人工饲养冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人工饲养冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫的方法。

背景技术：

冬虫夏草ophiocordycepssinensis(berk.)g.h.sungetal.)是产于中国云贵高原和青藏高原的著名中药材、珍稀滋补品，是中国特有资源。早在公元8世纪，我国藏医就把冬虫夏草收入藏医名著《月王药珍》。1757年清代名医吴仪洛在《本草从新》上已经对冬虫夏草的药效作了详细记载。《中国药典》记载冬虫夏草功能与主治：“补肺益肾，止血化痰。用于久咳虚喘，劳嗽咯血，阳痿遗精，腰膝酸痛”。

冬虫夏草产季，人们蜂涌产地乱采乱挖，不仅灭绝性采挖冬虫夏草，而且严重破坏西部高原草甸地带本来已经脆弱的生态环境。为了挽救急剧减少的冬虫夏草以及恢复西部高原生态环境，人工培育冬虫夏草具有重要意义。

人工培育冬虫夏草产业化，其基础是规模化人工饲养冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫。而虫生真菌和细菌对冬虫夏草寄主幼虫是具有毁灭性的天敌，防治天敌危害是人工培育冬虫夏草关键之一。低海拔地区人工饲养寄主蝠蛾幼虫其病害十分严重，存活率低。若在同一地点长期饲养，寄主蝠蛾幼虫病害是具有毁灭性的。细菌、真菌病害等是低海拔地区规模化饲养寄主蝠蛾幼虫的瓶颈。不有效防治其病害，就不能提供人工培育冬虫夏草相应的的虫源，人工培育冬虫夏草就难以实现产业化。幼虫生活在土壤中，而上述病原物同样可以在低温和土壤中生长和繁殖。空间杀菌，饲养基质土壤灭菌或拌和杀菌药剂等措施无法消灭土壤中生存的细菌和虫生真菌，进而无法阻断土壤中生长繁殖并以空气传播的病原物侵染以土壤为栖息场所的寄主幼虫。

尽管目前对细菌性病害和粉拟青霉、绿僵菌病害等有相关报道，但至今均未能对细菌性和真菌性病害提出彻底有效的防治措施。幼虫细菌病严重，在虫体发现黑色点状，此后软腐死亡(陈健，高祖紃，余红等.斜脉蝠蛾“黑点病”的病原及防治的初步研究[j].微生物学通报，1991，18(6)：323-325)。寄主蝠蛾幼虫人工饲养过程中粉状拟青霉病更为严重，是幼虫人工饲养过程中对幼虫具有毁灭性的一种病害(曾纬，陈仕江.冬虫夏草寄主昆虫拟青霉病研究[j].中国中药杂志，2001，26(7)：455-456)。“历时3年对数批次万余头人工饲养条件下的蝠蛾幼虫进行调查，发现真菌性病害死虫最为严重，占97％以上，其中又以绿僵菌最严重。对378头3-5龄幼虫进行饲养观察，3个月总共死去375头，绿僵病死虫平均占61.3％”。采用卵消毒，器材消毒，基质消毒，饲料消毒，饲养场地消毒，人流物流通道等综合消毒措施防治(曾纬，刘飞，张德利.冬虫夏草寄主蝠蛾的绿僵病及其防治方法[j].中国食用菌杂志，2012，31(6)：52-53)。以上研究提出的卵消毒，饲料消毒，操作工具消毒，饲养基质灭菌，养虫空间消毒等措施尽管有一定效果，但仍然无法切断细菌和虫生真菌的初次和再次侵染源，无法阻断由空气传播与接触传染的细菌和虫生真菌孢子侵染，无法阻断其在草甸土壤的饲养基质中的生长和繁殖，因而继续反复感染寄主幼虫。

技术实现要素：

为解决低海拔人工饲养冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫高发病率，成活率低的根本性问题，本发明提供一种以无机矿物质蛭石代替草甸土壤作为饲养基质人工饲养冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫的方法。

