%的吐温80溶液中，摇匀，静置15min，取其上清液2ml稀释于8ml0.05%吐温80中，配制为土壤悬浮液。将0.1ml土壤悬浮液接种于孟加拉红琼脂培养基平板上，用三角玻璃刮子将悬浮液推匀于平板表面下，25℃培养3～7d，然后用接种环切取单菌落，接种于pda板上继续培养，得到布氏白僵菌菌株sb010。切取菌丝块移植于pda斜面，继续培养，4℃下保藏于冰箱中。
2、鉴定方法
采用ctab法提取dna，包括以下步骤：
（1）将布氏白僵菌菌株sb010在pda平板上培养一周后，小心刮取菌丝体于研钵中，加入液氮迅速充分研碎；
（2）取适量研碎的菌丝体迅速转移到离心管中，加入300μl经65℃预热的dna提取液裂解液，充分混匀，加入等体积的氯仿/异戊醇（24/1）混合液混匀，65℃下水浴1h，10min左右轻轻震荡一次，12000rpm常温条件下离心5min；
（3）缓慢吸取上清液于另一新离心管中，缓慢加入等体积的氯仿/异戊醇（24/1）混合液进行再次抽提，12000rpm常温条件下离心5min；
（4）缓慢吸取上清液于另一新离心管中，加入1/10体积的醋酸钠，等体积预冷的异丙醇，室温静止15min；
（5）加入70%乙醇洗涤沉淀2次；
（6）移液枪紧贴管壁缓慢吸出乙醇，置于超净工作台内吹干；
（7）所得沉淀溶于50μl的te中；
（8）用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，其余提取物置于-20℃条件下保存。
真菌dna的pcr所用引物为通用引物：b5.1f：5’-cgacccggccaactactttga-3’和b3.1r：5’-gtcttccagtaccactacgcc-3’。扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。
50μl反应体系如下：
pcr产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（含eb），缓冲液为1×tae，电压150v、电流220ma，markerdl2000作为分子量标准参照物，电泳结束后，在凝胶成像仪上检测并拍照记录。
特异性pcr产物委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。序列比对与发育树构建：测序结果用blast搜索同源性较高的相关序列，使用mega5.1软件中的clusterw进行序列比对和多重序列比对。并在该软件中构建neighbour-joining（nj）系统发育树。
2、鉴定结果
（1）如图1所示，每个泳道的电泳条带比较清晰，可以根据pcr产物的迁移距离来准确判断该菌株的基因片段约为1500bp。
（2）将得到的该菌株基因型的bloc序列和从genbank下载的3株白僵菌菌相关序列组合，构建分子系统树，结果如图2所示，sb010菌株属于cordycepsbrongniartii，根据kepleretal.（2017）的发表的文章说明（图3），cordycepsbrongniartii与beauveriabrongniartii为同一种，因此sb010菌株也属于beauveriabrongniartii，为布氏白僵菌。
综合形态学特征与生理生化特性鉴定结果显示，该菌株属于布氏白僵菌属，命名为sb010，并于2018年4月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），保藏编号为gdmccno：60359，保藏地址为中国广州。
实施例2一种苦参碱水剂与布氏白僵菌联用的杀虫药
1、实验材料
本发明使用的苦参碱为0.5%苦参碱水剂，由广东新景象生物工程有限公司提供。
本发明使用的布氏白僵菌sb010菌株孢子悬浮液的最初浓度为1×109分生孢子/ml，经逐步稀释法稀释到较低浓度用于实验。各组用于实验的布氏白僵菌和苦参碱的不同浓度和组合如表1所示。
