一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法与流程

本发明涉及组织培养技术领域，更具体地说是涉及一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法。

背景技术：

罗汉果是葫芦科多年生藤本植物。罗汉果果实中主要甜味成分是罗汉果甜苷v，它的甜度是蔗糖的300倍，其甜度曲线与蔗糖相似，因为高甜度、低热量、好口感等特点而广为大众喜爱。它是肥胖症、高血压、糖尿病患者等特殊人群最适宜的甜味剂和保健品，具有广泛的应用价值。

罗汉果甜苷v主要从天然罗汉果果实中提取获得。但是，天然罗汉果中的固有罗汉果甜苷成分极低，现有技术对于罗汉果的利用率以及罗汉果甜苷的提取率并不高，造成了极大的原料浪费。同时，由于土地资源、气候等自然因素的影响，天然罗汉果的产量受到限制，已不能满足日益增长的市场需求。目前，罗汉果的培育大多采取组织培养的方法，将稳定愈伤组织进行培养，但是稳定级愈伤组织材料生长缓慢，制备悬浮培养的接种细胞工作量大，悬浮培养时细胞生长量少、悬浮周期长、效率低，使得罗汉果的产量依然不能满足市场需求。

因此，如何提供一种生长快速、培育周期短的罗汉果胚性愈伤组织是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，在稳定愈伤组织的基础上进行诱导和继代培养，缩短了愈伤组织的生长延滞期，缩短了悬浮培养周期，提高了罗汉果幼苗的生长量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，包括下述步骤：

1)稳定愈伤组织的制备：对罗汉果的种子、叶片或茎段进行诱导，获得稳定愈伤组织；

2)新生愈伤组织的制备：将所述步骤1)中所得的稳定愈伤组织培养70-80天，取其褐化的细胞团接种至诱导培养基中进行继代培养，获得新生愈伤组织；

3)可悬浮胚性愈伤组织的制备：选择所述步骤2)中生长快速、黄白色的新生愈伤组织继代至新的培养基中进行继代培养，获得可悬浮新生愈伤组织。

以上技术方案达到的技术效果是：本发明公开一种获得罗汉果可悬浮培养快速生长的胚性愈伤组织的方法。所得的新生愈伤组织对比初级愈伤组织生长快速，大量的悬浮细胞接种材料易制备，培养周期由21天缩减至15天，且生长延滞期短，生长量也有大幅提升。在少量接种量时也可以生长良好。同样的接种量50g/l(鲜重)时，培养一周期后，初级愈伤细胞的细胞干重为6.73g/l，新生愈伤细胞干重可达15.77g/l。同时经诱导剂作用后罗汉果甜苷v产率与初级愈伤组织相当。

可选的，所述步骤1)中诱导的具体过程包括：(1)初级愈伤组织的制备：将所述罗汉果种子、叶片或茎段消毒后，接入ph为5-7的初级诱导培养基中，在温度为20-30℃且无光照的条件下诱导培养15-21天，得到初级愈伤组织；(2)稳定愈伤组织的制备：将所述步骤(1)中获得的初级愈伤组织进行继代培养，获得性状稳定的愈伤组织。

可选的，所述步骤2)中诱导培养基包括：含有胆碱0.5-2.0g/l、维生素c0.5-3.0mg/l、蔗糖25-35g/l、琼脂4-5g/l、肌醇80-120mg/l、6-ba0.5-2mg/l及naa0.5-1.5mg/l的b5固体培养基。

以上技术方案达到的技术效果是：胆碱是带正电荷的四价碱基，对植物生长、产量、产品质量、光合性能、膜透性、植物抗性等重要生理作用都有有利影响。对植物供以胆碱，可以提高其耐霜冻能力，并降低膜相变温度。同时，胆碱不仅为膜脂成分提供胆碱基团，而且像植物激素那样对植物具有多样生物学效应，需要在一定的有效浓度范围(0.5-2.0g/l)才能发挥其最佳调控作用；维生素c是一种抗氧化剂，能帮助植物抵抗干旱、臭氧和紫外线带来的压力，同时，维生素c作为一种活性比较高的物质，可以对植物的调节作用起到一定的帮助，在植物于逆境中和衰老的过程中，维生素c可以帮助植物起到保护和延缓的作用。

可选的，所述步骤3)中继代培养的条件为：温度为25-30℃、光强为4000lux、光照时间为12h/d。

可选的，所述初级诱导培养基由b5基础盐水溶液培养基、蔗糖25-35g/l、琼脂4-5g/l、肌醇80-120mg/l、6-ba0.5-2mg/l及naa0.5-1.5mg/l组成

