一种多肉植物红蛋水泡的组织培养方法与流程

本发明属于多肉植物组织培养方法技术领域，具体涉及一种多肉植物红蛋水泡的组织培养方法。

背景技术：

红蛋水泡(adromischusmarianiae'hallii')为景天科天锦章属(水泡)多肉植物，产自南非卡鲁高原，是玛丽安adromischusmarianiae的栽培变种。红蛋水泡，属于小型多肉植物，叶片圆形或阔椭圆形，边缘薄中间厚，环状簇生于茎干上，叶面有细小纹理，叶色绿到红色。红蛋水泡出状态，叶片肥鼓，叶缘红边明显，叶色泛红，颇为可爱。红蛋水泡系下繁殖的品种不多，但几乎每个品种都成了经典。

红蛋水泡植株为多年生肉质草本，红蛋水泡生长速度缓慢，繁殖率低，植株矮小，通常开花困难，寿命极长，不容易形成老桩，植株生长比较慢，多年群生后才会非常壮观。是多肉爱好者搜集栽培的热门植物，市场需求大，红蛋水泡的繁殖一般是扦插和分株等繁殖方法繁殖系数低，繁殖速度慢，生长周期长，这使得种苗稀缺，难以满足市场需要。

为了建立多肉大量繁殖的体系，本领域公开了多种繁殖方法，例如公开号为cn104304005a公开了一种多肉植物叶插二次生根的繁殖方法，在一次叶插繁殖方法的基础上，长出新植株，将新植株脱离繁殖叶片后再去除愈伤组织，涂抹生根粉后在基质中培养，得到多肉植物的快繁。该方法对叶插不易生根的多肉植物品种生根，提高了生根率和繁殖效率，但是该方法繁殖效率低，不能实现大量植株的快繁。组织培养法是一种繁殖速度快，且能够获得大量繁殖材料，例如公开号为cn108040876的专利公开了一种多肉植物的组织培养方法，通过将外植体在基础培养基上初次诱导得到愈伤组织，愈伤组织进行二次诱导催生不定芽，不定芽在增殖培养基上培养得到增殖芽块，再经过生根培养，得到组培苗。虽然该组培方法提供通过诱导愈伤组织培养和不定芽诱导培养时公开了不同阶段的选用的植物激素的种类及用量，但是不同多肉植物对不同种类植物激素的吸收及生长的情况不同，因此，该多肉植物组培方法不适用于所有种类多肉植物的组培。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种多肉植物红蛋水泡的组织培养方法，建立了高品质和多数量的快繁体系。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种多肉植物红蛋水泡的组织培养方法，包括以下步骤：

1)以红蛋水泡的叶片为外植体，消毒，得到表面消毒的外植体；

2)在所述表面消毒的外植体的伤口处用羧苄青霉素粉处理，接种于愈伤组织诱导培养基中，在接种后的外植体的表面撒羧苄青霉素粉，21～25℃下愈伤组织诱导培养，得到愈伤组织；

所述愈伤组织诱导培养基以ms为基本培养基，还包括以下浓度的组分：1～1.5mg/l6-苄基腺嘌呤、0.2～0.5mg/l吲哚乙酸、20～30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉，ph值为5.8～6.0；

3)将愈伤组织转接到绿色球形颗粒诱导培养基上，21～25℃下得到绿色球形颗粒诱导培养，得到绿色球形颗粒；

所述绿色球形颗粒诱导培养基以ms为基本培养基，还包括以下浓度的组分：0.5～1.5mg/l玉米素、0.5mg/liaa、20～30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉，ph值为5.8～6.0；

4)将所述绿色球形颗粒接种于硬化培养基上进行硬化培养，得到分化芽苗；

所述硬化培养基包括花宝二号硬化培养基或1/2wpm改良培养基；

所述花宝二号硬化培养基包括以下浓度的组分：0.5g/l花宝二号、0.5mg/l玉米素、0.5mg/liaa、20～30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉；ph值为5.8～6.0；

所述1/2wpm改良培养基以不含硝酸钙的1/2wpm培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：0.5mg/l玉米素、0.5mg/liaa、30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉；ph值为5.8～6.0；

