一种天使红软籽石榴组织培养快繁方法与流程

本发明涉及植物组织培养领域，具体地说，涉及一种天使红软籽石榴组织培养快繁方法。
背景技术：
石榴（punicagranatuml.），属于千屈菜科（lythraceae）石榴属(punical.)果树，具有较高的营养价值和保健功能，近年来石榴越来越受到消费市场的青睐，石榴产业在国内外发展迅速。软籽石榴的种皮较软，种仁退化，籽粒大，在鲜食消费方面具有较高的价值。目前我国石榴栽培中软籽品种所占比例相对较少，市场售价是普通品种的2-4倍，市场前景广阔。天使红软籽石榴是从美国引进的优良软籽石榴品种，果个中等，果皮红色，酸甜适口，出汁率高，株型矮小，优质高产。由于天使红软籽石榴品种珍贵、资源较少，利用常规的育种方法无法满足当前生产与市场需求，无法实现植物组织培养繁殖速度快、保持原有品种的优良性状、可进行周年工厂化生产等优势。目前，还没有天使红软籽石榴的组培快繁研究报道。技术实现要素：为克服上述技术问题，本发明提供一种天使红软籽石榴组织培养快繁方法，该方法简单、可操作性强，为快速、稳定的繁殖天使红软籽石榴提供了高效可行的途径，为工厂化生产优良苗木奠定了理论基础。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种天使红软籽石榴组织培养快繁方法，包括以下步骤：1）采集幼嫩的茎段为外植体，用75%的酒精消毒30s后用0.1%的升汞消毒10min，无菌水充分清洗；2）将消毒后的茎段接种在配方为wpm+2g/lpvp+0.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba的不定芽诱导培养基上。3）待不定芽长出后，选用诱导过程中产生的叶片，切去叶片两端并切断叶脉接种到配方为wpm+0.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba的叶片愈伤组织诱导及分化诱导培养基。4）将由茎段诱导产生的不定芽和由叶片愈伤分化产生的不定芽接种到配方为wpm+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba的增殖培养基上。5）剪取生长健壮、长5-6cm的单苗进行生根培养，生根培养基为1/2ms+0.7mg/liba+0.2g/lpvp。6）当单苗根长达到3-4cm的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶炼苗5-20d左右，遮阴度宜为50%-70%，然后打开瓶口，再放置3-7d；当组培苗根长达到5-6cm且植株长势良好时进行移栽。移栽基质选择草炭和蛭石以2:1的比例混合，充分混合后用高温灭菌。移栽环境的温度在25-28℃，湿度在80％-85％，光照时间每天12-14h。进一步的技术方案，所述的步骤2）、3）、4）中的wpm基本培养基包含6.5g/l琼脂和30g/l蔗糖，以及包括以下成分：nh4no3400mg/l、ca(no3)2·4h2o556mg/l、cacl2·2h2o96mg/l、mgso4·7h2o370mg/l、kh2po4170mg/l、k2so4990mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·h2o22.4mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、namoo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.25mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l、na2-edta37.3mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、烟酸0.5mg/l、维生素b11.0mg/l、维生素b60.5mg/l。