本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种脐血单个核细胞冻存液及其应用。
背景技术：
脐血单个核细胞(cordbloodmononuclearcell，cbmc)，指脐血中具有单个核的细胞，包含造血干细胞、淋巴细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞和其它少量细胞。cbmc在体内可促进机体造血，增强机体免疫力；在体外可诱导分化成多种免疫细胞，如细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)、自然杀伤细胞(nk)、自然杀伤性t细胞(nkt)，在抗肿瘤、抗感染等方面具有重大用途。因此，冻存cbmc在细胞治疗方面具有很重要的意义。
细胞冻存是细胞长期保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于
-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。
细胞冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。为了将细胞冻存、复苏过程中细胞的损伤降至最低，必须进一步优化化学和温度操作过程，但需要在冻存前加入一种或一种以上的冻存保护剂，在溶解后又将其去除。目前最常用的冻存保护剂为二甲基亚砜(dmso)，这种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，减少胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。由于高浓度dmso对细胞有毒性，还必须添加其他的液体成分，如血清、细胞培养基，以降低dmso的浓度，减少对细胞的伤害。
现有冻存cbmc的冻存液配方多采用dmso联合动物血清，具有传播病原体的潜在隐患，而采用培养基则限制了其在临床上直接应用的可能性。目前干细胞冻存液所使用的胎牛血清常携带动物源性病毒，比如欧洲多个国家发生疯牛病，其血清中含有导致疯牛病的病毒，用于冻存细胞会导致此类病毒传播。此外，有研究表明长期与胎牛血清接触的干细胞会对溶液介质中的胎牛血清发生内吞，内吞胎牛血清后的干细胞有可能发生某些蛋白表达的变化，应用于人体后有可能发生异种动物蛋白引起的免疫反应，从而导致干细胞移植后成功率降低以及不良反应的发生。因此，中国药品和食品质量监督管理局2003年发布的《人体细胞治疗临床研究和质量控制指导原则》明确指出，应尽量避免使用动物血清培养细胞。
细胞培养基也是目前的冻存液配方中常见的成分，其成分复杂，不能直接注射入人体，故如果需要细胞复苏后直接移植，则必需通过离心把细胞培养基去除掉，而离心又会导致刚刚复苏的细胞受损，活率降低，影响细胞治疗效果。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种脐血单个核细胞冻存液、应用、制备方法。本发明的cbmc冻存液不采用动物血清，避免了血清传播动物源性病原体的风险。而且，采用本发明的冻存液，细胞复苏后活率更高，显示其更好的冻存效果。此外，本发明的cbmc冻存液配方不含培养基，细胞复苏后可直接用于临床回输，提高了其在临床应用方面的价值。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种脐血单个核细胞冻存液，包括如下组分：
本发明摒弃采用动物血清、细胞培养基作为冻存液成分之一，而采取了羟乙基淀粉，并联合dmso、丙二醇、人白蛋白、缓冲液，用于冻存cbmc，既避免了传播潜在病原体的风险，提高了细胞冻存的安全性，又确保了cbmc的冻存效果，并且不含细胞培养基，cbmc复苏后可以直接回输人体，在临床上具有很大的实用价值。
其中dmso易穿透细胞，在细胞冻存过程中可以使冰点下降，减少胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。羟乙基淀粉则起到稳定细胞膜的作用，避免细胞遭受冻存伤害。缓冲液则维持电解质平衡，使细胞处于一种比较温和的更接近体内环境的溶液中。
在本发明的一些具体实施方案中，缓冲液为pbs缓冲液。
具体的，pbs：1l配方ph7.4：磷酸二氢钾(kh2po4)：0.27g；
磷酸氢二钠(na2hpo4)：1.42g；
氯化钠(nacl)：8g；
氯化钾(kcl)0.2g；
加去离子水约800ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调ph至7.4，最后定容到1l。
本发明的cbmc冻存液不采用动物血清，避免了血清传播动物源性病原体的风险。而且，采用本发明的冻存液，细胞复苏后活率更高，显示其更好的冻存效果。
此外，本发明的cbmc冻存液配方不含培养基，细胞复苏后可直接用于临床回输，提高了其在临床应用方面的价值。
在本发明的一些具体实施方案中，脐血单个核细胞冻存液包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，脐血单个核细胞冻存液包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，脐血单个核细胞冻存液包括如下组分：
在本发明的一些具体实施方案中，脐血单个核细胞冻存液包括如下组分：
本发明还提供了所述脐血单个核细胞冻存液在冻存脐血单个核细胞中的应用。
本发明还提供了一种脐血单个核细胞的冻存方法，用所述脐血单个核细胞冻存液冻存所述脐血单个核细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，冻存方法包括如下步骤：