5)将分化芽苗进行壮苗培养和驯化培养，得到红蛋水泡成苗；

所述愈伤组织诱导培养、绿色球形颗粒绿色颗粒诱导培养或硬化培养期间进行光照；所述光照的时间为14～17h/d；所述光照的强度为3000～5000lx。

优选的，步骤3)中所述绿色球形颗粒诱导培养基包括以下浓度的组分：1.0mg/l玉米素、0.5mg/liaa、30g/l食用白砂糖和7g/l琼脂粉。

优选的，在所述转接到绿色球形颗粒诱导培养基上前，包括将所述愈伤组织切成愈伤组织小块；所述愈伤组织小块的体积为0.3～0.5×0.3～0.5×0.3～0.5cm³。

优选的，步骤3)中每个培养皿中接种有8～10个所述愈伤组织小块。

优选的，步骤2)中所述愈伤组织诱导培养基包括以下浓度的组分：1.5mg/l6-苄基腺嘌呤、0.5mg/l吲哚乙酸、30g/l食用白砂糖和7g/l琼脂粉。

优选的，步骤2)中每瓶愈伤组织诱导培养基中接种3～5个红蛋水泡叶片。

优选的，步骤4)中每瓶硬化培养基上接种有15～20颗绿色球形颗粒。

优选的，所述光照的时间为16h/d；所述光照的强度为4000lx。

优选的，步骤5)中所述壮苗培养用培养基以1/2n6或1/2b5培养基为基本培养基，包括0.2mg/liaa、30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉。

优选的，步骤5)中所述驯化培养用基质包括体积比为2～3：1～1.5：1～1.5的泥炭土、珍珠岩和粗河沙的混合物。

本发明提供了一种多肉植物红蛋水泡的组织培养方法，以红蛋水泡的叶片为外植体经过消毒和羧苄青霉素粉处理防止外植体发生污染，经过愈伤组织诱导培养基培养后，愈伤组织诱导率达到100％，较其他种类或含量植物激素组合的愈伤组织诱导培养基(用玉米素替换6-苄基腺嘌呤)培养(愈伤组织诱导率为50％)相比，愈伤组织诱导率提高了一倍，同时缩短了诱导培养2～3倍；得到的愈伤组织在绿色球形颗粒诱导培养基上培养，每块儿愈伤组织上均可诱导得到绿色球形颗粒，诱导率为100％，而采用6-苄基腺嘌呤和iaa组合作为对照，使愈伤组织变成白色絮状结构，每个处理上没有发生球形颗粒，不能用于后续扩繁；绿色球形颗粒采用两种硬化培养基分别进行硬化培养，结果显示，球形颗粒颜色从嫩绿色转变成深绿色，64％～91％的颗粒表面发生小突起，培养至38天时，98％～100％的颗粒上分化1～5个不等的小突起，颗粒的颜色转变成深绿色，颗粒变硬，内部空芯也随之消失，部分球形颗粒突起分化形成芽苗；芽苗经过壮苗和驯化移栽的方法获得了大量的红蛋水泡组织培养苗。本发明提供的方法能大大提高了红蛋水泡的繁殖系数和繁殖速度。红蛋水泡的繁殖系数高达200多倍，植株成活率高达90％以上，相对于常用的叶插繁殖方法比较，本发明可以高效的提高红蛋水泡的繁殖效率，为红蛋水泡的大规模生产提供技术支持，同时为其他水泡多肉的研究提供一定的参考价值，是一种具有明显经济和社会效益的红蛋水泡的新的繁殖方法。

附图说明

图1为本发明提供的组织培养方法的流程图；

图2为本发明提供的红蛋水泡组织培养各阶段形态图，其中图2-a为诱导出的的红蛋水泡的愈伤组织；图2-b和图2-c均为诱导的绿色球形颗粒；图2-d为硬化培养阶段形态图；图2-e为1/2n6+0.2mg/liaa的培养基上壮苗生根培养阶段的形态图和图2-f为1/2b5+0.2mg/liaa的培养基上壮苗生根培养阶段的形态图；图2-g为壮苗生根的红蛋水泡小苗在阴干处晾晒；图2-h为晾晒后的红蛋水泡小苗被移栽到基质上。

具体实施方式

本发明提供了一种多肉植物红蛋水泡的组织培养方法，包括以下步骤：

1)以红蛋水泡的叶片为外植体，消毒，得到表面消毒的外植体；

2)在所述表面消毒的外植体的伤口处用羧苄青霉素粉处理，接种于愈伤组织诱导培养基中，在接种后的外植体的表面撒羧苄青霉素粉，21～25℃下愈伤组织诱导培养，得到愈伤组织；