进一步的技术方案，所述的步骤5）中的ms基本培养基包含6.5g/l琼脂和30g/l蔗糖，以及以下成分：nh4no31650mg/l、kno31900mg/l、mgso4·7h2o370mg/l、kh2po4170mg/l、cacl2·2h2o440mg/l、ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、namoo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l、na2-edta37.25mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、烟酸0.5mg/l、维生素b60.5mg/l、维生素b10.1mg/l。进一步的技术方案，所述的步骤2）、3）、4）、5）中培养基的ph值均调为5.8。有益效果：1、本发明采用酒精+升汞的消毒方式，可以有效的清除外植体中残留的病菌，平均污染率仅为37.78%，褐化率为22.22%。2、诱导不定芽和愈伤组织阶段，筛选出mpw培养基，诱导效果最好，达93.33%，褐化率仅为6.67%；而ms和b5培养基诱导过程中褐化现象严重，诱导率分别为11.11%和8.89%，褐化率分别为88.89%和91.11%。2、本发明筛选出6.5g/l琼脂和ph5.8为最优的培养基琼脂浓度和ph值，其平均褐化率为28.89%，平均诱导率为66.67%。2、本发明在不定芽诱导阶段和生根培养阶段加入pvp，有效防褐化。在不定芽诱导过程中平均褐化率由91.11%降为34.44%，且诱导出的不定芽生长良好，叶片舒展，深绿色。在生根过程中，有效抑制根的褐化，根粗且长，生长力旺盛。4、不定芽诱导阶段，添加1.0mg/l的6-ba和0.5mg/l的naa时茎段诱导出的不定芽数量最高，平均诱导率达到91.11%。5、叶片愈伤诱导及分化阶段，0.5mg/l的naa和1.0mg/l的6-ba时，诱导出愈伤的叶片数量最多，诱导率和不定芽分化率分别为92.22%和87.78%，且该培养基上愈伤组织分化出的不定芽长势良好、叶片舒展。6、增殖培养阶段，添加1.0mg/l的6-ba和0.1mg/l的naa时不定芽生长良好，茎干基部存在愈伤，增殖系数最高可达3.65。7、生根培养阶段，添加iba浓度为0.7mg/l时，生根效果最好，最高可达61.11%，根粗且长，生长力旺盛。附图说明图1天使红软籽石榴防污染研究的生长情况图2不同ph值和琼脂浓度处理组合的培养基上不定芽生长情况图3叶片愈伤诱导及分化培养基上不定芽生长情况图4不定芽增殖培养生长情况图5生根培养及移栽炼苗。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例一种天使红软籽石榴组织培养快繁方法，包括以下步骤：1）采集幼嫩的茎段为外植体，用75%的酒精消毒30s后用0.1%的升汞消毒10min，无菌水充分清洗；2）将消毒后的茎段接种在配方为wpm+2g/lpvp+0.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba的不定芽诱导培养基上。3）待不定芽长出后，选用诱导过程中产生的叶片，切去叶片两端并切断叶脉接种到配方为wpm+0.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba的叶片愈伤组织诱导及分化诱导培养基。4）将由茎段诱导产生的不定芽和由叶片愈伤分化产生的不定芽接种到配方为wpm+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba的增殖培养基上。5）剪取生长健壮、长5-6cm的单苗进行生根培养，生根培养基为1/2ms+0.7mg/liba+0.2g/lpvp。6）当单苗根长达到3-4cm的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶炼苗5-20d左右，遮阴度宜为50%-70%，然后打开瓶口，再放置3-7d；当组培苗根长达到5-6cm且植株长势良好时进行移栽。