步骤1：获得脐血单个核细胞；
步骤2：重悬所述脐血单个核细胞，获得脐血单个核细胞悬液；
步骤3：取所述脐血单个核细胞悬液与所述脐血单个核细胞冻存液混合，分装，冻存。
在本发明的一些具体实施方案中，所述脐血单个核细胞细胞在所述细胞冻存液中的最终密度为1×107/ml～5×108/ml。
在本发明的一些具体实施方案中，冻存方法中步骤1所述获得脐血单个核细胞具体为获得添加枸橼酸钠抗凝剂的脐血，用rpmi1640培养基1:1稀释后，添加到淋巴细胞分离液ficoll上，700g离心30min，吸取脐血单个核细胞层，用rpmi1640培养基洗涤2遍，250g离心5min，获得脐血单个核细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，冻存方法中步骤2重悬所述脐血单个核细胞具体为用缓冲液重悬cbmc。作为优选，脐血单个核细胞悬液的细胞密度为5×107/ml。
作为优选，分装为将细胞悬液分装于冻存管内，每管1ml。将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3所述冻存为：当温度不低于-20℃时，降温速率为-2～-3℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-11℃～-15℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
具体的，本发明提供的脐血单个核细胞的冻存方法具体为：
1)cbmc的分离：将添加枸橼酸钠抗凝剂的脐血用rpmi1640培养基1:1稀释后，添加到淋巴细胞分离液ficoll上，700g离心30min，吸取脐血单个核细胞层，用rpmi1640培养基洗涤2遍，250g离心5min，得到cbmc。
2)cbmc的冻存：当温度不低于-20℃时，降温速率为-2～-3℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-11℃～-15℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
本发明摒弃采用动物血清、细胞培养基作为冻存液成分之一，而采取了羟乙基淀粉，并联合dmso、丙二醇、人白蛋白、缓冲液，并联合dmso，用于冻存cbmc，既避免了传播潜在病原体的风险，提高了细胞冻存的安全性，又确保了cbmc的冻存效果，并且不含细胞培养基，cbmc复苏后可以直接回输人体，在临床上具有很大的实用价值。
本发明的cbmc冻存液不采用动物血清，避免了血清传播动物源性病原体的风险。而且，采用本发明的冻存液，细胞复苏后活率更高，显示其更好的冻存效果。冻存2个月后，用本发明冻存液冻存的cbmc复苏后细胞活率平均值为97.47％～98.43％，极显著(p＜0.01)高于对照组1
(10％dmso+90％fbs)的冻存效果，显著(p＜0.05)高于对照组2的冻存效果。
此外，本发明的cbmc冻存液配方不含培养基，细胞复苏后可直接用于临床回输，提高了其在临床应用方面的价值。
具体实施方式
本发明公开了一种脐血单个核细胞冻存液、应用、制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的脐血单个核细胞冻存液、应用、制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
脐血单个核细胞可有市场购得，或者按照本发明所述方法制得。
羟乙基淀粉(6％羟乙基淀粉40氯化钠注射液，山东科伦药业有限公司)。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
将上述组分混合即得。
实施例2
将上述组分混合即得。
实施例3
将上述组分混合即得。
实施例4
将上述组分混合即得。
实施例5
将上述组分混合即得。
实施例6
实验分组：
实验组：实施例1～5制得的细胞冻存液；
对照组1：传统配方的冻存液，即10％dmso+90％fbs；
对照组2：20％dmso+60％羟乙基淀粉+余量的勃脉力a。
1.cbmc的分离
1.1用10ml一次性移液管将添加枸橼酸钠抗凝剂的30ml脐血转移到50ml离心管中，800g离心10min。
1.2离心结束后用巴氏吸管吸去上层血浆，用10ml一次性移液管加入20ml生理盐水稀释，混合均匀。
1.3另取一支新的50ml离心管，用10ml一次性移液管每管加入12ml淋巴细胞分离液(血液稀释液：淋巴分离液＝2:1)，用10ml一次性移液管将稀释后的血液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。
1.4700g离心30min，离心升降速率改为0。
1.5离心后从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、脐血单个核细胞层(cbmc层)、血浆层。用巴氏吸管将cbmc层吸出，转移至另一支50ml离心管中。
1.6用10ml一次性移液管加生理盐水至40ml，重悬cbmc，400g离心5min。
1.7离心结束后弃上清，用一次性移液管加入40ml生理盐水充分重悬细胞后，取20μl细胞悬液于1.5mlep管中，用细胞计数仪进行计数，
其余悬液250g离心5min。
1.9去上清，得到cbmc。
1.10取1×106个上述细胞，进行流式检测其表面抗原，结果显示，cd34表达率为1.0％。
2.cbmc的冻存
2.1取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用pbs清洗。