所述愈伤组织诱导培养基以ms为基本培养基，还包括以下浓度的组分：1～1.5mg/l6-苄基腺嘌呤、0.2～0.5mg/l吲哚乙酸、20～30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉，ph值为5.8～6.0；

3)将愈伤组织转接到绿色球形颗粒诱导培养基上，21～25℃下得到绿色球形颗粒诱导培养，得到绿色球形颗粒；

所述绿色球形颗粒诱导培养基以ms为基本培养基，还包括以下浓度的组分：0.5～1.5mg/l玉米素、0.5mg/liaa、20～30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉，ph值为6.0；

4)将所述绿色球形颗粒接种于硬化培养基上进行硬化培养，得到分化芽苗；

所述硬化培养基包括花宝二号硬化培养基或1/2wpm改良培养基；

所述花宝二号硬化培养基包括以下浓度的组分：0.5g/l花宝二号、0.5mg/l玉米素、0.5mg/liaa、30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉；ph值为5.8～6.0；

所述1/2wpm改良培养基以不含硝酸钙的1/2wpm培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：0.5mg/l玉米素、0.5mg/liaa、30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉；ph值为5.8～6.0；

5)将分化芽苗进行壮苗培养和驯化培养，得到红蛋水泡成苗；

所述愈伤组织诱导培养、绿色球形颗粒绿色颗粒诱导培养或硬化培养期间进行光照；所述光照的时间为14～17h/d；所述光照的强度为3000～5000lx。

本发明以红蛋水泡的叶片为外植体，消毒，得到表面消毒的外植体。

在本发明中，所述消毒前优选将所述红蛋水泡的叶片进行清洗。所述清洗的方法优选为以0.2g/每片叶的洗衣粉清洗叶表面，用自来水清洗5min，以便除去表面污物，清洗后的叶片置于超净工作台上。

在本发明中，所述消毒的方法，优选包括以下步骤：用添加体积浓度0.05％～0.1％吐温-20的0.1％～0.15％hgcl2溶液表面消毒3～4min，用无菌水洗4～5次，每次洗1min风干外植体表面的水分，备用。

得到表面消毒的外植体后，本发明在所述表面消毒的外植体的伤口处用羧苄青霉素粉处理，接种于愈伤组织诱导培养基中，在接种后的外植体的表面撒羧苄青霉素粉，21～25℃下愈伤组织诱导培养，得到愈伤组织；

所述愈伤组织诱导培养基以ms为基本培养基，还包括以下浓度的组分：1～1.5mg/l6-苄基腺嘌呤、0.2～0.5mg/l吲哚乙酸、20～30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉，ph值为5.8～6.0。

在本发明中，所述羧苄青霉素粉处理的方法优选为将表面消毒的外植体在伤口处蘸取羧苄青霉素粉。所述羧苄青霉素粉能有效阻止伤口处发生病菌感染。

在本发明中，所述接种时优选将叶片的正面朝上，使伤口处接触到培养基，有利于快速诱导愈伤组织的生成。所述愈伤组织诱导培养基优选包括以下浓度的组分：1.5mg/l6-苄基腺嘌呤、0.5mg/l吲哚乙酸、30g/l食用白砂糖和7g/l琼脂粉。在本发明中，每瓶愈伤组织诱导培养基中优选接种3～5个红蛋水泡叶片，更优选为接种4个红蛋水泡叶片。每瓶的培养基的体积优选为50～80ml，更优选为60～70ml。接种后的外植体的表面撒羧苄青霉素粉的量优选为8～12mg/叶片，更优选为10mg/叶片。

在本发明中，愈伤组织诱导培养的温度优选为23℃。所述愈伤组织诱导培养期间进行光照，所述光照的时间优选为16h/d；所述光照的强度优选为4000lx。所述愈伤组织诱导培养至35天时，膨大、裂开的叶片上形成淡绿色的比较松散的愈伤组织，这时外植体的膨大到原来叶片大小的3～4倍，愈伤组织诱导率为100％。

得到愈伤组织后，本发明将愈伤组织转接到绿色球形颗粒诱导培养基上，21～25℃下得到绿色球形颗粒诱导培养，得到绿色球形颗粒；

所述绿色球形颗粒诱导培养基以ms为基本培养基，还包括以下浓度的组分：0.5～1.5mg/l玉米素、0.5mg/liaa、30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉，ph值为6.0。所述ms的配方参见文献(murashige和skoog，1962)。

