本发明涉及组织培养
技术领域：
，特别涉及一种紫花槭组织培养的培养基及方法。
背景技术：
：近年来，随着我国经济高速发展及人民生活水平的不断提高，城镇园林绿化要求也在不断提升，对各种优良树种的需求也迅速增加，多树种、多色彩、季相变化明显已成为当今园林发展的主旋律，但由于北方地区受气候的限制，可供选择的绿化材料相对较少，因而对新型绿化树种的需求越来越迫切。槭树是世界上著名的彩叶树种，世界共有200多种，我国有160余种，主产长江流域及其以南的各省区。我国东北地区原产近10种，但大部分处于野生状态。紫花槭(acerpseudo-sieboldianum)为槭树科槭属木本彩叶树种，其树姿、叶型、翅果都具有较高的观赏性，是北方园林绿化彩化不可多得的优良观赏树种。目前，紫花槭主要采用种子繁殖，但种子繁殖后代变异大，且受到季节的影响，无法满足现代园林绿化的需求。而组织培养育苗技术不仅可以保持种的纯度和特性，还能够提高繁殖速度和成活率。但木本植物组织培养较为困难，全世界槭树有200多种，我国有160余种，仅有少数几个种建立了较为完善的组织培养再生体系，如赤枫、青榨槭、美洲糖槭、茶条槭、美国红枫、复叶槭。而对于东北地区特有的观赏价值较高的紫花槭，其组培繁殖方法还从未有过报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种紫花槭组织培养的培养基及方法。该培养基配方可显著降低紫花槭外植体的污染率，促进紫花槭的腋芽生长、提高增殖系数及生根率，利用植物组织培养的方法，使具有优良性状的紫花槭得以快速繁殖。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种紫花槭组织培养的培养基，包括启动培养基、增殖培养基和生根培养基；启动培养基为：含有0.05～0.25mg/liba、25～35g/l蔗糖的1/2ms培养基；增殖培养基为：含有0.05～0.20mg/liba、0.5～1.5mg/lcppu、25～35g/l蔗糖的ms培养基；生根培养基为：含有0.10～0.40mg/liba、15～25g/l蔗糖的1/2ms培养基。作为优选，启动培养基为：含有0.05～0.15mg/liba、28～32g/l蔗糖的1/2ms培养基；增殖培养基为：含有0.05～0.15mg/liba、0.8～1.2mg/lcppu、28～32g/l蔗糖的ms培养基；生根培养基为：含有0.15～0.25mg/liba、18～22g/l蔗糖的1/2ms培养基。优选地，启动培养基为：含有0.10mg/liba、30g/l蔗糖的1/2ms培养基；增殖培养基为：含有0.10mg/liba、1.0mg/lcppu、30g/l蔗糖的ms培养基；生根培养基为：含有0.20mg/liba、20g/l蔗糖的1/2ms培养基。本发明还提供了一种紫花槭的组织培养方法，包括如下步骤：取紫花槭当年生枝条，经预处理，得到外植体；将外植体灭菌；将灭菌后的外植体接种到启动培养基进行初代培养；启动培养基为：含有0.05～0.25mg/liba、25～35g/l蔗糖的1/2ms培养基；将初代培养后的腋芽转接到增殖培养基进行增殖培养；增殖培养基为：含有0.05～0.20mg/liba、0.5～1.5mg/lcppu、25～35g/l蔗糖的ms培养基；将增殖培养后的丛生苗转接到生根培养基进行生根培养；生根培养基为：含有0.10～0.40mg/liba、15～25g/l蔗糖的1/2ms培养基。在本发明中，预处理为：去掉当年生枝条的叶片，将枝条分成1.5～2.0cm长的带腋芽茎段，洗净。外植体污染是现在植物组织培养技术上面临的三大难题之一，尤其是木本植物，常因外植体消毒不彻底或者内生菌原因造成污染率高，从而影响木本植物的快速繁殖。本发明通过二次消毒法，使紫花槭的启动培养中污染率从70-80％降至30-40％，提高了获得组培苗的效率，降低了生产成本，节省了工作时间，为进一步获得再生植株提供了有效保障。作为优选，灭菌为：将外植体用次氯酸钠处理20～40min后洗净，密封于灭菌的培养瓶中，在2～8℃条件下放置20～30h；之后采用酒精处理外植体20～40s，然后用氯化汞消毒20～40min，最后用无菌水冲洗。优选地，灭菌为：将外植体用次氯酸钠处理30min后洗净，密封于灭菌的培养瓶中，在4℃条件下放置24h；之后采用酒精处理外植体30s，然后用氯化汞消毒30min，最后用无菌水冲洗。