快速同步选育双低甘蓝型油菜细胞质不育系、保持系的方法与流程

本发明涉及一种快速同步选育双低甘蓝型油菜细胞质不育系、保持系的方法，属于现代农业品种、育种亲本选育技术领域。

背景技术：

甘蓝型油菜是目前全世界种植面积最大的油菜类型，目前推广的甘蓝型油菜主要是双低油菜，低芥酸（小于1%）、低硫苷（小于40μmol/克.饼）。甘蓝型细胞质不育系统是油菜杂种优势利用的主要途径之一。目前常用的甘蓝型油菜不育胞质类型包括：玻里马（polcms）细胞质不育、萝卜（oguracms）胞质不育、芥菜胞质不育(haucms)、ja不育胞质类型。选育稳定的甘蓝型油菜细胞质不育系需要较长的周期，人力物力投入较大。常规的选育途径是：将遗传基本稳定的（f6-f8代）或已遗传稳定（高代自交系或dh系）的材料a与稳定的细胞质不育系b测交，测交后代为全部不育c，证明该测交父本a为保持系（简言之：能保持测交母本的不育状态），对测交后代c进行多代（8-10代）的回交或成对回交，选育出成对的保持系a和新不育系a，这时保持系a和不育系a核基因一致，只存在不育和可育的胞质基因差异。这样选育的过程时间很长，从选育保持系到形成稳定的成对不育系需要15代以上的时间，以1代1年计算需要15年以上的时间，浪费大量的时间和人力物力。常规的方法是利用保持系与不育系多代回交的方法替换原有质不育系的核基因，让不育系和保持系达到核基因一致的目的，因为核基因的替换不能自然发生必须通过回交转育的方式进行，因此周期长，缺点显而易见。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速同步选育双低甘蓝型油菜细胞质不育系、保持系的方法，能克服现有技术的不足，解决双低甘蓝型油菜细胞质不育系和保持系快速且同步选育的问题，不需要让保持系基本稳定或稳定后再多代回交，选育对应的不育系和保持系。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：快速同步选育双低油菜细胞质不育系、保持系的方法，它包含以下步骤：

s1.杂交或测交f1代：用已知的需要改良的双低甘蓝型油菜细胞质保持系或不育系作母本与其他遗传稳定优良性状双低甘蓝型油菜材料作为父本杂交或测交；

s2.杂交或测交f1诱导：杂交f1代可育株去雄，用油菜双单倍体诱导系花粉授粉，诱导杂交f1产生核基因纯合的f2代单株；

s3.f2代单株选育：通过田间性状调查，选完全可育、正常四倍体，且具有s1步骤中父本优良性状单株套袋自交，并通过品质测试淘汰高硫苷、高芥酸品质自交单株；

s4.调查f3代株系调查及检测：f3代形成株系，对f3代苗期、苔期鉴定株系内整齐度、一致性，选择形态、株型整齐一致的株系，花期调查株系内的雄蕊不育、可育分离情况，并取不育和可育单株提dna进行snp基因芯片检测，分析不育单株和可育单株的遗传相似系数及遗传关系；

s5.f3代株系选育：f3代形态、株型整齐株系内，出现质不育和可育植株，选择s4中不育单株和可育单株遗传相似系数大于95%的株系，用株系内的完全可育单株与不育彻底的不育单株姊妹交，并将f3代株系内进行了姊妹交的完全可育单株套袋自交；

s6.f4代鉴定并形成新的双低甘蓝型油菜保持系和不育系：将上述s5完全可育单株和姊妹交不育株系种植观察不育情况，姊妹交不育单株是否全不育、可育单株后代是否全可育，如果f3代姊妹交不育后代仍然全不育，对应f3代完全可育后代不再分离不育单株，那么这个不育和可育就形成核基因一致的保持系和不育系成对关系；如果f3代完全可育单株后代仍然分离不育、可育后代，则重复s4步骤继续采用f3代选育方法进行多个单株的成对姊妹交，直到完全可育单株后代不再分离不育株为止，且姊妹交后代全不育。

所述的其他遗传稳定优良性状双低甘蓝型油菜材料为甘蓝型油菜细胞质保持系、恢复系、或不恢不保材料的任意一种；优良性状包括高含油、高油酸、低硫苷、低芥酸、早熟、抗裂角、抗根肿病、矮杆、红色花瓣、紫色花瓣、桔红花瓣等性状中的一种或两种以上性状。