移栽基质选择草炭和蛭石以2:1的比例混合，充分混合后用高温灭菌。移栽环境的温度在25-28℃，湿度在80％-85％，光照时间每天12-14h。所述的步骤2）、3）、4）中的wpm基本培养基包含6.5g/l琼脂和30g/l蔗糖，以及包括以下成分：nh4no3400mg/l、ca(no3)2·4h2o556mg/l、cacl2·2h2o96mg/l、mgso4·7h2o370mg/l、kh2po4170mg/l、k2so4990mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·h2o22.4mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、namoo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.25mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l、na2-edta37.3mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、烟酸0.5mg/l、维生素b11.0mg/l、维生素b60.5mg/l。所述的步骤5）中的ms基本培养基包含6.5g/l琼脂和30g/l蔗糖，以及以下成分：nh4no31650mg/l、kno31900mg/l、mgso4·7h2o370mg/l、kh2po4170mg/l、cacl2·2h2o440mg/l、ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、namoo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l、na2-edta37.25mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、烟酸0.5mg/l、维生素b60.5mg/l、维生素b10.1mg/l。所述的步骤2）、3）、4）、5）中培养基的ph值均调为5.8。试验对比及分析实验材料：选用由美国引进的“angelred”软籽石榴的幼嫩茎段为试材，该试材采自南京林业大学白马基地石榴资源圃，把采集的幼嫩茎段做好标记放在冰盒中带回实验室，置于4℃冰箱中备用，采集的幼嫩茎段保存时间不超过一周。主要试剂：6-ba（6-benzylaminopurine，6-苄基氨基嘌呤）、naa（naphthalene-aceticacid，萘乙酸）、iba（3-indolebutyticacid，吲哚丁酸）、pvp（polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮）、蔗糖、琼脂、wpm培养基（woodyplantmedium）、ms（murashigeandskoogmedium）、b5（b5medium），以上试剂由上海生工生物工程有限公司生产，其中pvp直接加入培养基中高温灭菌。主要使用的仪器：sw-cj-1f型超净工作台、mls·3020型高压灭菌锅、烘箱、电子天平、ph计、jz-ii接种器械灭菌器、冰箱、酒精灯、waters纯水系统、德国eppendorf公司移液器等。数据统计公式：污染率=污染的外植体数/接种的总外植体数×100%；死亡率=死亡的外植体数/接种的总外植体数×100%；褐化率=褐化的外植体数/接种的总外植体数×100%；不定芽诱导率=萌发的不定芽数/接种后未污染的不定芽数×100%；愈伤诱导率=形成愈伤组织的外植体数/接种的总外植体数×100%；不定芽分化率=形成不定芽的愈伤组织数/总的愈伤组织数×100%；增殖系数=转出的不定芽数/转入的不定芽数×100%；生根率=生根株数/接入的总株数×100%。1、外植体消毒时间筛选为了筛选出最佳的石榴幼嫩茎段消毒时间处理组合，选择了酒精和升汞两种消毒剂对软籽石榴的消毒处理进行研究，其中75%酒精消毒时间选用3个水平：10s、20s、30s。0.1%升汞处理时间选用3个水平：6min、8min、10min。