本发明涉及基因鉴定方法，具体涉及筛选及鉴定肥胖基因的方法。
背景技术：
到目前为止，大约40％的人类基因，其功能未知。在模式生物上，通过全基因组功能性筛选的方法，可以发现新的人类“疾病”基因。肥胖是导致糖尿病和心血管疾病的主要原因，对人的健康造成了极大的危害。我国的肥胖人口已超过1400万，且肥胖的病人在逐年增加。研究表明遗传因素在肥胖的过程中起着重要作用，但是目前只有极少数基因如fto已被证实与肥胖相关。通过大数据bmigwas及肥胖病人的基因组测序，已经鉴定了数百个与肥胖相关的基因，但目前缺乏方法对此类基因进行快速的功能验证，急需新的方法来证实以及挖掘新肥胖基因。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种筛选及鉴定肥胖基因的方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一筛选及鉴定肥胖基因的方法，包括以下步骤：
(1)构建候选肥胖基因uas-rnai果蝇株；
(2)未交配的雌性gal4果蝇株与候选肥胖基因uas-rnai果蝇株交配产卵，孵化获得新果蝇；
(3)收集雄性新果蝇并定期对其进行检测体重、摄食及甘油三脂的含量，观察候选肥胖基因是否与体重、摄食及甘油三脂分别相关，若不相关将该候选肥胖基因排除，若相关进行下一步；
(4)建立候选肥胖基因敲除果蝇株，鉴定所述候选肥胖基因是否与肥胖相关，若不相关将该候选肥胖基因排除，若相关则判断为肥胖基因。
本发明所述步骤(1)中的候选肥胖基因来源于：1)人身高体重指数(bmi)相关性的基因；2)极端肥胖病人的外显子测序所鉴定的基因；3)减肥中与体重下降有关的基因。具体包括以下基因：
1.全基因测序遗传性肥胖病人的全基因组，包括整个机体系统，大脑系统，肌肉组织，肝脏组织及脂肪组织的基因；
2.giantbmi全基因组关联分析找出的p<10-5的基因位点，分析该位点的上下游10k距离内的基因。
所述步骤(2)中的gal4果蝇株根据不同组织的基因选择，具体地，整个机体系统使用act-gal4，大脑系统使用nsyb-gal4，肌肉系统使用mef2-gal4，肝脏系统使用oneo-gal4，脂肪组织使用ppl-gal4。
所述步骤(4)通过建立候选肥胖基因敲除果蝇株，评估候选肥胖基因在缺失的情况下对体重、食物摄取、能量消耗如身体活动、等代谢指标影响，以及对葡萄糖耐量和胰岛素耐量的影响，从而鉴定候选肥胖基因是否为肥胖基因。
本发明具有如下有益效果：
1.本发明用于新肥胖基因的筛选及鉴定工作，而且可从全基因组的层面上挖掘新肥胖基因。
2.本发明可大大加速鉴定肥胖遗传基因。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
候选肥胖基因来源于：1)人身高体重指数(bmi)相关性的基因；2)极端肥胖病人的外显子测序所鉴定的基因；3)减肥中与体重下降有关的基因。具体包括：
1.全基因测序遗传性肥胖病人的全基因组，包括整个机体系统，大脑系统，肌肉组织，肝脏组织及脂肪组织的基因；
2.giantbmi全基因组关联分析找出的p<10-5的基因位点，分析该位点的上下游10k距离内的基因。
一、利用果蝇组织特异性rnai沉默筛选及鉴定候选肥胖基因
利用果蝇组织特异性rnai沉默的方法，分别在整个机体系统，大脑系统，肌肉组织，肝脏组织及脂肪组织中沉默候选肥胖基因，主要利用gal4/uas系统，采用rnai沉默的方法来鉴定肥胖药物靶点基因，同时检测体重，摄食，甘油三脂。
本实施例使用如下果蝇工程株：整个机体系统使用act-gal4，大脑系统使用nsyb-gal4，肌肉系统使用mef2-gal4，肝脏系统使用oneo-gal4，脂肪组织使用ppl-gal4可以从美国布卢明顿果蝇中心库(bloomingtondrosophilastockcenter)购买。候选肥胖基因uas-rnai果蝇株主要由奥地利维也纳果蝇资源中心(viennadrosophilaresourcecentre)购买。
具体方法如下：
(1)从维也纳果蝇资源中心(viennadrosophilaresourcecentre)购买候选肥胖基因uas-rnai果蝇株；
(2)繁殖gal4果蝇株，收集未交配的雌性gal4果蝇株。未交配的雌性gal4果蝇株与雄性候选肥胖基因uas-rnai果蝇株交配24小时，然后放入大的果蝇培养瓶中产卵48小时，最后取出交配后的雌雄果蝇，10天后，收集新孵化出来果蝇放入新的培养瓶中。
(3)设置对照组，繁殖gal4果蝇株，收集未交配的雌性gal4果蝇株。未交配的雌性gal4果蝇株与雄性野生型果蝇株交配24小时，然后放入大的果蝇培养瓶中产卵48小时，最后取出交配后的雌雄果蝇，10天后，收集新孵化出来果蝇放入新的培养瓶中。
(4)4天后，收集对照组和单个候选基因的uas-rnai组雄性果蝇并定期检测体重、摄食及甘油三脂的含量。观察候选肥胖基因是否与体重、摄食及甘油三脂相关，若不相关将该候选肥胖基因排除，若相关做进一步鉴定。
①体重测量：果蝇体重测量由精度为0.1mg的分析天平来完成，每个样品包含10个雄性果蝇，共5个样品。
②摄食测量：摄取主要由改进的
③甘油三脂含量检测：每个样品由10个果蝇组成，放入ep管中，然后加入200ul冷冻pbst(pbs+0.05％tween20),用研磨机研磨果蝇后，在加入800ul冷冻pbst搅拌均匀后，取50ul混合液到96孔板，然后加入350ul甘油三脂反应液，30分钟后，用分光光度计检测505nm吸光值，最后计算出甘油三脂的含量。
分别计算体重，摄食及甘油三脂的含量的z值，其方法如下：(vi-vcontrol)/sdcontrol，vi为候选肥胖基因uas-rnai的值，vcontrol：为对照组的值，sdcontrol：为对照组的方差。如果z>1.96或者，z<-1.96，重复步骤①至③四次，直到四次的z值的平均值z>1.96或者，z<-1.96。
根据检测的结果，筛选出与体重、摄食和甘油三脂分别有关的候选肥胖基因，z的绝对值大于1.96时认为与与体重、摄食和甘油三脂有关。
(4)从美国bloomingtondrosophilastockcenter购买候选基因敲除果蝇株，使用步骤(3)的方法通过基因敲除果蝇株评估候选肥胖基因在神经组织特异性缺失的情况下对体重、摄食和甘油三脂的影响，从而鉴定所述候选肥胖基因是否是肥胖基因。