一种提高牛樟芝有效成分的生产方法与流程

本发明涉及牛樟芝的生产领域，尤其涉及一种用松科植物作为宿主进行牛樟芝的培育方法。

背景技术：

牛樟芝简称“樟芝”，学名为antrodiacamphorata，俗名牛樟菇、红樟芝、樟内菇、樟菇、血灵芝等，属于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属、多年生蕈菌类，拉丁名为antrodiacamphorata，是1990年才被生化界公开发布的新种。牛樟芝的生长区域为台湾山区海拔450～2000米山林间，只生长在台湾特有的百年以上牛樟树树干腐朽的心材内壁。牛樟树木材表面潮湿，牛樟芝采集不易，加上野生牛樟树作为台湾保育类树种，经清末到日据时代的大量砍伐已所剩无几。且牛樟芝具有解毒保肝、抗癌、强化免疫、抗过敏、降血脂等神奇功效，素来享有“药芝之王”、“台湾森林中之红宝石”的美誉。因此，牛樟芝的身价随着野生牛樟树的骤减达到鼎盛。

2012年从牛樟芝中已分离得到的化合物约225种。这些化合物包括大分子化合物(蛋白，核酸，多糖等)，小分子化合物(木质素，芳香族化合物，苯醌类，马来酸和琥珀酸衍生物等)，萜类化合物(单萜，二萜，羊毛甾烷型三萜，麦角甾烷型三萜，甾体等)，核苷酸类化合物(碱基，核苷等)，脂肪酸以及脂肪酸酯等。其中，三萜类和多醣体是使牛樟芝地位远远高于灵芝的关键成分，也是牛樟芝人工培育的主要目标提取物质。

牛樟芝的人工培育大致可以分为椴木栽培法、固体培养法、液体发酵法三种。利用牛樟芝原有宿主牛樟树椴木为培养基栽培牛樟芝，能获得与野生牛樟芝相同的成分和功效，但培养时间长达2～3年，而且由于野生牛樟树数量稀少，及其珍贵，这种培养手段成本太高。第二种将牛樟芝菌种在太空包中进行菌丝体培养，太空包内含有纤维物、醣类和五谷杂粮类等，获得的牛樟芝产品与野生牛樟芝外形相似但成分迥异，培养时间约3个月，培养成本稍高。第三种是利用500公升甚至吨级以上的液体发酵槽进行菌种液体发酵以收取菌丝体，培养时间短，约7～14天左右，此方法无法取得野生牛樟芝特有的三萜类。

中国发明专利cn104472210b公开的牛樟芝培育方法结合了第一种和第三种培育方法，将牛樟芝菌种置于牛樟芝椴木上进行初步培育，待长出菌丝体后置于液体发酵培养基中进行发酵培养，培养时间为8～12天，得到成品牛樟芝，此专利的技术方案与第一种方法一样采用甚为珍稀的牛樟树椴木作为宿主，在避免盗采牛樟树的提倡下，此方法不适于进行量产推广和大规模实际应用，而且该技术方案所得到的牛樟芝与野生牛樟芝相比，其形态与有效成分均未做说明。

技术实现要素：

为此，需要提供一种提高牛樟芝有效成分的生产方法，来解决提高人工培育牛樟芝有效活性成分、缩短生产周期和降低生产成本的问题。

为实现上述目的，发明人提供了一种提高牛樟芝有效成分的生产方法，包括以下步骤：

准备松木椴木：取树径为20～40cm的二叶松、三叶松或五叶松的树干，将其截成长度为40～50cm的椴木，得到松木椴木；

制备接种原基：从所述松木椴木的一个端面沿所述松木椴木的轴向钻取空腔，得到接种原基；

制备接种基：将所述接种原基进行真空干燥、灭菌，置于培养基中，所述培养基包含重量百分数为5～15％的玉米胜肽，得到接种基；

接种：将牛樟芝菌液植入所述空腔中；

子实体生长管理和收割：保持牛樟芝菌液的生长温度在20～25℃，每隔8～10天通一次高氧空气，一次通气时间为2h，通气流量为80～150vvm，通气4～6次，得到牛樟芝子实体，进行收割。