实验设计详见表1。茎段经过冲洗后置于超净工作台上，用乙醇和升汞进行进一步的消毒，消毒完成后用无菌水冲洗。在滤纸上将消毒好的带芽茎段切去与消毒液接触的的部分并插于培养基中，2w后观察外植体接种后的污染情况，并观察外植体污染特征，进一步判定造成污染的原因，并统计污染率。表1消毒实验方案处理组合酒精消毒时间（s）升汞消毒时间（min）110821010310124208520106201273088301093012茎段培养10d后，对带芽茎段的污染数、褐化数和诱导情况进行调查，不同处理组合的污染率、褐化率和外植体诱导情况差异较明显，结果如表2所示：表2不同消毒处理的效果比较注：a.数值表示重复次数。从表2可以看出，对于不同处理条件下外植体的污染情况，不同处理组合差异显著：处理1为最高组，即aa组；处理4高于其他组，独立为次高组而独立为bb组；处理9平均污染率为27.78%低于处理8，但由于处理8的平均褐化率极显著的低于处理9且处理8的平均诱导率极显著的高于处理9。因此，综合考虑外植体的污染率、褐化率及诱导情况，认为处理8为软籽石榴带芽茎段的最佳消毒操作。因此，本部分选择先用75%的酒精消毒30s后用0.1%的升汞消毒10min作为软籽石榴带芽茎段的最佳消毒操作，此时外植体污染率为37.78%，褐化率为22.22%，外植体诱导率为60%。图1为天使红软籽石榴防污染研究的生长情况，其中，图1-1为不定芽诱导出现污染的现象；图1-2为茎段经过消毒后诱导出的不定芽；图1-3为茎段接种2w后产生不定芽；图1-4为茎段接种3w后产生不定芽；图1-5为茎段接种4w后产生不定芽；图1-6为茎段接种5w后产生不定芽。2、基本培养基筛选不同培养基中外植体褐化程度和生长情况差异很大，为了筛选出较适合的软籽石榴组织培养的培养基，本选择了ms、b5、wpm共3种常用培养基研究不同培养基对软籽石榴接种过程中不定芽诱导的影响，将消毒后的茎段分别接种于3种不同的培养基上，2w后统计不同培养基上不定芽的褐化率、诱导率。表3不同培养基对外植体褐化率和诱导率的影响培养基平均褐化率（%）平均诱导率（%）ms88.89aa11.11bbb591.11aa8.89bbwpm6.67bb93.33aa2w后统计不同培养基ms、b5、wpm对外植体褐化率、诱导情况的影响。从上表可以看出不同培养基对软籽石榴外植体诱导影响差异极显著。其中wpm培养基对软籽石榴茎段诱导效果最好，达93.33%，差异极显著的高于其他组。而ms和b5培养基诱导过程中褐化现象严重，诱导率分别为11.11%和8.89%。对于软籽石榴不同培养基上外植体的褐化率，3个处理组合差异极显著地分为2组，其中接种于wpm培养基中的外植体褐化率显著低于其他组，为最优组。综上所述：软籽石榴最适合的诱导培养基为wpm培养基。3、培养基ph值和琼脂浓度筛选主要研究ph值和琼脂浓度的不同处理组合对外植体污染和褐化的影响，培养基均选用wpm培养基，每个处理设30个外植体，实验均重复3次，实验中琼脂浓度选用3个水平：6.0g/l、6.5g/l、7.0g/l。ph值选用3个水平：5.4、5.8、6.2。实验设计详见表3。表4培养基ph值和琼脂浓度设计处理琼脂浓度（g/l）ph值165.4265.8366.246.55.456.55.866.56.277.05.487.05.897.06.2表5不同ph值和琼脂浓度组合对外植体褐化率和诱导率的影响从上表和图2（图2中，2-1当琼脂浓度为7.0g/l，ph值为5.8时不定芽生长情况；2-2当琼脂浓度为6.5g/l，ph值为5.8时不定芽生长情况）可以看出，ph值不变时，随着琼脂浓度的增加，外植体褐化率呈现先降低后增加的规律；当琼脂浓度为6g/l时，随着ph值的增加，外植体褐化程度明显降低，诱导率逐渐增加；当琼脂浓度为6.5g/l时，随着ph值的增加，外植体褐化程度却呈现出先降低后增加的趋势，诱导率先增加后降低；当琼脂浓度为7.0g/l时，随着ph值的增加，外植体褐化程度显著增加，诱导率逐渐降低。