表1用于实验的布氏白僵菌和苦参碱的不同浓度和组合
注：mt=苦参碱（matrine），bb=布氏白僵菌（beauveriabrongniartii）；ct1（1：9）、ct2（2：8）表示苦参碱与布氏白僵菌以不同体积比组合对斜纹夜蛾毒力测定。
2、配制方法
（1）ct1组：mt和bb的体积比为1：9，直接将两部分混匀得到；其中mt采用的是5%苦参碱水剂，将白僵菌分生孢子加入到0.05%吐温-80中，计算孢子浓度。共分为2小组，配制后终浓度具体包括：
①、mt：0.5mg/ml苦参碱+bb：1×109分生孢子/ml布氏白僵菌分生孢子悬浮液。
②、mt：0.5mg/ml苦参碱+bb：1×108分生孢子/ml布氏白僵菌分生孢子悬浮液。
（2）ct2组：mt和bb的体积比为2：8，直接将两部分混匀得到；其中mt采用的是5%苦参碱水剂，将白僵菌分生孢子加入到0.05%吐温-80中，计算孢子浓度。共分为2小组，配置后终浓度具体包括：
①、mt：1.0mg/ml苦参碱+bb：1×109分生孢子/ml布氏白僵菌分生孢子悬浮液。
②、mt：1.0mg/ml苦参碱+bb：1×108分生孢子/ml布氏白僵菌分生孢子悬浮液。
实施例3复配剂对斜纹夜蛾的室内毒力测定
1、实验方法
（1）室内毒力测定时，按实施例1的方法将苦参碱、白僵菌配制成所需浓度，每个处理设5个浓度梯度，每个浓度设3个重复，每个重复20头虫。
（2）首先将斜纹夜蛾饲料切成1cm×1cm的小方块，浸入药液约5s后取出，吸去多余药液后放入接有斜纹夜蛾二龄幼虫的小盒子中，至于饲养室中饲养。饲养条件为温度25～28℃，rh为65%～75%，光照为l：d=14h：10h。
（3）每隔两天更换一次新的饲料并清理小盒子，于药后7天内观察记录斜纹夜蛾存活情况，计算校正死亡率。
2、数据分析
所有处理的死亡率反正弦平方根转换后用单因素方差分析（anova）进行分析，当f值显著时用邓肯氏复差法（dmrt）分析平均值。
校正死亡率=[(处理组死亡率－对照组死亡率）/（1－对照组死亡率）]×100%。
卡方检验用于确定苦参碱和布氏白僵菌之间的相互作用。首先对数据进行校正，并转换成比例（即0－100%→0－1）。无相互作用的预期死亡率计算如下：
me=ma+mb×（1－ma）；
х2=[（mab－me）×100]×[（mab-me）×100]/（me×100）
其中，ma、mb和mab分别是苦参碱、布氏白僵菌和两者组合观察到的死亡率；me是加法死亡率的预期死亡率。
3、室内毒力测定结果：其测定结果如表2所示。
表2各单剂及其组合物对斜纹夜蛾二龄幼虫3d、5d和7d的毒力测定结果
单独使用不同浓度的苦参碱（0.05、0.125、0.25、0.5和1.0mg/ml）处理斜纹夜蛾，第七天的死亡率分别为3.67%、29.00%、32.58%、45.30%和55.67%；单独使用不同浓度的布氏白僵菌（1×105、1×106、1×107、1×108和1×109分生孢子/ml）处理斜纹夜蛾，第七天的死亡率分别为15.52%、42.37%、46.34%、49.06%和51.02%。
而不同浓度苦参碱与不同浓度布氏白僵菌不同比例（mt+bb）组合对斜纹夜蛾表现很高的死亡率。0.5mg/ml苦参碱与1×108布氏白僵菌按体积比1：9混合联用的死亡率为91.64%；0.5mg/ml苦参碱与1×109布氏白僵菌按体积比1：9混合联用的死亡率为96.74%；1.0mg/ml苦参碱与1×10布氏白僵菌按体积比2：8混合联用的死亡率为96.52%；1.0mg/ml苦参碱与1×109布氏白僵菌按体积比2：8混合联用的死亡率为100%。
并且利用计算得到的校正死亡率代入公式中，运算得到的卡方值均高于3.841，显示苦参碱和布氏白僵菌配合使用具有显著的协同增效作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。