渗透性保护剂、无血清冻存液以及该无血清冻存液的制备与使用方法与流程

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种用于人血液由来淋巴细胞、粒细胞及脐带血由来的多功能干细胞冻存的渗透性保护剂、无血清冻存液以及该无血清冻存液的制备与使用方法。

背景技术：

细胞冻存及复苏是细胞培养技术中的重要技术,细胞冻存是细胞长期保存的重要手段。细胞冻存液,作为细胞冻存时必须使用的一种溶液,其作用是将需要冻存的细胞悬浮于冻存液,供给细胞生命代谢所必须的营养物质,同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。

在现有技术中,细胞冻存经常采用渗透性保护剂,例如甘油和二甲基亚砜(dmso)两种,而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低,但dmso却可以迅速透入细胞,提高细胞膜对水的通透性,使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶,成为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂，目前被广泛使用。

一般使用培养基、血清和二甲亚砜(dmso)按照一定比例混合的方法来冻存细胞,dmso用量为10％,但高浓度的dmso有较大毒性,会对细胞体及人体造成伤害；且传统冻存液配方中所使用的血清成本高,增加动物病原污染的可能性。此外,有研究表明长期与胎牛血清接触的细胞会对溶液介质中的胎牛血清发生内吞,内吞胎牛血清后的间充质干细胞有可能发生某些蛋白表达的变化,应用于人体后可发生异种动物蛋白引起的免疫反应,不能直接用于临床输注。因此,利用含有血清的冻存液冻存的细胞会给临床使用带来一定的风险。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明提供一种成本低廉、低毒性、细胞复苏后成活率高的渗透性保护剂、无血清冻存液以及该无血清冻存液的制备与使用方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种渗透性保护剂，所述渗透性保护剂为富里酸。

一种无血清冻存液，按体积百分比包括：88％-94％的无血清培养基，6％-12％的渗透性保护剂，所述渗透性保护剂为富里酸。

本发明进一步设置：所述无血清培养基包括3-10g/l人血白蛋白、30-100mg/l谷胱酰肽以及基础培养基，所述基础培养基为rpmi1640、dmem、f12、dmem/f12或imdm中的一种或几种，所述无血清培养基ph为6.8-7.4。

本发明进一步设置：按体积百分比包括：92％的无血清培养基，8％的渗透性保护剂。

本发明可进一步优选的采用发明人在公开号为cn108707579a的发明专利申请中的方案，如无血清培养基中还含有胰岛素、转铁蛋白、丙酮酸钠、亚硒酸钠、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、亚油酸、油酸、2-氨基乙醇盐酸盐、hepes和碳酸氢钠等。

一种无血清冻存液的制备方法，将装有所述无血清冻存液的灭菌过滤器安装在超净工作台或安全柜中，用压力泵将混匀液体泵出，分装到无菌容器中；将分装好的容器密封并将其储存在4至10℃冷藏柜，且需避光。

一种无血清冻存液的使用方法，包括：

细胞冻存：将细胞加入所述无血清冻存液重悬,将细胞悬液加入到冻存管中,冻存管置于已处于常温状态的程序降温盒中,再将程序降温盒放置于-80℃超低温冰箱过夜,第二天转移至液氮罐冻存架中保进一步地；

冻存细胞复：从液氮容器中取出冻存管直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；在1000rpm情况下离心5min。

本发明具有以下效果：1.富里酸有效地代替二甲基亚砜，在细胞冻存领域为首创；2.提供了一种制备方法简单、成本低廉、低毒性、细胞复苏后成活率高；3.该冻存液需现配现用,细胞复苏后无需倒掉冻存液后再培养,可直接将其加入到培养液中,至长满后传代或使用,方便快捷；4.该细胞冻存液不会引入外源蛋白,降低了动物病原污染的可能性,采用该冻存液经冻存复苏后的细胞,存活率达81-92％、贴壁生长好、纯度高、分化能力强,可用于继续培养或临床细胞直接回输,安全有效,在临床上具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例3无血清冻存液在液氮冻存6个月，显微镜下细胞复苏后24小时的生长情况。