本发明研究发现，粉拟青霉(paecilomycesfarinosus)、绿僵菌(metarrhiziumanisopliae(metsch.)sorokin)等虫生真菌、以及细菌等病原物无法在无机物蛭石的饲养基质中生长，从而可以彻底隔断病原物的侵染源，病原物无法感染栖息于饲养基质中寄主幼虫，大幅度提高幼虫的成活率。

蛭石是一种天然无机矿物质，ph值7-8，无味，无毒副作用，在高温作用下会膨胀，属于硅酸盐。其含有fe、k、ca、以及微量元素mn、cu、zn等，富含n、p、k、及硅酸盐等成分。蛭石一般不会携带病原物，病原物也难以在蛭石上存活。对市售蛭石进行菌检表明，未发现任何细菌和霉菌。

基于以上研究，本发明提供一种以蛭石为饲养基质人工饲养冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫的方法。

进一步地，以三级细度即粒径2-4mm的蛭石为佳。

进一步地，控制饲养基质蛭石含水量以50-100％为佳。本发明所述饲养基质蛭石含水量是指水或消毒液与蛭石干重的重量比。

所用基质蛭石一般需要消毒后使用。优选的消毒剂是0.2％二氯异氰尿酸钠溶液。将0.2％二氯异氰尿酸钠溶液与蛭石按适当比例拌合(例如重量比为0.5-1:1)，即能充分消毒，还可控制饲养基质蛭石含水量。

进一步地，可以胡萝卜或珠芽蓼为饲料。胡萝卜可为蝠蛾幼虫提供充足的营养，利于幼虫生长。胡萝卜长期在保湿的蛭石内不会腐烂，会抽生叶子并生长，可以修剪过长的叶子，胡萝卜嫩叶也是幼虫的良好食料。

一般地，可在孵化前一周把蝠蛾卵置于饲养基质蛭石上进行孵化。

可采用本领域常规方法获取以及孵化蝠蛾卵。例如，在蝠蛾成虫交尾产卵后，用0.1％二氯异氰尿酸钠溶液对卵进行消毒(1分钟左右)，将消毒后的卵放置于有湿润滤纸的培养皿中，在15-16℃的条件下养护，并保湿；在15-16℃条件下卵期一般为30-35天；孵化前一周把卵放入饲养基质蛭石上进行孵化。

本发明方法特别适用于饲养小金蝠蛾hepialusxiaojinensis。

一般地，可在养虫盒等适当的养虫容器中进行饲养。养虫容器需要消毒，用0.2％二氯异氰尿酸钠溶液消毒1分钟左右即可。养虫容器可设有孔洞，方便与外界空气流通。多个养虫容器可以叠加放置，相互之间基本密合无缝隙。养虫容器四面可设置卡槽，以方便叠加堆放。放入养虫容器(养虫盒)的蛭石厚度为2-3cm为宜。

养虫容器可选用食用级的塑料周转箱，尺寸规格可根据养虫车间各养虫室大小及方便操作而定。为充分利用空间，多个养虫容器可以叠加堆放，相互之间基本密合无缝隙，叠加高度根据操作方便程度决定。叠加的每堆养虫盒顶端再放一空养虫盒，使有幼虫的养虫盒不暴露于空间而蒸发失水。在本发明一具体实施方式中，使用400mm×300mm×160mm的食品级的塑料盒为养虫盒。

在养虫容器底部放置一层2-3cm厚的蛭石，蛭石上放饲料胡萝卜，胡萝卜间放有1-2cm宽、长度与胡萝卜等长的湿润滤纸，滤纸上放置经消毒的待孵化的小金蝠蛾卵；胡萝卜上方再放置一层2-3cm厚的蛭石，蛭石上再放置湿润的滤纸，用以保湿。滤纸上可喷雾0.2％的二氯异氰尿酸钠消毒液，既可消毒又可保湿。