综上所述，综合考虑培养基ph值和琼脂浓度对外植体褐化和诱导情况的影响，认为培养基中添加的琼脂浓度为6.5g/l且ph值为5.8时，ph值和琼脂浓度组合对外植体的褐化情况影响最小，且本研究不同阶段培养基中均将琼脂浓度设为6.5g/l且ph值设为5.8。4、防褐化剂浓度筛选实验中发现接种后3-4d内茎段褐化现象严重，为了研究防褐化剂pvp（聚乙烯吡咯烷酮）对不定芽诱导褐化程度的影响，本实验中pvp添加浓度设置4个水平：0、2g/l、4g/l、6g/l，实验采用单因素随机区组实验进行，培养20d后统计褐化率。表6不同浓度pvp对不定芽褐化率的影响pvp浓度（g/l）平均褐化率（%）平均诱导率（%）091.11aa5.56cd234.44bb56.67aa422.22cc25.56bb618.89cc22.22bc从上表可以看出，不定芽在添加抗褐化剂pvp的培养基上培养20d后发现，没有添加pvp的培养基和添加2g/lpvp的培养基上褐化现象差异显著。没有添加抗褐化剂的培养基上褐化情况非常严重，其褐化率高达91.11%。当添加抗褐化剂pvp时，褐化程度明显降低，同时诱导率出现先增加后降低的趋势。研究发现抗褐化剂使用浓度过高或使用时间过长，会造成芽苗后期长势不佳。经比较，对于不同浓度pvp对不定芽褐化率的影响，4个处理组合差异极显著地分为3组：添加0g/lpvp培养基中褐化率极显著的高于其他组而独立为aa组；添加2g/lpvp培养基中褐化率为次高组，独立为bb组；添加4g/lpvp培养基和添加6g/lpvp培养基中外植体的褐化率显著低于其他组为最低组，并列为cc组。而不同浓度pvp对不定芽诱导率的影响，4个处理组合差异极显著地分为4组。其中添加2g/lpvp培养基中诱导率最高为独立的aa组，添加0g/lpvp培养基中诱导率最低为独立的cd组。综上所述，综合考虑不同浓度pvp对褐化情况和不定芽诱导情况的影响，认为pvp浓度为2g/l时效果最佳。5、不定芽诱导为了诱导茎段产生不定芽，本实验在wpm培养基中添加naa和6-ba两种激素研究生长调节剂浓度对不定芽诱导的影响，其中两种激素的浓度处理组合见表7。外植体选用上一阶段构建的无菌培养系的茎段，培养基中加入2.0g/lpvp，培养21d后，统计不定芽诱导情况。计算不定芽诱导率。表7不定芽诱导实验方案处理组合naa浓度（mg/l）6-ba浓度（mg/l）ck0010.50.520.51.030.51.541.00.551.01.061.01.571.50.581.51.091.51.5将含芽茎段接种在不定芽诱导培养基wpm+6-ba+naa上发现所有处理的培养基上都诱导出了不定芽，但不同处理之间诱导出不定芽的数量和不定芽的生长情况差异显著，结果见表8：表8naa和6-ba对不定芽诱导的影响处理组合naa浓度（mg/l）6-ba浓度（mg/l）平均诱导率（%）ck0022.22±1.73fh10.50.587.78±1.75aab20.51.091.11±2.15aa30.51.551.11±3.40df41.00.583.33±5.37abbc51.01.088.89±1.55aab61.01.559.78±1.39ce71.50.577.78±1.48bcd81.51.075.56±2.19bd91.51.538.89±1.00eg培养3w后，统计不定芽诱导情况发现随着naa和6-ba浓度的升高，不定芽诱导率总体呈现先升高后降低的趋势，添加生长调节剂的处理诱导率均比没有添加任何激素的对照组要高。其中，处理2即wpm培养基中添加1.0mg/l的6-ba和0.5mg/l的naa时茎段诱导出的不定芽数量最高，平均诱导率达到91.11%；而当培养基中添加1.5mg/l的6-ba和1.5mg/l的naa时，诱导率最低，仅为38.89%。研究发现当培养基中添加的6-ba在1.0mg/l时促进作用最好，当浓度超过1.5mg/l时反而会抑制不定芽的产生。综上所述，软籽石榴最佳不定芽诱导培养基为wpm+0.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba。6、叶片愈伤组织诱导及分化实验中发现从大田采集叶片进行愈伤诱导时，外植体污染现象和褐化现象都非常严重。