在本发明中，在所述转接到绿色球形颗粒诱导培养基上前，包括将所述愈伤组织切成愈伤组织小块；所述愈伤组织小块的体积优选为0.3×0.3×0.3cm³。每个培养皿中优选接种有8～10个所述愈伤组织小块，更优选为9个。每培养皿中装有的培养基的体积优选为20～30ml，更优选为25ml。接种后，优选用宽1.5～2cm保鲜膜封口，防止杂菌污染。

在本发明中，经56～63天培养，愈伤组织表面上或蓬松的愈伤组织内分化出大量的、大小不等的、质地比较脆的，空心的嫩绿色球形颗粒(2mm以上)，获得的绿色球形颗粒数为60～268颗/皿。其中采用如下培养基培养的绿色球形颗粒高达268颗/皿：所述绿色球形颗粒诱导培养基优选包括以下浓度的组分：1.0mg/l玉米素、0.5mg/liaa、30g/l食用白砂糖和7g/l琼脂粉。

在本发明中，所述绿色球形颗粒诱导培养期间包括光照，所述光照的时间优选为16h/d；所述光照的强度优选为4000lx。所述绿色球形颗粒诱导培养的温度优选为23℃。

得到绿色球形颗粒后，本发明将所述绿色球形颗粒接种于硬化培养基上进行硬化培养，得到分化芽苗。

在本发明中，所述硬化培养基优选包括花宝二号硬化培养基或1/2wpm改良培养基，更优选为花宝二号硬化培养基。所述花宝二号硬化培养基优选包括以下浓度的组分：0.5g/l花宝二号、0.5mg/l玉米素、0.5mg/liaa、30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉；ph值为5.8～6.0。所述花宝二号硬化培养基中花宝二号是一种美国进口速效复合肥，氮、磷和钾的质量比为20：20：20。

所述1/2wpm改良培养基优选以不含硝酸钙的1/2wpm培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：0.5mg/l玉米素、0.5mg/liaa、30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉；ph值为5.8～6.0。所述细胞培养皿的规格优选为100mm×20mm。每细胞培养皿的培养基的体积优选为20～30ml，更优选为25ml。所述绿色球形颗粒的颜色逐渐变深，颗粒开始变硬。

在本发明中，每瓶硬化培养基上优选接种有15～20颗绿色球形颗粒，更优选接种16～18颗。所述硬化培养期间包括光照，所述光照的时间优选为16h/d；所述光照的强度优选为4000lx。所述绿色球形颗粒诱导培养的温度优选为23℃。

得到分化芽苗后，本发明将分化芽苗进行壮苗培养和驯化培养，得到红蛋水泡成苗。

在本发明中，所述壮苗培养用培养基优选以1/2n6或1/2b5培养基为基本培养基，还包括0.2mg/liaa、30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉，ph值为5.8～6.0。所述1/2n6见参考文献(gamborg，1968)。所述1/2b5见参考文献(gamborg，1968)。所述壮苗培养期间包括光照，所述光照的时间优选为16h/d；所述光照的强度优选为4000lx。所述壮苗培养的温度优选为23℃。培养39天时，绿色球形颗粒上的小突起逐渐转变成小芽，与培养基接触的部分开始发生根，在两种壮苗培养基上分别86.6％和78％球形颗粒转变成完整的健康的小植物，而没有经过硬化的小颗粒转变小植物的比率仅为31％，其他的颗粒分化形成表面上愈伤组织团。

将壮苗培养后的小苗转接到同样组成的培养基上继续壮苗培养3个月，待幼苗生长到1～2cm高时，将小苗从培养瓶中取出，有自来水轻轻地洗净根部的琼脂粉后，在阴干处晾晒7天后移栽基质中，移栽当天用喷壶打湿基质表面，一周之后用喷壶喷水补充水分，15～20天统计成活率高达90％以上。所述驯化培养用基质包括体积比优选为2～3：1～1.5：1～1.5的泥炭土、珍珠岩和粗河沙的混合物。

下面结合实施例对本发明提供的一种多肉植物红蛋水泡的组织培养方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.外植体的消毒：

