利用机械损伤高效合成血根碱和白屈菜红碱的方法与流程

本发明涉及一种利用机械损伤高效合成血根碱和白屈菜红碱的方法。技术背景博落回[macleayacordata(willd)r.b]是罂粟科博落回属多年生植物，是一种重要的传统药用植物，活性成分主要为异喹啉类生物碱。苯并菲啶生物碱(简称bias)是一类种类多样的生物碱，这些化合物具有广泛的生物活性，包括血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱等。其中血根碱具有广泛的生物活性，包括强抗肿瘤，抗菌和抗炎等。此外，血根碱和白屈菜红碱作为天然生长促进剂，已广泛用于替代畜牧业中的抗生素生长促进剂。2006年，随着欧盟全面禁止在饲养中添加抗生素生长促进剂，因此植物源的天然生长促进剂被广泛用作畜牧生产中抗生素的替代品。其市场逐年增加。目前，含血根碱的产品在70多个国家和地区广泛销售。除此以外，血根碱还是一种抗血吸虫的有效药物。目前，血根碱和白屈菜红碱主要从博落回中提取。然而，博落回是一种野生资源且还未被人工驯化，目前还无法大规模人工种植。因此，当今收集资源的方式给博落回资源带来了越来越大的压力，导致资源逐年萎缩。此外，血根碱的含量受遗传组成和环境的影响很大。因此，建立一种新的稳定和可持续发展的资源开发方式具有十分重要的意义。植物组织培养已成为工业规模生产次级代谢产物的可持续和有效替代策略。药用植物组织培养有以下优点：(1)不受环境或地理条件的影响。(2)能严格控制生产过程和产品质量。(3)缩短植物的生长周期。(4)避免占用大量土地资源。目前已经有许多植物次生代谢产物在过去几十年中通过该种方式生产，如紫草素、人参皂苷和紫杉醇。在植物组织培养基础上，再通过一些诱导子诱导能够进一步增强植物中的次级代谢物。如，茉莉酸甲酯处理增强了蛇根草中喜树碱的含量。而水杨酸则可以增加丹参细胞中次级代谢物的积累。除此以外，一些外源损伤，如风，冰雹，沙子和切割都会引起植物的反应，也会引起次生代谢产物的增加。但是目前还没有关于利用机械损伤对博落回组织培养中bias产生影响的报道，本发明拟提供一种利用机械损伤利用机械损伤高效合成血根碱和白屈菜红碱的方法。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种利用机械损伤高效合成血根碱和白屈菜红碱的方法，具体是利用机械损伤促进博落回p6h基因和dbox基因的表达，由于p6h基因和dbox基因是参与博落回血根碱和白屈菜红碱合成的主要基因，从而促进血根碱和白屈菜红碱的高效合成。为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：提供一种利用机械损伤高效合成血根碱和白屈菜红碱的方法，具体包括如下步骤：(1)培育无菌组培苗：选取按照16小时光培养和8小时暗培养，光照强度为4500～9000lx，培养60天的无菌组培苗备用；(2)使用无菌针头将步骤(1)培育的无菌组培苗的幼苗叶片扎8～12个孔，然后置于ms培养基中，25℃下在16小时光周期下培育24～120h；(3)提取步骤(2)经过扎孔处理培育后的无菌组培苗中的代谢产物并进行定量分析，即得。进一步地，步骤(2)机械损伤的方法是用无菌解剖刀在步骤(1)培育的无菌组培苗的幼苗叶片上轻划2～3道伤口。进一步地，步骤(2)所得无菌组培苗在提取代谢产物之前应当立刻置于液氮中-70℃下冷冻储存，待用。进一步地，步骤(3)的提取方法如下：将步骤(2)获取的无菌组培苗的植物组织与甲醇混合，混合比例为：0.05～0.1mg/ml，然后超声提取30～40分钟，并以14000～15000rpm离心15～20分钟，并通过0.22mm膜滤器过滤，即得。进一步地，步骤(1)具体为：将采摘的博落回外植体先用75％酒精浸泡，再用0.1％升汞进行消毒处理，完成消毒灭菌处理；在无菌工作台中，用无菌解剖刀在外植体上轻划2～3道伤口，最后接种到ms固体培养基(市场上直接购买的ms加水调节成4.42g/l，加30g/l蔗糖，调节ph＝5.8，加入0.3％植物凝胶调成固体培养基)上，置于25℃暗培养箱中培养，待长出愈伤，再置于25℃，16小时光培养和8小时暗培养后长出无菌组培苗。进一步地，步骤(1)还包括对获得的无菌组培苗通过继代培养或植株再生或外植体引发愈伤的手段进行扩繁。进一步地，所述博落回外植体包括叶片、茎段，在无菌工作台中，用无菌剪刀将消毒后的叶片剪至5mm×5mm大小，将茎段斜切成长度0.4～0.6cm的小段，然后做划伤处理。本发明的有益效果：本发明提供的方法通过对博落回无菌组培苗进行机械损伤(包括扎孔或划伤等方式)，促进参与博落回中血根碱和白屈菜红碱的合成的p6h(普罗托品-6-羟基化酶)基因和dbox(二氢苯并菲啶氧化酶)基因的表达，进而促进血根碱和白屈菜红碱的高效合成，然后通过从培育的无菌组培苗中提取代谢产物，高效获得血根碱和白屈菜红碱。