所述的f3代苗期、苔期鉴定株系内整齐度、一致性。所述的snp基因芯片检测是利用油菜60ksnp芯片，随机选择10个不育和完全可育单株鉴定单株之间的遗传相似系数。

所述的f3株系形态性状包括：叶色、叶型、株高、株型、分枝角度、分枝多少，花期、成熟期等。

本发明能达到技术效果的原理是：利用油菜双单倍体诱导系在同步选育保持系和不育系过程中起到了关键的作用，油菜双单倍体诱导系诱导杂交f1代母体产生双单倍体（dh系），即诱导f1代卵细胞核基因加倍形成一个遗传稳定的后代，但f1代卵细胞中的细胞质中包含不育基因，油菜双单倍体诱导系不能诱导细胞质中的质基因遗传稳定，因此形成的f2代单株虽然可育，在f3代核基因稳定的株系中会出现胞质不育分离，但核基因遗传一致的情况。因此f3代株系内不育和可育单株细胞核基因遗传一致，除了不育和可育的遗传差异，其他性状表现一致，且核dna分析遗传差异其遗传相似度会超过95%。用可育单株与不育单株姊妹交就能实现保持系与不育系的关系。但可育植株到f4代仍然可能出现不育和可育的分离，因为胞质基因有可能还会分离，因此需要继续用兄妹交的办法来保持不育，直到可育株系不再出现不育分离，且姊妹交后代全不育。

本发明的有益效果是：1、快速选育保持系和不育系，不育系和保持系都是一步成型，最快3-4代就可选育出成对的保持系和不育系，较传统方法效率提高3-4倍以上；2、该方法实用于双低甘蓝型油菜玻里马胞质不育、萝卜胞质不育、芥菜胞质不育、ja型不育胞质类型的不育系、保持系同步选育过程。3、本方法与现有的方法比较，保持系基本稳定后再与不育系测交回交，保持系稳定的同时回交不育系替换核基因，保持系和不育系不是同步完成，而是保持系先选，后再进行不育系的选育，现有方法周期长、人力物力投入大，本发明极大的缩短了选育周期，减少了人力物力的投入成本。

附图说明

图1为本发明的流程示意图。

图2为本发明改良早熟、双低甘蓝型油菜玻里马细胞质不育系及保持系4182a、4182b的快速同步选育的流程示意图。

图3为ssr分子标记（引物h57）鉴定4182亲缘关系分子标记电泳图。

图4为本发明改良双低、高油、早熟甘蓝型油菜玻里马细胞质不育系及保持系4173a、4173b的快速同步选育的流程示意图。

图5为ssr分子标记（引物h53）鉴定4173亲缘关系分子标记电泳图。

图6为本发明改良矮杆、早熟、双低甘蓝型油菜萝卜胞质不育系及保持系3772a、3772b的快速同步选育的流程示意图。

图7为ssr分子标记（引物h105）鉴定3772亲缘关系分子标记电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1：

如图1、图2所示，为改良现有的双低甘蓝型油菜玻里马细胞质不育蓉a0464的熟期，2016年3月用早熟、双低材料省双9617与华3f5杂交后f15代选系稳定材料（2月低初花，4月30前成熟）与蓉a0464的保持系蓉b0464杂交，2016年5月获得杂交f1，2017年3月杂交f1花期去雄，用油菜双单倍体诱导系y3380花粉授粉，2017年5月获得诱导后代种子（f2代）。2017年5月诱导后代（f2代）在四川马尔康夏繁加代，选正常四倍体、花药可育、早开花单株套袋自交，2017年10月获得f2代单株自交种子（f3代），并对套袋单株进行品质测试，淘汰高芥酸、高硫苷单株种子。同年，将f3代单株种植在崇州基地对f3代株系进行一致性、稳定性鉴定，2018年3月，调查早开花整齐株系，花期是否出现不育可育分离，发现4182株系，4181株系苗期苔期整齐一致，且早开花，花期存在可育不育分离，存在不育可育分离的株系占整个f3稳定株系的20%，并将这两个株系中的不育单株和可育单株进60ksnp芯片检测，发现两个株系不育和可育单株之间相似系数是95.3%和96.7%，且苗期、花期株系内整齐一致，仅存在株系内单株的不育和可育分离，用4182、4181株系内10个可育单株给10个不育单株成对授粉，并将可育单株套袋自交。同年5月到马尔康加代，8月花期鉴定，4812-5可育单株不再分离不育株，4182a×4182-5姊妹交单株后代全部不育，且不育和可育整齐，且形态、熟期一致，表现为早开花、早成熟,并通过分子标记鉴定，如图3所示，ssr分子标记（引物h57）鉴定4182亲缘关系，其中，p1表示：蓉b0464，p2表示：早熟（省双9617×华3f5）选系f15,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12表示4182株系内不同单株，4182-5a，4182-5形成的成对不育系和保持系，都含有省双9617与华3f5杂交后f15代选系稳定材料与蓉b0464的基因来源，是这两个亲本杂交选育而来，且4代快速实现保持系和不育系核基因一致的成对关系，形成新的早熟、双低甘蓝型玻里马细胞质不育系4182a和对应保持系4182b。4181株系内的其他10个可育株自交后代出现可育、不育分离的现象，继续用可育和不育株系成对交，下一年继续调查，说明可育株系内细胞质基因仍然在分离。