具体实施方式

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

实施例1

1)无血清冻存液按体积比配比：88％的无血清培养基(无血清培养基采用开号为cn108707579a的发明专利申请中的方案)，12％的富里酸；

2)将装有所述无血清冻存液的灭菌过滤器安装在超净工作台或安全柜中，用压力泵将混匀液体泵出，分装到无菌容器中；将分装好的容器密封并将其储存在4至10℃冷藏柜，且需避光；

3)细胞冻存：将细胞加入所述无血清冻存液重悬,将细胞悬液加入到冻存管中,冻存管置于已处于常温状态的程序降温盒中,再将程序降温盒放置于-80℃超低温冰箱过夜,第二天转移至液氮罐冻存架中保进一步地；

冻存细胞复：从液氮容器中取出冻存管直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；在1000rpm情况下离心5min。

实施例2

1)无血清冻存液按体积比配比：92％的无血清培养基(无血清培养基采用开号为cn108707579a的发明专利申请中的方案)，8％的富里酸；

2)将装有所述无血清冻存液的灭菌过滤器安装在超净工作台或安全柜中，用压力泵将混匀液体泵出，分装到无菌容器中；将分装好的容器密封并将其储存在4至10℃冷藏柜，且需避光；

3)细胞冻存：将细胞加入所述无血清冻存液重悬,将细胞悬液加入到冻存管中,冻存管置于已处于常温状态的程序降温盒中,再将程序降温盒放置于-80℃超低温冰箱过夜,第二天转移至液氮罐冻存架中保进一步地；

冻存细胞复：从液氮容器中取出冻存管直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；在1000rpm情况下离心5min。

实施例3

1)无血清冻存液按体积比配比：94％的无血清培养基(无血清培养基采用开号为cn108707579a的发明专利申请中的方案)，6％的富里酸(fulvicacid)，cas登录号479-66-3；

2)将装有所述无血清冻存液的灭菌过滤器安装在超净工作台或安全柜中，用压力泵将混匀液体泵出，分装到无菌容器中；将分装好的容器密封并将其储存在4至10℃冷藏柜，且需避光；

3)细胞冻存：将细胞加入所述无血清冻存液重悬,将细胞悬液加入到冻存管中,冻存管置于已处于常温状态的程序降温盒中,再将程序降温盒放置于-80℃超低温冰箱过夜,第二天转移至液氮罐冻存架中保进一步地；

冻存细胞复：从液氮容器中取出冻存管直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；在1000rpm情况下离心5min。

对比例

1)无血清冻存液按体积比配比：90％的无血清培养基(无血清培养基采用开号为cn108707579a的发明专利申请中的方案)，10％的二甲亚砜；

2)将装有所述无血清冻存液的灭菌过滤器安装在超净工作台或安全柜中，用压力泵将混匀液体泵出，分装到无菌容器中；将分装好的容器密封并将其储存在4至10℃冷藏柜，且需避光；

3)细胞冻存：将细胞加入所述无血清冻存液重悬,将细胞悬液加入到冻存管中,冻存管置于已处于常温状态的程序降温盒中,再将程序降温盒放置于-80℃超低温冰箱过夜,第二天转移至液氮罐冻存架中保进一步地；

冻存细胞复：从液氮容器中取出冻存管直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；在1000rpm情况下离心5min。

性能测验

将对比例以及实施例1、2、3用10倍培养液从新重悬细胞，用10ul0.4％台盼蓝和10ul重悬细胞混匀，计数。活细胞率可达85.4％－92.3％。实验结果显示无血清富里酸冻存液与传统二甲基亚砜冻存液在冷冻细胞效果上没有区别。

无血清冻存液在液氮冻存6个月，显微镜下细胞复苏后24小时的生长情况(参见附图1)。暗色为死细胞，透亮为活细胞。经过计数，细胞生存率为92％。(10x10倍率)