一种妊娠恒河猴戊型肝炎病毒感染模型的构建方法与流程

本发明涉及一种妊娠恒河猴戊型肝炎病毒感染模型的构建方法。

背景技术：

戊型肝炎病毒(hepatitisevirus，hev)是一种造成急性或慢性戊型肝炎的单股正链rna病毒，其基因组包括3个开放阅读框组成(orf1、orf2和orf3)，全长约为7.3kb。目前已经发现hev存在至少8种基因型，主要经粪口途径传播，也可通过血液传播、接触传播、垂直传播以及器官移植进行传播。

据世界卫生组织统计，全球每年约有2000万人感染hev，造成约7万人死亡。其中孕妇感染hev致死率可高达25％，且常发生胎儿早产，流产，死胎及孕妇产后急性肝衰竭等症状。但是由于缺乏合适的妊娠动物模型，导致造成妊娠期hev感染高死亡率的机制仍不清楚。虽然目前已经在妊娠猪和兔子中建立了hev感染模型，但是由于猪和兔子与人相比同源性较差，不能真实反映妊娠妇女感染hev的临床症状，所以急需建立合适的动物模型来研究妊娠妇女感染hev后高致死率的原因。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种妊娠恒河猴戊型肝炎病毒感染模型的构建方法，成功建立戊型肝炎病毒(hev)妊娠恒河猴动物模型，用于妊娠期间hev感染导致高致死率机理的研究以及抗hev药物筛选和疫苗安全性评价等。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种妊娠恒河猴戊型肝炎病毒感染模型的构建方法，其构建的具体步骤包括：

s1、将hev细胞悬液灌胃接种妊娠恒河猴；

s2、收集妊娠恒河猴粪便和血清，进行hevrna的检测及病毒拷贝的检测；

s3、收集新生恒河猴粪便、血清和组织，进行hevrna的检测及病毒拷贝的检测；

s4、分别分析步骤s3和步骤s4的hevrna的检测结果及病毒拷贝检测的结果。

进一步的，所述hev细胞悬液经real-timeqpcr测定其病毒拷贝数为2.4×10⁴-3.1×10⁵拷贝数/ml。

进一步的，所述hev细胞悬液于液氮中保存备用。

进一步的，所述妊娠恒河猴采用妊娠中晚期恒河猴。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

(1)本发明采用灌胃的方式进行病毒接种，操作简单，可以较好地模拟hev粪口途径传播；

(2)本发明采用恒河猴，与人类具有98％的同源性，妊娠恒河猴接种hev后可以较好的模拟妊娠妇女感染hev后的相关症状；

(3)本发明提供灌胃方式接种hev后，成功导致妊娠恒河猴感染，在粪便和血清中可以检测到hevrna，且具有较高的病毒拷贝；

(4)本研究成功建立妊娠恒河猴hev感染模型，并造成垂直传播，产生不良妊娠，为研究妊娠期妇女感染hev后有较高致死率的致病机理提供了合适的动物模型；

(5)采用本发明的模型构建方法，同样在妊娠balb/c小鼠中成功建立hev感染模型；

(6)本研究成功建立妊娠恒河猴hev感染模型，可进一步用于研究hev感染的致病机制及其抗hev药物筛选和疫苗安全性评价等。

附图说明

下面结合附图说明对本发明作进一步说明。

图1是本发明rt-qpcr检测妊娠恒河猴粪便血清中hev的病毒拷贝示意图。

图2是本发明妊娠恒河猴感染hev后造成垂直传播；其中a图为在新生胎儿粪便中hev的病毒拷贝示意图，b图为在新生胎儿血清中hev的病毒拷贝示意图，c图为在新生胎儿组织中hev病毒拷贝示意图。

图3是本发明rt-qpcr检测妊娠balb/c小鼠粪便血清中hev的病毒拷贝示意图；其中a图为粪便中病毒拷贝示意图，b图为血清中病毒拷贝示意图。

图4是本发明感染妊娠balb/c小鼠后，新生胎儿肝脏免疫组化检测hev抗原示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实施例中主要采用常规的分子生物学方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的；按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本技术权利要求的范围内。

实施例1：妊娠恒河猴成功感染hev

1、将经real-timeqpcr测定其病毒拷贝数为4.6×10⁴拷贝数/ml的细胞悬液提供灌胃的方式接种妊娠恒河猴；

2、收集妊娠恒河猴(1#-3#)粪便和血清进行hevrna的检测及病毒拷贝的检测，结果显示在妊娠恒河猴粪便和血清中成功检测到hevrna，并有较高的病毒拷贝(见图1)，证实hev能够成功感染妊娠恒河猴。

实施例2：妊娠恒河猴成功感染hev，并造成垂直传播

1、将经real-timeqpcr测定其病毒拷贝数为2.1×10⁵拷贝数/ml的细胞悬液提供灌胃的方式接种妊娠恒河猴；

2、收集妊娠恒河猴1#和2#新生胎儿粪便和血清和3#新生胎儿组织进行hevrna的检测及病毒拷贝的检测，结果显示在新生胎儿粪便、血清和组织中有较高的hev病毒拷贝(见图2)，证实hev感染妊娠恒河猴会导致垂直传播。

实施例3：采用上述方法接种妊娠balb/c小鼠，成功建立妊娠balb/c小鼠hev感染模型

1、将经real-timeqpcr测定其病毒拷贝数为6.4×10⁴拷贝数/ml的细胞悬液经灌胃方式接种妊娠balb/c小鼠；

2、收集粪便和血清进行hevrna的检测及病毒拷贝的检测，结果显示在妊娠balb/c小鼠粪便和血清中有较高的hev病毒拷贝(见图3)，证实该发明技术可以成功感染妊娠balb/c小鼠；

3、收集balb/c小鼠新生胎儿肝组织，通过免疫组化在胎肝中检测hev抗原，结果显示在hev感染的妊娠balb/c小鼠肝脏中成功检测到hev抗原(见图4)，证实该发明方法同样造成妊娠balb/c小鼠hev感染，造成垂直传播。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种妊娠恒河猴戊型肝炎病毒感染模型的构建方法，其构建的具体步骤包括：S1、将HEV细胞悬液灌胃接种妊娠恒河猴；S2、收集妊娠恒河猴粪便和血清，进行HEV RNA的检测及病毒拷贝的检测；S3、收集新生恒河猴粪便、血清和组织，进行HEV RNA的检测及病毒拷贝的检测；S4、分别分析步骤S3和步骤S4的HEV RNA的检测结果及病毒拷贝检测的结果。本发明成功建立戊型肝炎病毒(HEV)妊娠恒河猴动物模型，用于妊娠期间HEV感染导致高致死率机理的研究以及抗HEV药物筛选和疫苗安全性评价等。

技术研发人员：黄芬;郝先辉;禹文海
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：2019.03.08
技术公布日：2019.07.12