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为博落回中血根碱和白屈菜红碱的合成途径；图2为机械损伤处理后与对照组的博落回组培苗中别隐品碱的含量对比图；图3为机械损伤处理后与对照组的博落回组培苗中原阿片碱的含量对比图；图4为机械损伤处理后与对照组的博落回组培苗中二氢白屈菜红碱的含量对比图；图5为机械损伤处理后与对照组的博落回组培苗中二氢血根碱的含量对比图；图6为机械损伤处理后与对照组的博落回组培苗中白屈菜红碱的含量对比图；图7为机械损伤处理后与对照组的博落回组培苗中血根碱的含量对比图；图8为机械损伤处理后与对照组的博落回组培苗中p6h基因表达量对比图；图9为机械损伤处理后与对照组的博落回组培苗中dbox基因表达量对比图。具体实施方式为了更好地阐述该发明的内容，下面通过具体实施例对本发明进一步的验证。特在此说明，实施例只是为更直接地描述本发明，它们只是本发明的一部分，不能对本发明构成任何限制。1、培育无菌组培苗：基于申请人之前的研究发现：实验操作过程，使用嫩枝比叶片更方便操作，且嫩枝组更容易、更快产生愈伤组织，也能更快生长获得整棵植株。本发明采用博落回茎段作为无菌组培苗培育的外植体。将采摘的博落回茎段先用75％酒精浸泡，再用0.1％升汞进行消毒处理，完成消毒灭菌处理；在无菌工作台中，首先将茎段斜切成长度0.4～0.6cm的小段，然后用无菌解剖刀在茎小段上轻划2～3道伤口，最后接种到ms固体培养基(市场上直接购买的ms加水调节成4.42g/l，加30g/l蔗糖，调节ph＝5.8，加入0.3％植物凝胶调成固体培养基)上，置于25℃暗培养箱中培养，待长出愈伤，再置于25℃，光照强度为4500～9000lx，16小时光培养和8小时暗培养后长出无菌组培苗；无菌组培苗通过继代培养或植株再生或外植体引发愈伤的手段进行扩繁；选取培养60天的无菌组培苗，待用。2、配制ms培养基将市面上买到的ms培养基粉末，按照标准配比，4.42克ms培养基粉末加1l水调成基础培养基，然后加蔗糖:30g/l+植物凝胶:3g/l，调ph值为5.8，即得ms培养基。3、伤口处理及培育使用无菌针头将无菌组培苗的幼苗叶片扎8～12个孔，然后置于ms培养基中，25℃下在16小时光周期下培育，并分别收集0h，24h，72h和120h的组培苗样品。以无伤口处理的组培苗置于ms培养基中在相同条件下培育，作为对照组，同样收集0h，24h，72h和120h的组培苗样品。收集的无菌组培苗样品在提取代谢产物之前应当立刻置于液氮中-70℃下冷冻储存，待用。4、分别将收集的不同培养基培育及不同时间点(0h，24h，72h和120h)收集的冷冻干燥的各组培苗样品(0.5mg)与甲醇(25ml)混合。然后，通过超声提取样品30分钟，并以14000rpm离心15分钟，并通过0.22mm膜滤器过滤。最后，溶液使用behc18柱通过ultra-hplcagilent1290仪器进行色谱分离。自动进样器温度设定为6℃。uhplc与qqq质谱仪(6460a，agilent)偶联。使用5个点产生校准曲线，并用于评估目标化合物的绝对定量。5、将收集的不同培养基培育及不同时间点(0h，24h，72h和120h)收集的各组培苗接种组织(100mg)用于rna提取。将所有组织在液氮中研磨，并采用rna提取试剂盒(takara，minibestplantgenomicdna，china)提取总rna。同时，采用primescripttmrtmastermix(takara，china)合成cdna。通过qpcr在基因表达中使用的引物列于下表1所示。采用abi7300和sybrpremix(roche，switzerland)进行定量pcr(qpcr)。在所有应用中，一对18s用作管家基因。表1引物核算序列6、统计分析所有实验重复三次并在四个不同时间点(0h，24h，72h和120h)记录数据；使用graphpadprism软件进行单因素方差分析，然后使用事后检验tukey的显着性差异(hsd)进行均值比较。7、结论及分析(1)组培苗中bais含量测定结果及分析表2伤口处理与未处理组在不同时间点的组培苗中别隐品碱的含量(mg/g)时间0h24h72h120h未处理组0.32±0.06///伤口处理组/0.156±0.171.19±0.110.73±0.19表3伤口处理与未处理组在不同时间点的组培苗中原阿片碱的含量(mg/g)时间0h24h72h120h未处理组1.574±0.2///伤口处理组/2.21±0.171.93±0.261.19±0.19表4伤口处理与未处理组在不同时间点的组培苗中二氢白屈菜红碱的含量(mg/g)表5伤口处理与未处理组在不同时间点的组培苗中二氢血根碱的含量(mg/g)时间0h24h72h120h未处理组0.027±0.004///伤口处理组/0.018±0.0050.037±0.0060.052±0.004表6伤口处理与未处理组在不同培养基不同时间点的组培苗中白屈菜红碱的含量(mg/g)时间0h24h72h120h未处理组0.057±0.01///伤口处理组/0.078±0.030.139±0.010.128±0.007表7伤口处理与未处理组在不同培养基不同时间点的组培苗中血根碱的含量(mg/g)时间0h24h72h120h未处理组0.261±0.02///伤口处理组/0.331±0.080.456±0.040.381±0.08图2～7分别为伤口处理与未处理组在不同时间收集的博落回组培苗中的别隐品碱、原阿片碱、二氢白屈菜红碱、二氢血根碱、白屈菜红碱、血根碱的含量对比图。