一种人工生物组织的保存方法与流程

本申请涉及生物医疗技术领域，特别是涉及一种人工生物组织的保存方法。

背景技术：

目前生物心脏瓣膜的保存都采用戊二醛、甲醛等醛类溶剂进行保存。生物心脏瓣膜保存在一定浓度醛类保存液中一般都有一到五年的有效期。能有效保持无菌环境，抑制微生物的生长。

目前国内外人工生物瓣膜均保存在一定浓度戊二醛或者甲醛保存液中，在经导管心脏瓣膜置换术(tavi)前，先对人工生物瓣膜进行清洗，然后由经严格培训的工程师将瓣膜压握装载入输送器装置后，交付医生将其送至患者心脏中。

本申请的发明人在长期的研发过程中，发现天然瓣膜中活体胶原纤维中黏多糖糖蛋白类物质掩盖和阻止胶原与钙、磷结合而形成晶体核心，故很少钙化。但含醛类的瓣膜中，醛类保存液处理生物瓣后，使胶原纤维内分子间交联，增加了组织稳定性，胶原分子间交联不充分及交联后游离羧基促使钙化发生。

技术实现要素：

本申请主要解决的技术问题是提供一种人工生物组织的保存方法，能够提高所保存人工生物组织的抗钙化能力。

为解决上述技术问题，本申请采用的一个技术方案是：提供一种人工生物组织的保存方法，所述方法包括：提供人工生物组织和保存液，保存液包括保护剂，保护剂为c1-c3的多元醇和/或c1-c3的亚砜；将人工生物组织浸入到保存液中进行保存。

其中，保护剂为甘油、丙二醇、二甲基亚枫、乙二醇溶液中的一种或多种混合。

其中，保存液还包括溶剂，溶剂为0.9％生理盐水、乙醇、氯仿、异丙醇中的一种或多种混合。

其中，保护液中保护剂所占体积分数为30％～100％。

其中，保护液中溶剂所占体积分数为0％～70％。

其中，将人工生物组织浸入到保存液中，在温度为2～8℃的条件进行保存。

其中，将人工生物组织浸入到保存液中保存0.5～60天。

其中，人工生物组织为哺乳动物组织。

其中，哺乳动物组织为动物心包、主动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣、肺动脉瓣、韧带、皮肤、腹膜、胸膜、跟腱或静脉带瓣管道中的任意一种或至少两种的混合物。

本申请的有益效果是：区别于现有技术的情况，本申请提供一种人工生物组织的保存方法，利用c1-c3的多元醇和/或c1-c3的亚砜等非醛类溶液作为保护剂，能够防止出现因醛类引起的钙化位点，提供抗钙化能力。

附图说明

图1是本申请人工生物组织的保存方法第一实施方式的流程示意图；

图2是本申请生物组织保存实验中生物负载检测实验过程的操作示意图；

图3是本申请生物组织保存实验中茚三酮反应的测试结果示意图；

图4是本申请生物组织保存实验中吸光度的测试结果示意图。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本申请进一步详细说明。

本申请提供一种人工生物组织的保存方法，该方法使用非醛类溶液来保存人工生物组织，克服了现有醛类保护液中人工生物组织容易发生钙化的问题。

其中，按照文献报道和一些行业惯例，屠宰场采集的生物组织必须在48小时内进行交联固定。由于屠宰场集中屠宰，单次屠宰量很大，同时屠宰场不具备生物组织就地交联固定的条件，且屠宰场地处偏僻、交通不便，以上原因导致新鲜生物组织不能在48小时内得到交联固定。因此需要开发一种能够在交联固定前长期保存生物组织的方法，防止生物组织膜腐败变质。

请参阅图1，图1是本申请人工生物组织的保存方法第一实施方式的流程示意图。在该实施方式中，交联方法包括如下步骤：

s101：提供人工生物组织和保存液。

其中，人工生物组织为哺乳动物组织，哺乳动物组织为动物心包、主动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣、肺动脉瓣、韧带、皮肤、腹膜、胸膜、跟腱或静脉带瓣管道中的任意一种或至少两种的混合物。该方法可应用于主动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣和肺动脉瓣等人工生物瓣膜领域。

s102将人工生物组织浸入到保存液中进行保存。

其中，保存液包括保护剂，保护剂为c1-c3的多元醇和/或c1-c3的亚砜。“多元醇”是包含多个碳原子和两个或更多个羟基的有机分子，且羟基连接碳原子。例如多元醇可以是甘油、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油衍生物等。“亚砜”为含有亚硫酰基(>s＝o)官能团的一类化合物。例如常见的亚砜有氯化亚砜、二甲基亚砜、二苯基亚砜等。