红蛋水泡叶片外植体：以红蛋水泡的叶片为外植体，每片叶用0.2g洗衣粉清洗叶片表面，然后用自来水清洗5min，以便除去表面污物，外植体置于超净工作台上。接种之前，将冲洗干净的红蛋水泡叶片放入已灭菌的三角瓶里，再用添加体积浓度的0.1％吐温-20的0.1％hgcl2溶液表面消毒3～4min，用无菌水洗5次，每次洗1min，具体将消毒的外植体放入无菌水里浸泡1min后更换无菌水。然后洗后的外植体放在灭菌的不锈钢盘子里，风干外植体表面的水分，备用。

2.愈伤组织诱导：

将表面消毒好的叶片外植体的掰断处沾取少许羧苄青霉素粉，接种于愈伤组织诱导培养基中，每瓶接种4个叶片。接种时叶片的正面朝上，使掰断处接触到培养基，然后在叶片表面撒一层羧苄青霉素粉，羧苄青霉素粉的撒施量为10mg/叶片。愈伤组织诱导培养的温度为23℃，培养期间进行光照，光照的时间为16h/d，光照的强度为4000lx。

所述的愈伤组织诱导培养基是以ms为基本培养基，还包括1.5mg/l6-苄基腺嘌呤(6-ba)、0.5mg/l吲哚乙酸(iaa)、20g/l食用白砂糖和6.5g/l琼脂粉。用0.1mol/lnaoh溶液或1mol/lhcl溶液调至ph值5.8，培养基分装到螺盖透明玻璃瓶，每瓶盛装培养基的体积为50ml。将配制好的培养基在0.1mpa、122℃高压灭菌20min。

愈伤组织诱导结果见图2-a：外植体在ms添加1.5mg/l6-ba+0.5mg/liaa培养基上培养7天左右时，叶片基部开始膨大，没有污染。培养10天时从叶片掰断处开始长出淡绿色的愈伤组织，培养20天左右时整叶片均膨大，叶表皮开始裂开。培养35天时，膨大、裂开的叶片上形成淡绿色的比较松散的愈伤组织，这时外植体的膨大到原来叶片大小的3～4倍，愈伤组织诱导率为100％。

3.绿色球形单颗粒的诱导和增殖：

将上述得到的愈伤组织切成约0.3×0.3×0.3cm³的小块儿并转接到绿色球形颗粒诱导培养基。所述绿色球形颗粒诱导培养基在ms培养基的基础上添加以下浓度的组分：0.5mg/l玉米素、0.5mg/liaa、25g/l食用白砂糖和8g/l琼脂粉，ph值为6.0。将配制好的培养基在0.1mpa，122℃下高压灭菌20min。灭菌完成的培养基置于超净工作台，分装到tc处理过的细胞培养皿(100mm×20mm)里，每培养皿的培养基的体积为25ml，冷却至室温。每个培养皿中接入8～10块儿愈伤组织，用1.5～2cm保鲜膜封口，防止培养过程发生污染。在绿色球形颗粒诱导培养期间，培养温度为23℃，光照时间为16h/d，光照强度为4000lx。

绿色球形颗粒培养结果见图2-b：培养28天开始愈伤组织上长出绿色球形小颗粒。经56～63天培养后，愈伤组织表面上或蓬松的愈伤组织内分化出大量的、大小不等的、质地比较脆的，空心的嫩绿色球形颗粒(2mm以上)。这种绿色球形颗粒和愈伤组织没有连接，从愈伤组织表面脱离下来或在愈伤组织内部独立存在。在玉米素0.5mg/l组合0.5mg/liaa的组合培养基中获得的球形颗粒数为92颗/皿。同时愈伤组织在所述绿色球形颗粒诱导培养基上，每块儿愈伤组织上均可诱导球形颗粒，其诱导率为100％。

4.球形颗粒的硬化

硬化：取上述诱导得到的15～20颗绿色的球形单颗粒转接到球形颗粒的硬化培养基上。

所述的硬化培养基为：1/2wpm(woodyplantmedium)不含硝酸钙的培养基中包括以下含量组分：0.5mg/l玉米素、0.5mg/liaa、30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉。用0.1mol/lnaoh溶液或1mol/lhcl溶液调至ph值5.8～6.0。