实施例2：

如图4所示，为改良现有的早熟、双低甘蓝型油菜玻里马细胞质不育蓉a0496的含油率（低于40%），2016年3月用双低、高含油（含油率大于51%）甘蓝型油菜c142f10代选系稳定材料与蓉a0496测交，2016年5月获得测交f1，2017年3月测交f1花期去雄（测交f1半可育），用油菜双单倍体诱导系y3560花粉授粉，2017年5月获得诱导后代种子（f2代）。2017年5月诱导后代（f2代）在四川马尔康夏繁加代，选正常四倍体、花药可育、早开花的单株套袋自交，2017年10月获得f2代单株自交种子（f3代），并对套袋单株进行品质测试，淘汰高芥酸、高硫苷、低含油率单株种子，重点选择含油率超过45%，且双低的单株继续种植。同年，将优选的f3代单株种植在崇州基地对f3代株系进行一致性、稳定性鉴定，2018年3月，调查整齐株系，花期是否出现不育可育分离，发现4173株系苗期、苔期整齐一致，但存在可育不育分离，存在不育可育分离的株系占整个f3稳定株系的10%，并将这个株系中的不育单株和可育单株进60ksnp芯片检测，发现不育和可育单株之间相似系数在98.5%，且苗期、花期株系内整齐一致，仅存在株系内单株的不育和可育分离，用4173株系内10个可育单株给10个不育单株成对授粉，并将可育单株套袋自交，并测试品质，可育单株和不育株姊妹交含油率在45%-49%不等。同年5月到马尔康加代，8月花期鉴定，4173-7可育单株不再分离不育株，4173a×4173-7姊妹交单株后代全部不育，且不育和可育整齐，且形态、熟期一致，并通过分子标记鉴定，如图5所示，ssr分子标记（引物h53）鉴定4173亲缘关系分子标记电泳图，其中，p1表示：蓉a0496，p2表示：高油c142f10选系,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12表示4173株系内不同单株，4173a，4173-7形成的成对不育系和保持系，都含有c142选系稳定材料与蓉a0496的基因来源，是这两个亲本杂交选育而来，实现了早熟、含油率提高的目的，且4代快速实现保持系和不育系核基因一致的成对关系，形成新的早熟、双低高油甘蓝型玻里马胞质不育系4173a和对应保持系4173b。

实施例3：

如图6所示，对现有的双低甘蓝型油菜萝卜胞质不育蓉萝a0068的株高、熟期进行改良，2016年3月用矮杆、早熟、双低甘蓝型油菜川油36选系f8代稳定材料（含有萝卜胞质恢复基因，花期早（2月底初花，4月底成熟）、株高150cm左右），与蓉萝a0068测交，2016年5月获得测交f1，2017年3月测交f1花期去雄（测交后代全可育），用油菜双单倍体诱导系y3380花粉授粉，2017年5月获得诱导后代种子（f2代）。2017年5月诱导后代（f2代）在四川马尔康夏繁加代，选正常四倍体、花药可育、早开花、矮杆单株套袋自交，2017年10月获得f2代单株自交种子（f3代），并对套袋单株进行品质测试，淘汰高芥酸、高硫苷单株种子。同年，将优选的f3代单株种植在崇州基地对f3代株系进行一致性、稳定性鉴定，2018年3月，调查整齐株系，花期是否出现不育可育分离，发现3772株系苗期、苔期整齐一致，但存在可育不育分离，存在不育可育分离的株系占整个f3稳定株系的20%，并将这个株系中的不育单株和可育单株进60ksnp芯片检测，发现不育和可育单株之间相似系数在97.5%，且苗期、花期株系内整齐一致，仅存在株系内单株的不育和可育分离，用3772株系内10个可育单株给10个不育单株成对授粉，并将可育单株套袋自交。同年5月到马尔康加代，8月花期鉴定，如图7所示，ssr分子标记（引物h105）鉴定3772亲缘关系分子标记电泳图，其中，p1表示：蓉萝a0068，p2表示：矮杆、早熟甘蓝型油菜川油36选系f8代，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12表示3772株系内不同单株，3772-1，3772-6,3772-8可育单株不再分离不育株，3772a×3772-1、3772ax3772-3、3772ax3772-8姊妹交单株后代全部不育，且不育和可育整齐，且形态、熟期一致，并通过分子标记鉴定，3772a×3772-1、3772-1，3772a×3772-6、3772-6，3772a×3772-8、3772-8形成的成对不育系和保持系，都含有川油36（f8）选系稳定材料与蓉萝a0068的基因来源，是这两个亲本杂交选育而来，且4代快速实现保持系和不育系核基因一致的成对关系，形成新的矮杆、早熟、双低甘蓝型油菜萝卜胞质不育系3772a和对应保持系3773b。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。