为了更好的进行叶片的愈伤诱导，本研究选择利用不定芽诱导过程中长出的无菌苗的叶片，由于该叶片是由经过消毒的茎段新萌发出来的，叶片中的病菌会大大减少，比从大田中采集的叶片更易控制污染，可提高叶片诱导出愈伤的效率。挑选长至叶片长度2cm左右且颜色嫩绿，无明显黄化现象的叶片进行愈伤诱导，叶片大小对试验结果无明显影响。本部分中naa选用3个水平（mg/l）：0.05、0.1、0.15。6-ba选用3个水平（mg/l）：1、1.5、2。实验设计详见表5。外植体选用上一阶段构建的无菌培养系的茎段上产生的嫩绿叶片。培养20d后，统计愈伤诱导情况，继续培养20d统计不定芽分化情况，计算愈伤诱导率和不定芽分化率。表9愈伤组织诱导及分化实验方案处理组合naa浓度（mg/l）6-ba浓度（mg/l）10.05120.051.530.05240.1150.11.560.1270.15180.151.590.152选用上一阶段构建的无菌培养系的茎段上产生的叶片，在超净工作台切去叶片两端并接种至添加不同生长调节物质处理组合的培养基中（如图3-1），培养1w左右会出现疏松的愈伤组织，三周左右愈伤组织进一步生长（如图3-2、图3-3），培养4w后部分愈伤便会分化成不定芽(图3-5)，图3中，图3-1为接种于wpm培养基上的叶片；图3-2、图3-3为培养三周后形成的愈伤组织；图3-4为对照组形成的愈伤组织；图3-5为培养四周后分化出的不定芽：图3-6为在naa浓度为1.5mg/l，6-ba浓度为1.5mg/l的培养基上培养二个月后不定芽的生长情况。不同浓度naa和6-ba处理组合对叶片愈伤组织诱导及分化的影响效果明显，结果如表10：表10naa和6-ba对叶片愈伤组织诱导率及不定芽分化率的影响处理组合naa浓度（mg/l）6-ba浓度（mg/l）愈伤诱导率（%）不定芽分化率（%）ck0028.89±0.90gg38.89±1.60ded10.50.575.56±1.25bb61.11±3.14bb20.51.092.22±1.47aa87.78±1.12aa30.51.561.11±1.17cc51.11±3.79cc41.00.559.78±2.51cc55.56±0.57bcbc51.01.088.89±1.68aa83.33±3.40aa61.01.551.11±2.89dd42.22±0.90dd71.50.535.56±1.06ff33.33±2.78ee81.51.042.22±3.43ee38.89±0.90ded91.51.538.89±1.55efef22.22±1.98ff对照组发现叶片愈伤组织诱导完成后（如图3-4）不定芽分化非常缓慢，60d左右部分愈伤才能分化出不定芽，添加不同浓度的生长调节物质的培养基中愈伤诱导情况差异明显。当wpm培养基中添加1.5mg/l的naa和0.5mg/l的6-ba时诱导出愈伤的叶片数量最少，仅有35.56%。当培养基中添加0.5mg/l的naa和1.0mg/l的6-ba时，诱导出愈伤的叶片数量最多，诱导率和不定芽分化率分别为92.22%和87.78%，且该培养基上愈伤组织分化出的不定芽长势良好、叶片舒展。因此本试验认为最佳的叶片愈伤组织诱导及分化诱导培养基为wpm+0.5mg/lnaa+1.0mg/l6-ba。7、增殖培养研究6-ba，naa对外植体苗扩繁的影响。将生长旺盛的外植体苗继代培养，待幼苗长到5-6cm时进行增殖培养试验。把嫩茎剪成1个嫩芽的茎段，接种到不同的增殖培养基中，每次6瓶，每瓶5个茎段。培养30d后观察不同培养基对外植体苗的增殖影响。统计不定芽高度、数量并计算增殖系数（增殖系数=转出的不定芽数/转入的不定芽数×100%）。表11增殖培养方案处理组合6-ba浓度（mg/l）naa浓度（mg/l）10.50.120.50.330.50.5410.1510.3610.5720.1820.3920.5选择叶片愈伤诱导和茎段直接诱导产生的不定芽中生长良好的部分进行增殖培养，定期调查不定芽增殖情况，约四周后发现不定芽增殖情况良好，记录并统计芽苗的生长情况和增殖系数，结果如表12和图4；图4中，图4-1为刚接种的不定芽；图4-2为处理2两周后的增殖培养情况；图4-3、4-4为处理3两周后的增殖培养情况；图4-5为处理4三周后的增殖生长情况；图4-6为处理4四周后的增殖生长情况。