进一步地，饲养环境温度为8-16℃，优选11-15℃。

进一步地，饲养环境相对湿度为55-80％，优选60-70％。

进一步地，饲养环境照度(光照强度)为200-300lx。

调节仿生态养虫车间环境以满足以上温度、湿度及光照等条件要求。

养虫车间为仿生态人工气候室。仿生态人工气候室的洁净度达到国家药品监督管理局规定制药厂gmpd级标准，操作按gmpd级规范执行。温度11-15℃，相对湿度60-70％，照度200-300lx，养虫室内及周围无气体污染源。经150天的饲养，幼虫达到5-6龄、长约4.0cm即可供侵染。饲养期间不翻动饲养基质和饲料，定期补水以维持蛭石的含水量。卵孵化后经150天左右的生长发育，幼虫在饲养基质内建立隧道，在胡萝卜上取食。以胡萝卜作饲料比用天然饲料珠芽蓼生长快，个体重，到每年12月份即可提供感染中国被毛孢的寄主幼虫。

具体地，上述人工饲养冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫的方法包括：收集小金蝠蛾hepialusxiaojinensis卵，用0.1％二氯异氰尿酸钠溶液消毒，然后放置于有湿润滤纸的培养皿中，在15-16℃的条件下养护，保湿；孵化前一周把卵放入仿生态养虫车间内的养虫盒中进行孵化；养虫盒底部放置一层2-3cm厚的蛭石，蛭石上放胡萝卜，胡萝卜间放有1-2cm宽、长度与胡萝卜等长的湿润滤纸，滤纸上放置经消毒的待孵化小金蝠蛾卵；胡萝卜上方再放置一层2-3cm厚的蛭石，蛭石上再放置湿润的滤纸，用以保湿；养虫车间内温度11-15℃，相对湿度60-70％，照度为200-300lx。

本发明提供了以蛭石为饲养基质的人工饲养冬虫夏草寄主幼虫防治病害新方法。粉拟青霉(paecilomycesfarinosus)、绿僵菌(metarrhiziumanisopliae(metsch.)sorokin)等虫生真菌、以及细菌均是冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫具毁灭性的病原物。以上病原物均能在冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫生长的低温条件下和饲养基质的草甸土壤中生长、繁殖危害寄主蝠蛾幼虫。通过提高养虫室的洁净度，定期喷洒杀菌药剂，紫外线照射，以至臭氧等措施都无法控制粉拟青霉等真菌性病害和细菌性病害的发生和发展。本发明经长期试验和反复实践，在整个寄主幼虫生长阶段均采用无机矿物质蛭石作为饲养基质，上述虫生真菌及细菌等病原物无法在无机的蛭石中生长和繁殖，有效地阻断了上述病原菌的侵染源，从而避免病害的发生。本发明方法能够有效的防治病害，大幅度提高寄主蝠蛾幼虫饲养效率，为规模化人工培育冬虫夏草生产提供虫源奠定坚实基础。

附图说明

图1表示蛭石为饲养基质中幼虫的生长与发育情况。

图2为以蛭石为饲养基质饲养150天的幼虫。

图3表示粉拟青霉在土壤底部侵染寄主蝠蛾幼虫并致幼虫僵死。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

以下所用蛭石粒径是2-4mm。细度2-4mm的蛭石的叶片较小，薄片有些弹性，表面凹凸不平。颜色为暗棕色，有玻璃光泽。

以下养虫车间中各养虫室的要求及操作规程：养虫车间各养虫室为仿生态人工气候室。仿生态人工气候室的洁净度达到国家药品监督管理局规定制药厂gmpd级，新风次数、菌检标准，操作规程等均按gmpd级规范操作。温度11-15℃，相对湿度60-70％，照度200-300lx，养虫室内及养虫车间周围均无空气污染源。操作人员的一切操作均按国家药品监督管理局规定的gmpd级的操作规范操作。