灭菌完成的培养基置于超净工作台，分装到tc处理过的细胞培养皿(100mm×20mm)里，每皿的培养基的体积为25ml，冷却至室温，接种。

绿色球形颗粒转接到1/2wpm不含硝酸钙的(0.5mg/l玉米素+0.5mg/liaa)的培养基中，培养7天时，嫩绿色的球形颗粒的颜色逐渐变深，颗粒开始变硬，46％的球形颗粒上开始出现小突起。培养14天、21天后观察结果显示，球形颗粒颜色从嫩绿色转变成深绿色，64％的颗粒表面发生小突起，球形颗粒的生长较缓慢，颗粒的质地越变越硬，部分颗粒上开始分化小芽或小根；培养38天时，98％的颗粒上分化1～5个不等的小突起，颗粒的颜色转变成深绿色，颗粒变硬，内部空芯也随之消失，部分球形颗粒突起分化形成小芽(见图2-d)。

5、壮苗：

经硬化处理的小芽被转接到小苗转化培养基中。所述小苗转化培养基是1/2n6(nitsch，1951)为基本培养基，包括以下步骤：0.2mg/liaa、30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉，用0.1mol/lnaoh溶液或1mol/lhcl溶液调至ph值6.0。配制好的培养基分装到圆形塑料培养瓶中，每瓶的培养基体积为50～80ml。培养基在0.1mpa，122℃高压灭菌20min。壮苗培养的温度为23℃，光照时间为16h/d，光照强度为4000lx。

1/2n6培养基上添加0.2mg/liaa的壮苗培养基上培养39天时，颗粒上的小突起逐渐转变成小芽，与培养基接触的部分开始发生根，在两种壮苗培养基上分别86.6％球形颗粒转变成完整的健康的小苗(见图2-e)。

6、驯化移栽：

将上述得到的小苗转接到同样组成的培养基上继续壮苗培养3个月。幼苗生长到1～2cm高时，将小苗从培养瓶中取出，有自来水轻轻地洗净根部的琼脂粉后，在阴干处晾晒7天后(见图2-g)移栽到基质(泥炭土、珍珠岩和粗河沙的体积比为3：1：1)(见图2-h)，移栽当天用喷壶打湿基质表面。移栽一周后用喷壶喷水补充水分。15～20天统计成活率高达90％以上。

实施例2

1.外植体的消毒：

红蛋水泡叶片外植体：以红蛋水泡的叶片为外植体，每片叶用0.2g洗衣粉清洗叶片表面，然后用自来水清洗5min，以便除去表面污物，外植体置于超净工作台上。接种之前，将冲洗干净的红蛋水泡叶片放入已灭菌的三角瓶里，再用添加体积浓度的0.05％吐温-20的0.1％hgcl2溶液表面消毒3～4min，用无菌水洗5次，每次洗1min，具体将消毒的外植体放入无菌水里浸泡1min后更换无菌水。然后洗后的外植体放在灭菌的不锈钢盘子里，风干外植体表面的水分，备用。

2.愈伤组织诱导：

将表面消毒好的叶片外植体的掰断处沾取少许羧苄青霉素粉，接种于愈伤组织诱导培养基中，每瓶接种4个叶片。接种时叶片的正面朝上，使掰断处接触到培养基，然后在叶片表面撒一层羧苄青霉素粉，羧苄青霉素粉的撒施量为10mg/叶片。愈伤组织诱导培养的温度为23℃，培养期间进行光照，光照的时间为16h/d，光照的强度为4000lx。

所述愈伤组织诱导培养基以ms培养基为基本培养基，包括以下含量组分：1.0mg/l6-ba、0.5mg/liaa、30g/l食用白砂糖和8g/l琼脂粉。用0.1mol/lnaoh溶液或1mol/lhcl溶液调至ph值5.8～6.0，培养基分装到螺盖透明玻璃瓶，每瓶盛装培养基的体积为50～80ml。将配制好的培养基在0.1mpa、122℃高压灭菌20min。

愈伤组织诱导结果，外植体在ms添加1.0mg/l6-ba+0.5mg/liaa培养基上培养7天左右时，叶片基部开始膨大，没有污染。培养10天时从叶片掰断处开始长出淡绿色的愈伤组织，培养20天左右时整叶片均膨大，叶表皮开始裂开。培养35天时，膨大、裂开的叶片上形成淡绿色的比较松散的愈伤组织，这时外植体的膨大到原来叶片大小的3～4倍，愈伤组织诱导率为98％。