与0h组相比，*号表示显著变化(tukey's检验，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005，****表示p<0.001)。上述表2～7及图2～7的结果显示：与未处理组相比，经过扎孔处理后的博落回组培苗中别隐品碱、原阿片碱、二氢白屈菜红碱、二氢血根碱分别在72h、24h、120h、120h达到最高值，均比未处理组有不同程度的提高；血根碱和白屈菜红碱的含量均在处理120小时达到最高值，分别增加了1.2倍和0.5倍。(2)组培苗中基因表达结果及分析从图1所示的博落回中血根碱和白屈菜红碱的合成途径可知：从原阿片碱(pro)到二氢血根碱(dhsan)再到血根碱(san)分别需要由原阿片碱6位羟基化酶(p6h)和二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)催化；从别隐品碱(all)生成二氢白屈菜红碱(dhche)再到生成白屈菜红碱(che)，也需要6位羟基化酶(p6h)和二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)催化。因此可以通过检测这两种基因的表达水平来进一步分析诱导模式对内容物的影响。通过分析p6h和dbox基因的基因表达水平，可以进一步分析诱导子mj及sa对基因表达的作用。检测结果如下表8～9所示，图8～9分别为不同时间和不同处理的博落回组培苗中p6h基因、dbox基因的表达量对比图。与0h组相比，*号表示显著变化(tukey's检验，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005，****表示p<0.001)。表8伤口处理与未处理组在不同培养基不同时间点的组培苗中p6h基因的表达量时间0h24h72h120h未处理组13.18±0.68///伤口处理组/2.53±0.167.69±0.5511.11±0.08表9伤口处理与未处理组在不同培养基不同时间点的组培苗中dbox基因的表达量时间0h24h72h120h未处理组1.32±0.1///伤口处理组/1.56±0.110.8±1.620.2±0.8从图8～9，及上表8～9可知：伤口处理组与未处理组比较，伤口处理组培苗中p6h基因表达水平在120小时达到最大值，但结果显示伤口处理组在实验时间范围内，相比未处理组p6h基因表达水平反而有降低，说明在这个时间内，伤口处理对p6h基因表达水平有一定的抑制作用；dbox基因表达水平也是在120h时最高，但dbox基因表达水平在120h时的表达量比未处理时增加了14倍。综上，伤口处理对不同的酶基因的影响有所不同，但是最终，通过诱导子sa、mj处理都能提高博落回组培苗中的血根碱和白屈菜红碱的含量，也能不同程度提高其他bais的含量。以上所述为本发明的具体实施方式，但不能对本发明构成任何限制，因此需特别指出，凡是以本发明为基础，做得任何修改与改进均落在本发明保护范围之内。seqidno.1～6分别为引物mcp6h-qp-f、mcp6h-qp-r、mcdbox-qp-f、mcdbox-qp-r、18s-qp-f、18s-qr-r的序列。sequencelisting<110>湖南美可达生物资源股份有限公司<120>利用机械损伤高效合成血根碱和白屈菜红碱的方法<130>20181210<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>mcp6h-qp-f序列<400>1catcaaggacgttcgagcct20<210>2<211>20<212>dna<213>mcp6h-qp-r序列<400>2ctcctcaccacgcacaatct20<210>3<211>20<212>dna<213>mcdbox-qp-f序列<400>3actgttgccacggtcgatag20<210>4<211>20<212>dna<213>mcdbox-qp-r序列<400>4tggaggagcttgtcaacacc20<210>5<211>20<212>dna<213>18s-qp-f序列<400>5cttcgggatcggagtaatga20<210>6<211>20<212>dna<213>18s-qr-r序列<400>6gcggagtcctagaagcaaca20当前第1页12