作为优选，次氯酸钠的质量体积百分含量为3％～7％。作为优选，酒精的体积百分含量为60％～80％。作为优选，氯化汞的质量体积百分含量为0.08％～0.12％。优选地，次氯酸钠的质量体积百分含量为5％。优选地，酒精的体积百分含量为70％。优选地，氯化汞的质量体积百分含量为0.1％。作为优选，初代培养的温度为23～25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000lx。作为优选，增殖培养的温度为23～25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000lx。作为优选，生根培养的温度为23～25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000lx。本发明提供了一种紫花槭组织培养的培养基及方法。该培养基包括启动培养基、增殖培养基和生根培养基；启动培养基为：含有0.05～0.25mg/liba、25～35g/l蔗糖的1/2ms培养基；增殖培养基为：含有0.05～0.20mg/liba、0.5～1.5mg/lcppu、25～35g/l蔗糖的ms培养基；生根培养基为：含有0.10～0.40mg/liba、15～25g/l蔗糖的1/2ms培养基。本发明具有的技术效果为：采用本发明提供的培养基配方可显著降低紫花槭外植体的污染率，促进腋芽生长、提高增殖系数及生根率，利用植物组织培养的方法，使具有优良性状的紫花槭得以快速繁殖；本发明首次对紫花槭的取材及消毒方法进行了改进，降低了接种的污染率。具体实施方式本发明公开了一种紫花槭组织培养的培养基及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的紫花槭组织培养的培养基及方法中所用培养基原料或其它试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例11、外植体获得于晴朗上午，取生长健壮、无病虫害的当年生枝条，去掉叶片，将枝条切成1.5～2cm长的带腋芽茎段作为外植体，然后用洗衣粉水浸泡30min后，冲洗干净。2、灭菌将外植体用5％次氯酸钠处理30min，无菌水冲洗干净后，放置于已灭菌的培养瓶中，密封，置于冰箱1d后，取出，在无菌室超净台上用70％酒精处理外植体30s，再用0.1％的hgcl2消毒30min，最后用无菌水冲洗5～6次。3、初代接种将外植体接种到启动培养基(基础培养基+iba0.05～0.20mg/l+蔗糖30g/l)上。培养室温度为(24±1)℃，光照时间12h/d，光照强度为2000lx。期间注意观察，随时剔除污染的材料，以免交叉感染。将带腋芽的外植体接种到添加不同浓度iba的ms培养基或1/2ms培养基上，iba浓度分别为0mg/l、0.05mg/l、0.10mg/l、0.15mg/l、0.20mg/l，接种后，每5天观察记录腋芽生长情况，以下是25d后的生长状况：表1带腋芽的外植体接种后的生长状况结果显示：无论是基本培养基是ms还是1/2ms培养基，当添加不同浓度的iba时，腋芽萌发率和茎长随着iba浓度的增加出现先上升后下降的趋势，当iba浓度为0.10mg/l时，嫩芽萌发率和茎的伸长长度高于其他处理。此外，1/2ms培养基上嫩芽萌发率和茎的伸长长度均略高于ms培养基。因此，1/2ms添加0.10mg/liba是最适合外植体启动培养的培养基。4、增殖培养将伸长的腋芽剪下，转接到增殖培养基(ms+iba0.05～0.2mg/l+cppu0.5～1.5mg/l+蔗糖30g/l)上。培养条件不变。增殖培养基采用ms培养基，iba取0.05mg/l、0.10mg/l、0.20mg/l，naa取0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l，经过20d的培养，增殖系数统计结果如下：表2继代培养20d的增殖情况结果显示：当iba浓度为0.1mg/l、cppu浓度为1.0mg/l时，增殖系数达3.26，显著优于其他处理。5、生根培养将上一步骤中的丛生苗切割成单个，然后接种到生根培养基(基础培养基+iba0.10～0.40mg/l+蔗糖20g/l)进行生根培养。