3.绿色球形单颗粒的诱导和增殖：

将上述得到的愈伤组织切成约0.5×0.5×0.5cm³的小块儿并转接到绿色球形颗粒诱导培养基。所述绿色球形颗粒诱导培养基在ms培养基的基础上添加以下浓度的组分：1.0mg/l玉米素、0.5mg/liaa、30g/l食用白砂糖和7g/l琼脂粉，ph值为6.0。将配制好的培养基在0.1mpa，122℃下高压灭菌20min。灭菌完成的培养基置于超净工作台，分装到tc处理过的细胞培养皿(100mm×20mm)里，每培养皿的培养基的体积为25ml，冷却至室温。每个培养皿中接入10块儿愈伤组织，用1.5～2cm保鲜膜封口，防止培养过程发生污染。在绿色球形颗粒诱导培养期间，培养温度为23℃，光照时间为16h/d，光照强度为4000lx。

绿色球形颗粒培养结果见图2-c。培养28天开始愈伤组织上长出绿色球形小颗粒。经56～63天培养后，愈伤组织表面上或蓬松的愈伤组织内分化出大量的、大小不等的、质地比较脆的，空心的嫩绿色球形颗粒(2mm以上)。这种绿色球形颗粒和愈伤组织没有连接，从愈伤组织表面脱离下来或在愈伤组织内部独立存在。由玉米素1.0mg/l组合0.5mg/liaa的培养基中获得的球形颗粒数为268颗/皿。在ms添加玉米素1.0mg/l组合0.5mg/liaa的培养基上收获的球形颗粒数量最多。挑出单个颗粒后剩下的愈伤组织继续转接到ms+1.0mg/l玉米素+0.5mg/liaa的培养基上，继续诱导和增殖球形颗粒。

4.球形颗粒的硬化

硬化：取上述诱导得到的15～20颗绿色的球形单颗粒转接到球形颗粒的硬化培养基上。

所述的硬化培养基为：0.5g/l花宝二号(花宝二号是一种美国进口速效复合肥，其氮：磷：钾＝20：20：20)+0.5mg/l玉米素+0.5mg/liaa+30g/l食用白砂糖+6.5～8g/l琼脂粉。用0.1mol/lnaoh溶液或1mol/lhcl溶液调至ph值5.8。

灭菌完成的培养基置于超净工作台，分装到tc处理过的细胞培养皿(100mm×20mm)里，每皿的培养基的体积为25ml，冷却至室温，接种。

球形颗粒转接到0.5g/l花宝二号+0.5mg/l玉米素+0.5mg/liaa的培养基培养7天时，嫩绿色的球形颗粒的颜色逐渐变深，部分发紫，颗粒开始变硬，75％的球形颗粒上开始出现点状小突起。培养14天、21天后观察结果显示，球形颗粒颜色从嫩绿色转变成深绿色，91％的颗粒表面发生小突起，球形颗粒的生长较缓慢，颗粒的质地越变越硬，部分颗粒上开始分化小芽或小根；培养38天时，100％的颗粒上分化1～5个不等的小突起，颗粒的颜色转变成深绿色，颗粒变硬，内部空心也随之消失，部分球形颗粒突起分化形成带芽带根的小植物。

5、壮苗：

经硬化处理的小芽被转接到小苗转化培养基中。所述小苗转化培养基是1/2b5(gamborg，1968)为基本培养基，包括以下步骤：0.2mg/liaa、30g/l食用白砂糖和6.5～8g/l琼脂粉，用0.1mol/lnaoh溶液或1nhcl溶液调至ph值5.8～6.0。配制好的培养基分装到圆形塑料培养瓶中，每瓶的培养基体积为50～80ml。培养基在0.1mpa，122℃高压灭菌20min。壮苗培养的温度为23±2℃，光照时间为16h/d，光照强度为4000lx。

1/2b5培养基上添加0.2mg/liaa的壮苗培养基上培养39天时，颗粒上的小突起逐渐转变成小芽，与培养基接触的部分开始发生根，在两种壮苗培养基上分别78％球形颗粒转变成完整的健康的小苗(见图2-f)。

6、驯化移栽：

将上述得到的小苗转接到同样组成的培养基上继续壮苗培养3个月。幼苗生长到1～2cm高时，将小苗从培养瓶中取出，有自来水轻轻地洗净根部的琼脂粉后，在阴干处晾晒7天后移栽到基质(泥炭土、珍珠岩和粗河沙的体积比为3：1：1)，移栽当天用喷壶打湿基质表面。移栽一周后用喷壶喷水补充水分。15～20天统计成活率高达92％以上。