松科植物的化学成分较复杂，但其共同的特点是多含有树脂及挥发油，缺乏生物碱，缺少双黄酮。树脂贮存在树脂道内，与挥发油共存。树脂中含有多种有机酸(如松香中含有90％以上的树脂酸)，还有树脂醇、树脂酯及大量的树脂烃类。挥发油含于针叶及树脂中，挥发油中含有多种烯类。松树最明显的特征是叶成针状，常2针、3针或5针一束，称为二叶松、三叶松和五叶松，如油松、马尾松、黄山松的叶2针一束，白皮松的叶3针一束，红松、华山松、五针松的叶5针一束。在实现本发明的过程中，发明人发现二叶松、三叶松和五叶松等松科植物，水松、秃杉等杉科植物与牛樟树一样具有类似的芳香性物质及挥发油，但是水松、秃杉等杉科植物作为宿主会使牛樟芝菌种的培育过程中吸收宿主体内的毒性物质，影响牛樟芝产品的品质，因此，本发明采用二叶松、三叶松或五叶松的椴木作为牛樟芝的宿主，通过多次试验验证，由该技术方案得到的牛樟芝多醣体和总三萜含量与野生牛樟芝相当，但不会增加其毒性。

培养基中添加重量百分数为5～15％玉米胜肽的好处在于，使采用本方案生产的牛樟芝子实体中多醣体和总三萜的含量与野生牛樟芝相当，提升人工栽培牛樟芝的品质和保健价值。

进一步地，所述高氧空气为含氧量80～100％的空气。

传统的牛樟芝人工栽培法中，初发酵和后发酵阶段氧气的浓度多控制在5～15％，而经过试验反复摸索验证，发明人发现通入含氧量80～100％的空气，牛樟芝菌种在宿主椴木上能快速地速度吸收转化培养基中的营养，进而迅速成长为子实体。

进一步地，所述空腔为直径1.5～3cm，深12～16cm的圆柱腔体。

空腔的作用在于为牛樟芝菌液提供生长环境，这个生长环境并非越大越好，也并非越小越好，经过大量实验检测，直径1.5～3cm，深12～16cm的圆柱腔体可以使二叶松、三叶松或五叶松的椴木松脂气味释出浓度处于牛樟芝生长所需的最适浓度范围。

进一步地，所述空腔数量为1～15个。

空腔作为植入牛樟芝菌液和通入高氧空气的通道，从松木椴木一端沿其轴向向另一端钻取时，可以视椴木径的粗细和培养基中营养成分的含量，钻取1～15个空腔，空腔的分布尽量保持间隔均匀，这样可以保证到达松木椴木侧面和端面各个点的菌种和氧气浓度相对均衡，松木椴木底部所浸泡的培养基被维管束吸附输送到椴木侧面和端面各个点的营养成分也相对均衡。

进一步地，所述培养基按重量百分数计，还包含如下成分：35％马铃薯提取液，20％葡萄糖，0.2％kh2po4，0.1％mgso4·7h2o，0.1％维生素b1、0.1％维生素b2。

区别于现有技术，上述技术方案具有如下优点：1.采用二叶松、三叶松或五叶松的树干作为人工栽培牛樟芝的宿主，避免了人们对保育类树种野生牛樟树的乱砍滥伐，同时也使牛樟芝大规模的人工栽培实现量产提供优良技术方案；2.将含有牛樟芝菌液的宿主椴木置于含玉米胜肽的培养基中，大大提高了牛樟芝成品多醣体和总三萜含量；3.往宿主椴木的空腔中通入高氧空气，加快了牛樟芝菌种的生长繁衍速度，缩短了人工栽培牛樟芝的周期。

附图说明

图1为本实施例一种利用五叶松椴木在含玉米胜肽的培养基中通入高氧空气培养牛樟芝的示意图；

图2为本实施例一种利用二叶松或三叶松椴木在含玉米胜肽的培养基中通入高氧空气培养牛樟芝的示意图。

附图标记说明：

1、接种基；

2、空腔；

3、培养基；

4、高氧空气通气口。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

总三萜含量和多醣体含量的测定均为紫外-可见分光光度法。

实施例一

牛樟芝菌种采购自台湾神农真菌生物技术有限公司，菌种编号ac001，保藏在国家菌草工程技术研究中心。

1.利用五叶松椴木在含玉米胜肽的培养基中通入高氧空气培养牛樟芝

请参阅图1，本实施例提供一种用五叶松椴木作为宿主提高牛樟芝有效成分的生产方法，包括以下步骤：

准备松木椴木：取树径为20cm五叶松的树干，将其截成长度为40cm的椴木，得到五叶松松木椴木；

制备接种原基：从上述五叶松松木椴木的一个端面的中心位置沿所述松木椴木的轴向钻取一个直径为3cm、深16cm的空腔2，得到接种原基；

制备接种基：将所述接种原基进行真空干燥、紫外灯照射灭菌后，置于培养基中，所述培养基3按重量百分数计，包含0～15％玉米胜肽，35％马铃薯提取液，20％葡萄糖，0.2％kh2po4，0.1％mgso4·7h2o，0.1％维生素b1、0.1％维生素b2，得到接种基1；