可选的，所述b5基础盐水溶液培养基由kno32500mg/l、mgso4·7h2o250mg/l、cacl2·2h2o150mg/l、(nh4)2so4134mg/l、nah2po4.h2o150mg/l、ki0.75mg/l、h3bo33.0mg/l、mnso4·4h2o10mg/l、znso4·7h2o2.0mg/l、na2moo4·2h2o0.25mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、na2-edta37.3mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l、烟酸1.0mg/l、盐酸吡哆醇1.0mg/l及盐酸硫铵素10mg/l组成

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种可快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，达到的技术效果是：

1)在初级愈伤组织的基础上，继续对其进行诱导，所得的可悬浮胚性愈伤组织对比初级愈伤组织生长快速，大量的悬浮细胞接种材料易制备，培养周期由21天缩减至15天，且生长延滞期短，生长量也有大幅提升。

2)在少量接种量时也可以生长良好。同样的接种量50g/l(鲜重)时，培养一周期后，原愈伤细胞的细胞干重为6.73g/l，新生愈伤细胞细胞干重可达15.77g/l。

3)在诱导培养基中加入了胆碱和维生素c，提高了植物的抗逆能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例3经种子诱导获得的稳定愈伤组织示意图；

图2附图为本发明实施例3稳定愈伤组织褐化细胞团的示意图；

图3附图为本发明实施例3新生愈伤组织的示意图；

图4附图为本发明实施例3可悬浮胚性愈伤组织的示意图；

图5附图为本发明实施例4可悬浮胚性愈伤组织的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例用于判断胆碱和维生素c的最佳浓度配比，具体公开了一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，包括下述步骤：

1)初级愈伤组织的制备：将所述罗汉果种子消毒后，接入ph为6、由ms基础盐水溶液培养基、蔗糖30g/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0mg/l及naa0.5mg/l组成的诱导培养基中，在温度为27℃且无光照的条件下诱导培养15天，即得到初级愈伤组织；

2)稳定愈伤组织的制备：将所述步骤1)中获得的初级愈伤组织进行继代培养，获得性状稳定的愈伤组织；

3)新生愈伤组织的制备：将所述步骤2)中所得的稳定愈伤组织培养75天，取其褐化的细胞团接种至分别含有a.胆碱0g/l、维生素c0mg/l；b.胆碱0.5g/l、维生素c0mg/l；c.胆碱1g/l、维生素c0mg/l；d.胆碱2g/l、维生素c0mg/l；e.胆碱0g/l、维生素c0.5mg/l；f.胆碱0.5g/l、维生素c0.5mg/l；g.胆碱1g/l、维生素c0.5mg/l；h.胆碱2g/l、维生素c0.5mg/l；i胆碱0g/l、维生素c1mg/l；j.胆碱0.5g/l、维生素c1mg/l；k.胆碱1g/l、维生素c1mg/l；l.胆碱2g/l、维生素c1mg/l；m.胆碱0g/l、维生素c2mg/l；n.胆碱0.5g/l、维生素c2mg/l；o.胆碱1g/l、维生素c2mg/l；p.胆碱2g/l、维生素c.2mg/l；q.胆碱0g/l、维生素c3mg/l；r.胆碱0.5g/l、维生素c3mg/l；s.胆碱1g/l、维生素c3mg/l；t.胆碱2g/l、维生素c.3mg/l；其它组分含量均为蔗糖30g/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0mg/lnaa0.5mg/l的b5固体培养基中进行继代培养，获得新生愈伤组织。

4)可悬浮胚性愈伤组织的制备：选择所述步骤3)中生长快速、黄白色的新生愈伤组织继代至新的培养基中，在温度为27℃、光强为4000lux、光照时间为12h/d的条件下进行继代培养，获得可悬浮新生愈伤组织。

得到的新生愈伤组织及可悬浮胚性组织的诱导率见表一：

新生愈伤细胞诱导率＝新生愈伤细胞团数/褐化愈伤细胞团数×100％

可悬浮胚性愈伤细胞诱导率＝可悬浮胚性愈伤细胞团数/新生愈伤细胞团数×100％

表一

实施例2

本实施例用于比较分别由种子、叶片和茎段诱导得到的稳定愈伤组织进行悬浮培养与本发明技术方案得到的可悬浮胚性愈伤组织进行悬浮培养取得的技术效果差异，具体步骤如下：

1)分别将罗汉果种子、叶片和茎段消毒，并对种子去壳，取种胚；分别将种胚、消毒的叶片及消毒的茎段接入ph值为6的诱导培养基中，在温度为20-30℃且无光照的条件下诱导培养15天，即得到初级愈伤组织，其中，诱导培养基由ms基础盐水溶液培养基、蔗糖30g/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0mg/l、naa1mg/l组成。