以下所用寄主蝠蛾为小金蝠蛾hepialusxiaojinensis幼虫。

实施例1以蛭石作为饲养基质人工饲养蝠蛾幼虫的方法

收集蝠蛾成虫交尾后产的卵，用0.1％二氯异氰尿酸钠消毒1分钟后置垫有湿润滤纸(滤纸上无明水)的培养皿中，在15-16℃环境中进行保湿养护。15℃下卵期35天左右。在孵化前一周把卵放入盛有饲养基质的养虫盒内饲养，所选用的养虫盒为300mm×400mm×160mm。盒内养虫基质蛭石厚度2cm，蛭石的含水量为100％(即将1000克蛭石与1000ml的0.2％二氯异氰尿酸钠溶液拌合)。蛭石上放饲料胡萝卜，养虫盒内放5-6条胡萝卜，若放5条胡萝卜则在萝卜间隙中放4条宽约1cm、与胡萝卜等长的条形滤纸条，每个条形滤纸上放卵50粒左右，即每盒放卵200粒左右。将养虫盒放于养虫车间的各养虫室中。

卵孵化后幼虫在饲养基质内建立隧道，在胡萝卜上取食，见图1。饲养期间不翻动饲养基质和饲料，定期补水以维持蛭石的含水量。经150天左右的生长发育，幼虫达到5-6龄、长约4.0cm，见图2。

实施例2

与实施例1的区别仅在于，以珠芽蓼替换胡萝卜作为蝠蛾幼虫天然饲料。结果表明，以胡萝卜作饲料比用天然饲料珠芽蓼生长快，个体重。

实验例1冬虫夏草寄主蝠蛾的鉴别

实施例1中，以蛭石为基质的寄主蝠蛾幼虫饲养到12月份中下旬，幼虫开始化蛹，经30多天蛹期就羽化，取蛹和成虫进行物种鉴定，使用仪器为：pcr仪s1000tmthemalcycler；采用sanger测序3730×i测序仪；使用mega7.0，iq-tree，ncbi，boldsystems分析。

根据ncbi，boldsystems数据库比对结果，从线粒体coi基因序列和线粒体cytb基因序列鉴定表明，成虫样品与小金蝠蛾hepialusxiaojinensistu，maetzhang2009的相似度为99％，可以确定为小金蝠蛾hepialusxiaojinensis。蛹样品根据ncbi，boldsystems数据库比对结果可知，与小金蝠蛾hepialusxiaojinensistumaetzhang2009的相似度为99％，根据蛹和成虫样品dna比对可以确定为冬虫夏草优势寄主小金蝠蛾hepialusxiaojinensis。

实验例2不同饲养基质对幼虫的存活率和增重率的影响

分别采用谷壳、谷壳+蛭石、草甸土为饲养基质，按与实施例1相同的方法饲养蝠蛾幼虫，研究基质对幼虫的存活率和增重率的影响。结果见下表1。

表1不同基质饲养幼虫的存活率和增重率

试验结果表明，与以谷壳、谷壳+蛭石、草甸土的饲养基质相比，以蛭石为饲养基质的幼虫不受到侵染，正常的取食和生长发育，存活率最高，增重率也最大。其中，发现草甸土饲养基质中，粉拟青霉在土壤底部侵染寄主蝠蛾幼虫并致幼虫僵死，见图3。

实验例3不同蛭石含水量对幼虫的存活率和增重率的影响

分别采用不同含水量的蛭石为饲养基质，按与实施例1相同的方法饲养蝠蛾幼虫，研究基质含水量对幼虫的存活率和增重率的影响。结果见下表2。(具体通过调节0.2％二氯异氰尿酸钠溶液与蛭石的干重比控制蛭石含水量。)

表2不同含水量蛭石饲养幼虫的存活率和增重率

蛭石吸水性很强。试验结果表明，蛭石的含水量要适当，含水量过高对幼虫生长不利，特别对低龄幼虫(1-3龄)影响较大。作为饲养基质的蛭石含水量以50-100％最适宜。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。