实施例3

按照实施例2的方法培养红蛋水泡，不同之处为步骤3中绿色球形单颗粒的诱导和增殖部分选择的诱导培养基中激素的含量是玉米素1.5mg/l和0.5mg/liaa。结果发现：玉米素1.5mg/l组合0.5mg/liaa的培养基中获得的球形颗粒数为60颗/皿。

对比例1

按照实施例1的方法进行组织培养，不同之处为将步骤2中愈伤组织培养时的培养基替换为ms基本培养基+1.0mg/l玉米素+0.5mg/l吲哚乙酸(iaa)+30g/l食用白砂糖+6.5～8g/l琼脂粉。

愈伤组织诱导结果：外植体在ms添加1mg/l玉米素+0.5mg/liaa培养时未能观察到叶片外植体膨大、裂开的现象，仅在部分外植体的掰断处开始膨大。到35天培养时，外植体的掰断处分化出淡绿色的愈伤组织，但生长比较缓慢，其愈伤组织诱导率为50％。其余的外植体的掰断处直接分化出单个小芽，愈伤组织继续培养3个月后才增殖成原来叶片大小的2～3倍。这表明在红蛋水泡愈伤组织诱导阶段6-ba有利于诱导产生愈伤组织，而玉米素不利于愈伤组织诱。

对比例2

按照实施例1的方法进行组织培养，不同之处为步骤3中绿色球形单颗粒的诱导和增殖部分，培养基的激素组合替换为玉米素2.0mg/l组合0.5mg/liaa。

绿色球形单颗粒的诱导结果：玉米素2.0mg/l组合0.5mg/liaa的培养基中获得的球形颗粒数为38颗/皿。这表明红蛋水泡对绿色球形单颗粒诱导过程中对玉米素的含量有严格要求，玉米素的含量提高对诱导培养过程没有任何益处，反而不利于成功诱导得到绿色球形颗粒。

对比例3

按照实施例1的方法进行组织培养，不同之处在于步骤3中绿色球形单颗粒的诱导和增殖部分的绿色球形颗粒诱导培养基替换为以ms为基本培养基，包括以下含量组分：1.0mg/l玉米素、1.5mg/liaa、30g/l食用白砂糖和8g/l琼脂粉。

当愈伤组织转接到ms添加1.0mg/l玉米素和1.5mg/liaa的培养基上培养，可获得单个球形颗粒，但愈伤组织仅发生膨大，愈伤组织表面上可观察比较光滑的圆形突起连在一起，但未能观察分化的、单个的球形颗粒。随iaa浓度的增加，愈伤组织分化成质地松软、蓬松的结构，未能分化球形颗粒。这说明红蛋水泡对绿色球形单颗粒诱导过程中对iaa的含量有严格要求，iaa的含量提高对诱导培养过程没有任何益处，反而不利于成功诱导得到绿色球形颗粒。

对比例4～7

按照实施例1的方法进行组织培养，不同之处在于步骤3中绿色球形单颗粒的诱导和增殖部分的绿色球形颗粒诱导培养基替换为以ms为基本培养基，包括以下含量组分：0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l或2.0mg/l6-ba和0.5mg/liaa+30g/l食用白砂糖+8g/l琼脂粉。

当愈伤组织转接到ms添加0.5～2.0mg/l6-ba和0.5mg/liaa的培养基上培养时，培养14天就愈伤组织开始膨大，随着6-ba浓度的增加愈伤组织颜色从淡绿色变成淡黄色，6-ba浓度提高到1.5～2.0mg/l时，愈伤组织变成白色絮状结构，培养20天时愈伤组织已长满培养皿。每个处理上没有发生球形颗粒。这表明红蛋水泡在绿色球形颗粒诱导培养过程对激素的种类有严格的选择，6-ba不能作为激素成功诱导绿色球形单颗粒的获得。

对比例8

按照实施例2的方法进行组织培养，不同之处在于，省略步骤4中的硬化培养直接进行壮苗培养。结果发现没有经过硬化的小颗粒转变小苗的比率仅为31％，其他的颗粒分化形成表面上愈伤组织团。这说明采用本发明提供的硬化培养基是红蛋水泡构建组培快繁体系的必须过程，有利于顺利地获得大量植株。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。