2)取步骤1)中获得的三种初级愈伤组织，在含有蔗糖30g/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0/l、naa0.5mg/l、ph为6.0的b5固体培养基上继代培养，选取连续继代4次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的三种稳定愈伤组织。

3)取步骤2)中得到的三种稳定愈伤组织分别培养75天并接种至含有维生素c0.5mg/l、胆碱1g/l、蔗糖30/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0mg/l、naa0.5mg/l、ph为6的b5固体培养基上继代培养。

4)分别选择步骤3)中三个培养基中第6-10天的生长快速、黄白色的新生愈伤组织继代至新的培养基(同步骤1中的培养基)中，连续传代4次，获得质地松散，生长旺盛且稳定的淡黄色可悬浮胚性愈伤织。

5)将步骤2)和步骤4)中得到的稳定愈伤组织和可悬浮胚性愈伤组织分别以接种量50g/l转接到2组含有蔗糖30g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0/l、naa0.5mg/l、ph范围为5.5-6.0的液体培养基中，并在转速为150r/min、培养温度为27℃、光强为4000lux、光照时间为12h/d的摇床中培养，得到4种初代罗汉果悬浮细胞体系。

6)以步骤5)所得4种初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞，在培养过程中第6天加入茉莉酸甲酯120μmol/l。

7)在培养第0-24天，每隔一天抽取罗汉果悬浮细胞，将罗汉果悬浮细胞转移至含有8μm滤膜的抽滤瓶中进行抽滤，期间用无菌水冲洗细胞三次，抽滤至滤纸不再滴水为止。此时的重量为愈伤组织的鲜重(fcw)；将抽滤后的细胞至于60℃烘箱中烘至恒重，此时的重量为愈伤组织的干重(dcw)，干重含量具体见表二：

表二

由表二可以看出由茎段、叶片、种子诱导得到的稳定愈伤组织在悬浮培养时，第21天细胞量达到最大；可悬浮胚性愈伤组织在第15天细胞干重达到最大，培养时间缩短。并且，可悬浮胚性愈伤组织的生长指数为0.8778g/l.d，比茎段-稳定愈伤组织的0.1849g/l.d、叶片-稳定愈伤组织的0.2270g/l.d、种子-稳定愈伤组织的0.1914g/l·d分别提升了4.7、3.8、4.6倍。

8)称取1g罗汉果干重细胞，以10：1的料液比加入甲醇超声提取1h后，在60℃条件下振荡提取2h，如此反复提取3次后合并提取液在氮吹仪下进行浓缩至1ml。将浓缩液采用0.22μm的滤膜过滤，用高效液相色谱仪进行定性和定量分析。

色谱条件:色谱柱为c18反向柱，4.6mm×250mm；流动相为水-乙睛＝78-22，流速1.0ml/min，检测波长203nm。

不同来源的罗汉果愈伤组织对悬浮培养罗汉果甜苷v合成的影响见表3。

表3

各不同来源的愈伤组织细胞在悬浮培养过程中，未加诱导剂时罗汉果苷v的含量极低。再加入诱导剂后，罗汉果甜苷v的含量明显提升。由表3可以看出新生愈伤组织的罗汉果甜苷v含量可以经诱导剂处理得到明显提升。结合细胞生长情况，由茎段、叶片、种子诱导得到的愈伤悬浮培养周期可以取为21天，新生愈伤细胞悬浮培养周期为15天，其发酵指数分别为0.0864、0.1146、0.1342、0.3445mg/l·d。新生愈伤细胞的发酵指数比茎段、叶片、种子诱导的愈伤组织细胞分别提升4倍、3倍、2.5倍。

实施例3

本实施例公开了一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，包括：

1)初级愈伤组织的制备：将所述罗汉果种子消毒后，接入ph为5、由b5基础盐水溶液培养基、蔗糖30g/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0mg/l及naa0.5mg/l组成的诱导培养基中，在温度为20℃且无光照的条件下诱导培养15天，即得到初级愈伤组织获得初级愈伤组织；