2.2去除pbs，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；
2.3离心1000rpm，5min；
2.4去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
2.5将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；
2.6在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
2.7冻存：标准的冻存程序为当温度不低于-20℃时，降温速率为-2～-3℃/min；当温度低于-20℃时，降温速率为-11℃～-15℃/min；当温度为-100℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-70℃过夜后移入液氮保存。
3.cbmc的复苏
3.1往水浴锅中加入灭菌水，并将温度调节至37℃；从液氮中取出2.7冻存的细胞a、b两组各3管，立即投入37℃温水中轻轻晃动，直至冻存液完全溶解；
3.2用75％乙醇擦拭冻存管盖子，火焰烧灼冻存管盖子；打开冻存管盖子，往冻存管中缓缓加入4℃预冷rpmi1640培养基1ml，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到50ml离心管内；再次往冻存管中加入1ml4℃预冷rpmi1640培养基，1ml枪头吹打洗涤，一并移入离心管中；
3.3往离心管中缓缓加入4℃预冷rpmi1640培养基15ml，200g离心5min，弃上清液；
3.4向离心管中加入4℃预冷rpmi1640培养基5ml，轻轻吹打混匀，取样10μl进行计数，并计算细胞活率。
3.5结果显示，冻存2个月的cbmc复苏后，本发明冻存液配方的细胞活率平均值为97.47％～98.43％。
本发明的冻存液冻存效果极显著(p＜0.01)高于对照组1，显著(p＜0.05)高于对照组2，这说明本发明冻存液配方冻存效果更好(见表1)。3.6取1×106个复苏后的cbmc，进行流式检测其表面抗原，结果显示，cd34表达率为1.0％，与冻存前无明显差异。
4.cbmc向nkt细胞诱导：
4.1得到cbmc后，加入x-vivo15培养基,使细胞密度为1×106/ml，重悬细胞沉淀，接种于t75细胞培养瓶中，并添加20-300u/mlil-2、5-50ng/mlil-15。
4.2此后，每3天取20ul细胞悬液进行计数，当细胞密度大于2×106/ml时，添加x-vivo15培养基，使细胞密度为1×106/ml，添加20-300u/mlil-2、5-50ng/mlil-15。
4.3培养第14天，收集nkt细胞。进行细胞表面抗原cd3、cd56检测，以及针对肿瘤细胞的杀伤活性实验。
4.4流式检测结果显示，nkt细胞培养14天后，cd3+cd56+细胞为41.2％，显示诱导效果良好。nkt对肿瘤细胞k562的杀伤活性，在nkt对k562细胞比例为40:1时，其杀伤率可达到44.7～45.9％，显示其杀伤活性良好(表2)。
5.cbmc向cik细胞诱导：
5.1得到cbmc后，按照1×106/ml的密度加入x-vivo15培养基重悬细胞沉淀，接种于t75细胞培养瓶中，并根据添加的培养基加入500-2000u/mlifn-λ，诱导培养cik细胞。
5.2第2天全量补加5-50ng/mlokt-3和100-500u/mlil-2。
5.3此后，每3天取20ul细胞悬液进行计数，当细胞密度大于2×106/ml时，添加x-vivo15培养基，使细胞密度为1×106/ml，并加入100-500u/mlil-2。
5.4第14天，收集cik细胞。进行细胞表面抗原cd3、cd56检测，以及针对肿瘤细胞的杀伤活性实验。
5.5流式检测结果显示，cik细胞培养14天后，cd3+cd56+细胞为33.5％，显示诱导效果良好。cik对肿瘤细胞hl60的杀伤活性，在cik对hl60细胞比例为20:1时，其杀伤率可达到66.3～67.5％，显示其杀伤活性良好(表3)。
表1冻存2个月后，用本发明冻存液冻存的cbmc复苏后细胞活率
注:*示与对照组1相比具有显著差异(p＜0.05)；**示与对照组1相比具有极显著差异(p＜0.01)；
#示与对照组2相比具有显著差异(p＜0.05)；##示与对照组2相比具有极显著差异(p＜0.01)；
表1结果表明，冻存2个月后，用本发明冻存液冻存的cbmc复苏后细胞活率平均值为97.47％～98.43％，极显著(p＜0.01)高于对照组1，显著(p＜0.05)高于对照组2的冻存效果。
表2nkt对肿瘤细胞k562的杀伤活性
表2结果表明，nkt对肿瘤细胞k562的杀伤活性较好。
表3cik对肿瘤细胞hl60的杀伤活率
表3结果表明，cik对肿瘤细胞hl60的杀伤活率良好。
实验结果表明，本发明实施例1～5提供的cbmc的无血清冻存液，冻存效果良好，冻存2个月后，用本发明冻存液冻存的cbmc复苏后细胞活率平均值为97.47％～98.43％，极显著(p＜0.01)高于对照组1(10％dmso+90％fbs)的冻存效果，显著(p＜0.05)高于对照组2的冻存效果。细胞复苏后既可直接用于临床，又可在体外诱导成免疫细胞nkt、cik。
综合上述实验结果，本发明提供的cbmc的无血清冻存液，由dmso、羟乙基淀粉、丙二醇、人白蛋白、缓冲液组成，不含动物血清、细胞培养基，且冻存效果良好，细胞复苏后既可直接用于临床，又可在体外诱导成免疫细胞nkt、cik，在临床上颇具应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。