表12生长调节物质对不定芽增殖系数的影响处理组合增殖系数生长情况12.07±0.15ccd茎干短且粗22.69±0.08abcbcd茎干短且粗33.28±0.30abab茎干细长，叶伸展，深绿色43.65±0.36aa茎干细长，叶宽大，深绿色53.38±0.33abab茎干细长，叶伸展，深绿色62.80±0.10abcbc茎干短且粗72.70±0.10abcbcd叶片卷曲82.56±0.23bccde叶片卷曲，淡绿色92.03±0.15ce叶片暗黄结果表明生长调节物质naa和6-ba对不定芽增殖培养有促进作用，但当6-ba浓度超过2.0mg/l时芽苗生长容易出现叶片发黄、卷曲的情况。当培养基中添加1.0mg/l的6-ba和0.1mg/l的naa时不定芽生长良好，茎干基部存在愈伤，增殖系数最高可达3.65，较其它处理促进效果明显。其次为处理5，其增殖系数为3.38。处理9增殖系数最低仅为2.03，该处理茎干短且粗、叶片卷曲明显，叶片有黄化的迹象。试验结果表明软籽石榴的最佳增殖培养基为wpm+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba。8、生根培养预实验中发现软籽石榴生根培养基中不添加抗褐化剂pvp时，生根后继续培养一周左右根部褐化严重。为了得到粗且长的根，本部分研究了iba和pvp对软籽石榴生根的影响。iba选用3个浓度（mg/l）梯度：0.5、0.7、0.9。pvp选用3个浓度水平（g/l）：0、0.2、0.4（见表13）。生根培养基选择1/2ms培养基，定期观察生根情况。约4w后统计芽苗的生根情况并计算生根率。表13生根培养方案处理组合iba浓度（mg/l）pvp浓度（g/l）10.5020.50.230.50.440.7050.70.260.70.470.9080.90.290.90.4光照培养30d后，可以观察到有部分苗已生出1cm左右的细根，继续培养15d左右，大部分根长已长至2cm，结果如表14。表14不同处理组合的生根率处理组合iba浓度（mg/l）pvp浓度（g/l）生根率（%）生根情况10.5050.00±1.26cde根褐化严重20.50.230.43±1.09abcbcd根细且短30.50.431.33±3.09abab根细且短40.7044.44±3.76aa根褐化严重50.70.261.11±2.02abab根粗且长60.70.455.56±2.51abcbc根粗且长70.9056.67±2.51abcbc根褐化严重80.90.232.22±2.78bccde根细且短90.90.418.89±1.51ce少量愈伤，根细且短由表14发现，添加抗褐化剂pvp的培养基可有效抑制根的褐化。其中，iba浓度为0.7mg/l时，生根效果最好，最高可达61.11%，根粗且长，生长力旺盛。因此，本试验结果认为最佳生根培养基为1/2ms+0.7mg/liba+0.2g/lpvp。9、炼苗与移栽本阶段以提高移栽成活率为实验目的。将根长达到3-4cm的组培苗从培养室取出，将培养瓶移到温室中进行强光闭瓶炼苗5-20d左右，遮阴度宜为50%-70%，然后打开瓶口，再放置3-7d。炼苗后选择根长达到5-6cm且长势良好的组培苗进行移栽，移栽基质选择草炭和蛭石以2:1的比例混合，混合后应对基质进行高温灭菌，以杀死基质中含有的各类病菌。移栽后应严格管理培养环境的温度、湿度和光照，其中温度应控制在25-28℃，湿度在80％-85％，光照时间控制在每天12-14h，移栽过程中每隔2w用营养液补充基质中的养分，组培苗移栽成活率高，如图5所示，图中，图5-1为处理4根褐化情况；图5-2和5-3为处理5初期根生长情况；图5-4为处理5生根培养45天根生长情况；图5-5闭瓶炼苗15d后进行移栽；图5-6为移栽苗根生长情况。当前第1页12