在该实施方式中，通过利用非醛类溶液进行保存人工生物组织，能够降低生物组织钙化的风险；同时生物组织膜在一定期限内不发生腐败变质，起到长期保存生物组织膜的效果；且采用该保存方法的生物组织膜，具有良好的理化性能和生物相容性。

其中，在一实施方式中，保护剂为甘油、丙二醇、二甲基亚枫、乙二醇溶液中的一种或多种混合。

其中，在一实施方式中，保存液还包括溶剂，所述溶剂为0.9％生理盐水、乙醇、氯仿、异丙醇中的一种或多种混合。

具体地，按照预定比例将保护剂溶解在极性相近的溶剂中得到保存液。

其中，冷冻保护液中保护剂所占体积分数为30％～100％，例如30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本申请不再穷举所述范围包括的具体点值。

其中，冷冻保护液中溶剂所占体积分数为0％～70％，例如0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本申请不再穷举所述范围包括的具体点值。

准备好保存液后，将预处理的生物组织浸入保存液进行保存。其中，为了保证生物组织不腐败且尽量延长保存时间，可以在温度为2～8℃的条件下进行保存，例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本申请不再穷举所述范围包括的具体点值。

其中，在该条件下，生物组织能够被保存0.5～60天，例如0.5天、1天、2天、4天、8天、12天、16天、20天、24天、32天、40天、48天或60天，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本申请不再穷举所述范围包括的具体点值。

保存期间，可以根据需要进行性能测试、评估，取出使用等。

下面，将通过几组具体实验例对本申请的方案进行说明、解释，但这些实验例仅是一些示例性方案，不应用来限制本申请的范围。其中，实验例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照标准要求所规定的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟知的意义相同。

其中，以牛心包膜为例进行试验，申请人设计将心包放到85％甘油中冷藏(2-8℃)保存，运输到工厂后用0.9％生理盐水将甘油洗掉再进行后续工艺处理。但是，在长时间和长距离运输工程中，无法保证心包一直处于2-8℃环境中，常温下(20-25℃)甘油是否可以有效保存心包，有效保存可以维持多久，都需要试验验证。因此本试验以4℃为试验例，以25℃为对比例，来验证甘油有效保存新鲜牛心包的最长时间或可行性。

首先，从组织机理角度验证甘油保存的可行性。具体地，牛心包中自由水参与微生物生长，水解反应，氧化反应和酶解消化等生物化学反应，因此去除或固化自由水是长期保存心包的关键。目前常用低温(cryopreserved)、冷冻(freezing)和冻干(freeze-dry)来保存牛心包，三者的保存机理是固化或去除自由水。其中冻干不仅可以去除自由水，也可以有效去掉分子间的结合水，达到长期保存心包的目的。而甘油可以通过脱水达到去除自由水的目的；有文献报道85％的甘油可以有效的降低自由水的活性(wateractivity,aw)至0.3。一般认aw≤0.3时，组织和生物体内的生物化学反应就会停止。因此，从组织机理上证明甘油可以用来保存生物组织。

其次，从各性能参数来验证甘油保存的可行性。

准备牛心包，具体地，将采集的牛心包膜剥去大块脂肪、肌肉和结缔组织，清洗掉血渍后，再用生理盐水洗净。然后抽取20头心包，随机分成4组(如表1)，0.9％生理盐水保存组作为空白对照，甘油组为85％的甘油溶液。分别在24h、1周、2周、3周、4周、6周和8周做各项检测。

表1：本申请生物组织保存实验分组

第一、生物负载检测

取各组保存的心包，用0.1％蛋白胨培养基300ml，37℃，60转/分钟震荡浸提30分钟。将浸提液平均分成三份，抽滤到三张无菌滤膜上，将滤膜平铺到tsa培养基(胰酪大豆胨琼脂培养基)、rca培养基(加强梭状芽孢杆菌琼脂培养基)、sda培养基(沙氏琼脂培养基)平板表面接触培养7天，观察并记录菌落个数，检测记录详见表2，实验过程操作如图2，图2是本申请生物组织保存实验中生物负载检测实验过程示意图。