生根培养时，采用ms培养基或1/2ms培养基，iba的浓度分别取0.10mg/l、0.20mg/l、0.30mg/l、0.40mg/l，经过20d的培养观察，试验结果如下：表3生根培养试验结果结果显示：当培养基为1/2ms培养基，iba浓度为0.2mg/l时，植物根根系粗壮，生长良好，生根率为91.4％，明显优于其他处理。实施例21、外植体获得于晴朗上午，取生长健壮、无病虫害的当年生枝条，去掉叶片，将枝条切成1.5～2cm长的带腋芽茎段作为外植体，然后用洗衣粉水浸泡30min后，冲洗干净。2、灭菌将外植体用5％次氯酸钠处理30min，无菌水冲洗干净后，放置于已灭菌的培养瓶中，密封，置于冰箱1d后，取出，在无菌室超净台上用70％酒精处理外植体30s，再用0.1％的hgcl2消毒30min，最后用无菌水冲洗5～6次。3、初代接种将外植体接种到启动培养基上。培养室温度为(24±1)℃，光照时间12h/d，光照强度为2000lx。期间注意观察，随时剔除污染的材料，以免交叉感染。该试验设置试验组、对照组1～4。各组启动培养基配方如下：试验组1：1/2ms+iba0.1mg/l+蔗糖30g/l；对照组1：ms+iaa0.5mg/l(现有技术报道的适于培养鸡爪槭赤枫的配方)；对照组2：wmp+6-ba1.0mg/l+iba0.01mg/l+pvp500mg/l+ga31.0mg/l(现有技术报道的适于培养色木槭的配方)；对照组3：1/2dkw+naa0.1mg/l+iaa0.05mg/l+蔗糖20g/l(现有技术报道的适于培养复叶槭的配方)；对照组4：1/2ms+6-ba0.1mg/l+tdz0.05mg/l+蔗糖10g/l(现有技术报道的适于培养五小叶槭的配方)。外植体接到以上几种培养基中后，每5天观察记录生长情况，以下是25d后的生长状况：表4外植体接种后的生长状况组别萌发率(％)茎长(cm)试验组170.21.65对照组160.31.47对照组234.80.82对照组341.41.06对照组464.51.39结果显示：试验组的萌发率为70.2％，茎长1.65cm，效果显著优于其他各对照组。4、增殖培养将伸长的腋芽剪下，转接到增殖培养基上。培养条件不变。经过20d的培养，观察增殖系数。该试验设置试验组、对照组1～4。各组增殖培养基配方如下：试验组1：ms+iba0.1mg/l+cppu1.0mg/l+蔗糖30g/l；对照组1：ms+iaa0.5mg/l(现有技术报道的适于培养鸡爪槭赤枫的配方)；对照组2：wmp+6-ba0.3mg/l+iba0.05mg/l+pvp500mg/l(现有技术报道的适于培养色木槭的配方)；对照组3：1/2dkw+naa0.1mg/l+iaa0.05mg/l+蔗糖20g/l(现有技术报道的适于培养复叶槭的配方)；对照组4：wpm+6-ba0.1mg/l+cppu0.5mg/l+蔗糖10g/l(现有技术报道的适于培养五小叶槭的配方)。增殖系数统计结果如下：表5继代培养20d的增殖系数组别增殖系数试验组13.26对照组12.75对照组21.96对照组31.89对照组42.34结果显示：试验组的增殖系数为3.26，显著高于其他各对照组。5、生根培养将上一步骤中的丛生苗切割成单个，然后接种到生根培养基进行生根培养。该试验设置试验组、对照组1～4。各组生根培养基配方如下：试验组1：1/2ms+iba0.20mg/l+蔗糖20g/l；对照组1：1/2ms+iaa0.10mg/l+naa0.20mg/l(现有技术报道的适于培养鸡爪槭赤枫的配方)；对照组2：1/2ms+iba3.0mg/l(现有技术报道的适于培养色木槭的配方)；对照组3：1/2dkw+naa0.1mg/l+iaa0.05mg/l+蔗糖20g/l(现有技术报道的适于培养复叶槭的配方)；对照组4：wpm+naa0.5mg/l+蔗糖10g/l(现有技术报道的适于培养五小叶槭的配方)。经过20d的培养观察，试验结果如下：表6生根培养试验结果组别生根率(％)试验组191.4对照组186.3对照组275.6对照组369.4对照组465.3结果显示：试验组的生根率高达91.4％，显著高于其他各对照组。实施例31、外植体获得于晴朗上午，取生长健壮、无病虫害的当年生枝条，去掉叶片，将枝条切成1.5～2cm长的带腋芽茎段作为外植体，然后用洗衣粉水浸泡30min后，冲洗干净。