接种：将牛樟芝菌液用不锈钢管植入所述接种基的空腔中，所述牛樟芝菌液为牛樟芝菌种经常规方法活化、扩培得到的种子液，并通入含氧量为80％的高氧空气；

子实体生长管理和收割：保持牛樟芝的生长温度在22℃，每隔10天自通气口4通一次所述高氧空气，一次通气时间为2h，通气流量为100vvm，通气6次，当观察到松木椴木上出现呈橘红色的子实体，即得到牛樟芝产品，进行收割。

2.利用五叶松椴木在含玉米胜肽的培养基中通入空气培养牛樟芝

与利用五叶松椴木在含玉米胜肽的培养基中通入高氧空气培养牛樟芝不同的是在子实体生长管理和收割步骤中，保持牛樟芝的生长温度在22℃，每隔10天自通气口4通一次普通空气，一次通气时间为2h，通气流量为100vvm，通气6次，当观察到松木椴木上出现呈橘红色的子实体，即得到牛樟芝产品，进行收割。

在不同含量玉米胜肽的培养基中培养的牛樟芝在每次通气时进行采样，检测上述两种培养方法所得到的牛樟芝中总三萜和多醣体含量，结果如表1和表2所示。

表1添加不同含量玉米胜肽五叶松木培养牛樟芝中总三萜含量(单位：g/100g)

表2添加不同含量玉米胜肽五叶松木培养牛樟芝中多醣体含量(干重，单位：g/100g)

从表1和表2的数据可知：1.在相同含量玉米胜肽的培养基中，通入高氧空气培养得到的牛樟芝，其总三萜和多醣体含量均高于通入普通空气培养得到的牛樟芝；2.同样都是通入高氧空气培养得到的牛樟芝，其总三萜和多醣体含量随着培养基中玉米胜肽含量的增加而增加；3.从采样检测数据比较可知，从第10天至第40天采样检测得到的总三萜和多醣体含量呈递增趋势，第40天至第60天之后总三萜和多醣体含量变化不大。综上可知，利用五叶松椴木培养在含玉米胜肽的培养基中培养牛樟芝的优化条件为：通入含氧量为80～100％的高氧空气，培养基中玉米胜肽的含量为10～15％，培养40天左右开始采收。

实施例二

牛樟芝菌种采购自福州绿谷生物药业技术研究所，菌种编号ac1404，保藏在国家菌草工程技术研究中心。

请参阅图2，本实施例提供一种用二叶松椴木作为宿主提高牛樟芝有效成分的生产方法，包括以下步骤：

准备松木椴木：取树径为30cm二叶松的树干，将其截成长度为50cm的椴木，得到二叶松松木椴木；

制备接种原基：从上述二叶松松木椴木的一个端面沿所述松木椴木的轴向向另一端面钻取8个直径为2cm、深14cm的空腔2，得到接种原基；

制备接种基：将所述接种原基进行真空干燥、紫外灯照射灭菌后，置于培养基中，所述培养基3按重量百分数计，包含15％玉米胜肽，35％马铃薯提取液，20％葡萄糖，0.2％kh2po4，0.1％mgso4·7h2o，0.1％维生素b1、0.1％维生素b2，得到接种基1；

接种：将牛樟芝菌液用不锈钢管植入所述接种基的空腔中，所述牛樟芝菌液为牛樟芝菌种经常规方法活化、扩培得到的种子液，并自通气口4通入含氧量为100％的空气；

子实体生长管理和收割：保持牛樟芝的生长温度在25℃，每隔8天通一次所述高氧空气，一次通气时间为2h，通气流量为80vvm，通气5次，当观察到松木椴木上出现呈橘红色的子实体，即得到牛樟芝产品，进行收割。

实施例三

牛樟芝菌种采购自福州绿谷生物药业技术研究所，菌种编号ac620，保藏在国家菌草工程技术研究中心。

与实施例二不同的是，本实施例所采用的松木椴木为三叶松的树干，树干径为40cm，高度为40cm，钻取的空腔为直径1.5cm、深12cm，数量为15个，所述培养基中包含5％玉米胜肽，35％马铃薯提取液，20％葡萄糖，0.2％kh2po4，0.1％mgso4·7h2o，0.1％维生素b1、0.1％维生素b2，培养过程中通入含氧量为90％的空气，子实体培养过程中，保持牛樟芝的生长温度在20℃，每隔9天通一次所述高氧空气，一次通气时间为2h，通气流量为150vvm，通气4次。

采用上述技术方案，自牛樟芝菌液植入到松木椴木空腔中到牛樟芝子实体采收，产品生产的周期从野生牛樟芝的培养期2～3年缩短到40～60天，每100g牛樟芝子实体的总三萜含量可高达9.3g，多醣体含量高达4.9g，与野生牛樟芝总三萜和多醣体含量最接近。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。