2)稳定愈伤组织的制备：将所述步骤1)中获得的初级愈伤组织进行继代培养，获得性状稳定的愈伤组织，具体结果参见附图1；

3)新生愈伤组织的制备：将所述步骤2)中所得的稳定愈伤组织培养75天，取其褐化的细胞团(参见附图2)接种至分别含有胆碱0.5g/l、维生素c1.0mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0mg/l、naa0.5mg/l的b5固体培养基中进行继代培养，获得新生愈伤组织；参见附图3。

4)可悬浮胚性愈伤组织的制备：选择所述步骤3)中生长快速、黄白色的新生愈伤组织继代至新的培养基中，在温度为25℃、光强为4000lux、光照时间为12h/d的条件下进行继代培养，获得可悬浮胚性愈伤组织，参见图4。

实施例4

本实施例公开了一种快速生长的罗汉果胚性愈伤组织的制备方法，包括：

1)初级愈伤组织的制备：将所述罗汉果种子消毒后，接入ph为5.5、由b5基础盐水溶液培养基、蔗糖30g/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0mg/l及naa0.5mg/l组成的诱导培养基中，在温度为30℃且无光照的条件下诱导培养15天，即得到初级愈伤组织获得初级愈伤组织；

2)稳定愈伤组织的制备：将所述步骤1)中获得的初级愈伤组织进行继代培养，获得性状稳定的愈伤组织；

3)新生愈伤组织的制备：将所述步骤2)中所得的稳定愈伤组织培养75天，取其褐化的细胞团接种至分别含有胆碱0.5g/l、维生素c1.0mg/l、蔗糖30g/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0mg/lnaa、0.5mg/l的b5固体培养基中进行继代培养，获得新生愈伤组织；

4)可悬浮胚性愈伤组织的制备：选择所述步骤3)中生长快速、黄白色的新生愈伤组织继代至新的培养基中，在温度为30℃、光强为4000lux、光照时间为12h/d的条件下进行继代培养，获得可悬浮胚性愈伤组织，参见附图5。

实施例5

本实施例用于比较分别由种子、叶片和茎段诱导得到的稳定愈伤组织培养15-20天未褐化的新鲜愈伤组织与培养70-80天的褐化愈伤组织的诱导效果比较。本发明技术方案得到的可悬浮胚性愈伤组织进行悬浮培养取得的技术效果差异，具体步骤如下：

1)分别将罗汉果种子、叶片和茎段消毒，并对种子去壳，取种胚；分别将种胚、消毒的叶片及消毒的茎段接入ph值为6的诱导培养基中，在温度为20-30℃且无光照的条件下诱导培养15天，即得到初级愈伤组织，其中，诱导培养基由b5基础盐水溶液培养基、蔗糖30g/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0mg/l、naa1mg/l组成。

2)取步骤1)中获得的三种初级愈伤组织，在含有蔗糖30g/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0/l、naa0.5mg/l、ph为6.0的b5固体培养基上继代培养，选取连续继代4次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的三种稳定愈伤组织。

3)取步骤2)中得到的三种稳定愈伤组织分别培养75天并接种至含有维生素c0.5mg/l、胆碱1g/l、蔗糖30/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0mg/l、naa0.5mg/l、ph为6的b5固体培养基上继代培养。

4)分别选择步骤3)中三个培养基中第6-10天的生长快速、黄白色的新生愈伤组织继代至新的培养基(同步骤1中的培养基)中，连续传代4次，获得质地松散，生长旺盛且稳定的淡黄色可悬浮胚性愈伤组织。

5)取步骤2)中得到的三种稳定愈伤组织分别培养15天并接种至含有维生素c0.5mg/l、胆碱1g/l、蔗糖30/l、琼脂4.6g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0mg/l、naa0.5mg/l、ph为6的b5固体培养基上继代培养。

6)分别选择步骤5)中三个培养基中第6-10天的新鲜愈伤组织继代至新的培养基(同步骤1中的培养基)中，连续传代4次，获得质地松散，生长旺盛且稳定的淡黄色可悬浮胚性愈伤织。

7)将步骤2)、步骤4)和步骤6)中得到的稳定愈伤组织和可悬浮胚性愈伤组织分别以接种量50g/l转接到2个含有蔗糖30g/l、肌醇100mg/l、6-ba1.0/l、naa0.5mg/l、ph范围为5.5-6.0的b5液体培养基中，并在转速为150r/min、培养温度为27℃、光强为4000lux、光照时间为12h/d的摇床中培养，得到4种初代罗汉果悬浮细胞体系。培养24天测其干重、苷v的含量见表4。

表4

由此可知，新的诱导培养基仅对培养至褐化的愈伤组织有显著的诱导作用，而对新鲜的愈伤组织的生长及苷v的合成没有明显提升作用。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。