2、灭菌将外植体用5％次氯酸钠处理30min，无菌水冲洗干净后，放置于已灭菌的培养瓶中，密封，置于冰箱1d后，取出，在无菌室超净台上用70％酒精处理外植体30s，再用0.1％的hgcl2消毒30min，最后用无菌水冲洗5～6次。3、初代接种将外植体接种到启动培养基上。培养室温度为(24±1)℃，光照时间12h/d，光照强度为2000lx。期间注意观察，随时剔除污染的材料，以免交叉感染。该试验设置试验组、对照组1～4。各组启动培养基配方如下：试验组1：1/2ms+iba0.1mg/l+蔗糖30g/l；对照组1：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.1mg/l+ac0.5mg/l+pvp100mg/l+蔗糖30g/l(现有技术报道的适于培养茶条槭的配方)；对照组2：1/2wpm+iaa0.3mg/l+iba0.05mg/l+naa0.05mg/l+蔗糖20g/l(现有技术报道的适于培养鸡爪槭橙之梦的配方)；对照组3：1/2ms+iaa0.3mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖30g/l；对照组4：1/2ms+naa0.05mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖30g/l。外植体接到以上几种培养基中后，每5天观察记录生长情况，以下是25d后的生长状况：表7外植体接种后的生长状况组别萌发率(％)茎长(cm)试验组170.21.65对照组168.81.58对照组256.31.47对照组365.71.52对照组466.41.49结果显示：试验组的萌发率为70.2％，茎长1.65cm，效果显著优于其他各对照组，本发明配方省略了iaa或naa等物质，依然能够显著促进外植体的萌发和嫩茎的生长。4、增殖培养将伸长的腋芽剪下，转接到增殖培养基上。培养条件不变。经过20d的培养，观察增殖系数。该试验设置试验组、对照组1～4。各组增殖培养基配方如下：试验组1：ms+iba0.1mg/l+cppu1.0mg/l+蔗糖30g/l；对照组1：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.1mg/l+tdz0.5mg/l+ac0.5mg/l+pvp100mg/l+蔗糖30g/l(现有技术报道的适于培养茶条槭的配方)；对照组2：dkw+tdz0.02mg/l+6-ba0.02mg/l+ac0.7mg/l+蔗糖25g/l(现有技术报道的适于培养红花槭的配方)；对照组3：ms+iba0.1mg/l+cppu1.0mg/l+6-ba0.02mg/l+蔗糖30g/l；对照组4：ms+iba0.1mg/l+cppu1.0mg/l+tdz0.5mg/l+ac0.7mg/l+蔗糖30g/l。增殖系数统计结果如下：表8继代培养20d的增殖系数组别增殖系数试验组13.26对照组12.69对照组22.92对照组33.04对照组43.09结果显示：试验组的增殖系数为3.26，显著高于其他各对照组。本发明配方省略了6-ba或tdz等激素，依然能够显著促进腋芽的增殖。5、生根培养将上一步骤中的丛生苗切割成单个，然后接种到生根培养基进行生根培养。该试验设置试验组、对照组1～4。各组生根培养基配方如下：试验组1：1/2ms+iba0.20mg/l+蔗糖20g/l；对照组1：ms+iba0.5mg/l+ac0.5mg/l+pvp100mg/l+蔗糖30g/l(现有技术报道的适于培养茶条槭的配方)；对照组2：1/2ms+iaa0.10mg/l+naa0.20mg/l(现有技术报道的适于培养鸡爪槭青龙的配方)；对照组3：1/2ms+iba0.20mg/l+ac0.5mg/l+蔗糖20g/l；对照组4：1/2ms+iba0.20mg/l+naa0.20mg/l+蔗糖20g/l。经过20d的培养观察，试验结果如下：表9生根培养试验结果组别生根率(％)试验组191.4对照组186.9对照组280.1对照组384.7对照组487.8结果显示：试验组的生根率高达91.4％，显著高于其他各对照组。本发明配方即使不添加ac、pvp或naa等物质，依然能够显著促进紫花槭幼苗的生根。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12