表2本申请生物组织保存实验生物负载检测记录表

实验结果表明：(1)甘油4℃保存牛心包微生物生长情况：24h、48h、1w均未检测出微生物生长。2w、3w、4w微生物繁殖呈上升趋势，尤其是4w时微生物多的不可计数。分析原因可能与试验用水和实验室环境不受控有关。第2次重复试验将试验用水由车间纯化水换成了灭菌注射用水洗涤，从4周开始检测。几乎没有检测到微生物生长。

(2)甘油25℃保存牛心包微生物生长情况：除第2w微生物生长多不可数之外，其余各时间点微生物总数均很低，多数时间点微生物总数为零。因此，该方法能够在无菌条件下长期保存生物组织。

第二、生物化学检测

其中，生物组织胶原纤维在降解过程中逐渐疏松肿胀，粗细不均，不规则断裂，间隙逐渐增宽，出现大小不一气泡等现象，通过he和masson染色，可以观察到胶原纤维的降解情况，以此评价干预保存心包的可行性。

取各组保存液，先观察拍照记录各时间点保存液大体颜色变化；再采用茚三酮染色，使紫外-可见分光度计和酶标仪测定530nm处的吸光度，分析固定液中蛋白质类似物及其降解产物浓度变化。

实验结果如下：4℃下，甘油和盐水保存牛心包

(1)茚三酮反应颜色：从酶标板的颜色来看，甘油保存组从1周到4周的颜色和空白组(只有甘油保存液无牛心包)的颜色几乎相同。盐水保存组从1周到4周的颜色逐渐加深，由无色到淡黄色，其中1周的颜色和空白组(只有盐水无牛心包)的颜色几乎相同。

(2)吸光度：减去甘油空白组的吸光度，甘油保存从1周到4周的吸光度几乎均为零，表明没有检测到氨基酸，进一步表明没有蛋白质的降解。盐水保存组的吸光度随时间逐渐增加，表明氨基酸含量逐渐增加，蛋白质降解在加剧。其中1周时盐水组的吸光度和空白组(只有盐水，无牛心包)一样均为零，即4℃下，新鲜牛心包可以在0.9％生理盐水中保存一周。

实验结果如下：4℃和25℃下，甘油和盐水保存牛心包

(1)茚三酮反应颜色：从茚三酮反应的颜色来看，4℃和25℃下甘油保存组1周和8周的颜色和空白组(只有甘油保存液无牛心包)的颜色几乎相同。25℃下盐水保存组从1周到8周的颜色逐渐加深，5周到8周颜色变化不明显，可能已经超过了茚三酮的检测限度。具体请参阅图3，图3是本申请生物组织保存实验中茚三酮反应的测试结果示意图。

(2)吸光度：减去甘油空白组的吸光度，甘油保存从1周到4周的吸光度几乎均为零，表明没有检测到氨基酸，进一步表明没有蛋白质的降解。盐水保存组的吸光度随时间逐渐增加，表明氨基酸含量逐渐增加，蛋白质降解在加剧。其中1周时盐水组的吸光度和空白组(只有盐水，无牛心包)一样均为零，即4℃下，新鲜牛心包可以在0.9％生理盐水中可以保存1周。具体请参阅图4，图4是本申请生物组织保存实验中吸光度的测试结果示意图。

第三、生物力学实验

其中，组织自溶腐败后生物化学物质的降解必然引起其相应生物力学的变化。将甘油保存的新鲜心包组织交联固定后，测定生物力学性能；制备成瓣膜做长期疲劳测试，也可以评价甘油保存心包的可行性。同时验证交联固定后的心包放入甘油中长期保存的。

取各组保存的心包，按照gb/t528-2009硫化橡胶或热塑性橡胶测试方法，用激光切割机将试样裁剪成哑铃状。应用电子万能材料试验机，室温下，设定试验长度10mm，以200mm/min匀速纵向单轴拉伸测试，测试前进行10次预调试，每次预调间隔30s。正式检测时试样数量不少于3个，系统软件自动同步采集和记录：最大应力，拉伸强度，弹性模量、应变和力-变形曲线等指标。

各个试样拉伸强度测试采用spss16.0统计软件所得数据进行分析，各组数值以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析(one-wayanona)组间无统计学差异。具体测试结果请参阅表3.

表3：本申请生物组织保存实验力学性能测试结果

综上，本申请提供的方法能够长期保存生物组织，且生物组织膜在一定期限内不发生腐败变质，采用该保存方法的生物组织膜，具有良好的理化性能和生物相容性，还能够降低生物组织钙化的风险。

以上所述仅为本申请的实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。