专利名称：一种药用细胞注射液的冻存保护辅料的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，特别是药品的辅料，也涉及生物制品的玻璃化冻存技术，具体涉及一种药用细胞注射液的冻存保护辅料，通过在药用细胞制品中添加聚乙二醇、 1，2_丙二醇、白蛋白、氯化钠等冻存保护剂实现药用细胞制品的玻璃化冻存，提高解冻后的复苏率，并且安全无毒，实现药用细胞制品解冻后直接临床使用，此外该辅料还具有补充营养、增强免疫力、增强细胞治疗效果的功能。
背景技术：
细胞治疗又称活细胞治疗，是指用活细胞修复病变或损伤的组织。细胞治疗中使用的细胞可以有多种来源，根据对国家药监局网站的检索，目前我国进入临床试验的细胞治疗产品有骨髓间充质干细胞、脐带血巨核系祖细胞、脐带血红系祖细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)等；根据卫生部2009年颁布的《首批允许临床应用的第三类医疗技术目录》，细胞移植治疗技术(干细胞除外)、造血干细胞治疗技术已经被允许应用于临床。此外国内外还有神经干细胞、胚胎干细胞、视网膜色素上皮细胞等多种细胞作为药物或医疗技术进入临床试验或动物试验。由于细胞治疗要使用活细胞，药用细胞制品在储存过程中必须保持细胞的活性。 传统的长期储存方法是在细胞制品中加入10%左右的DMSO作为低温保护剂，然后冻存于-196°C液氮或_80°C超低温冰箱中。然而DMSO具有很高的毒副作用，通常使接受移植的个体产生恶心、呕吐、腹痛等症状，对心血管、呼吸系统、中枢神经以及肾脏等也会产生副作用。使用DMSO作为冻存剂时，在细胞解冻复苏后进行一段时间的驯化培养后再进行细胞移植才比较安全。因此寻找一种毒副作用小、细胞解冻后能够直接移植的冻存保护剂非常重要。玻璃化方法是在完全玻璃化状态下保存生物材料的一种方法。玻璃化是指液态转变为非晶态的固化过程，玻璃态固体能保持液态时正常的分子和离子分布，可以避免因结冰对生物材料造成的物理性损伤。玻璃化方法操作简单快速，对细胞、组织损伤小，是一种非常有前景的生物材料的长期保存方法。本发明提供了一种新的药用级细胞注射液的冻存保护辅料，包括聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白、氯化钠等成分。该细胞注射液的冻存保护辅料可以有效形成细胞或组织的低温玻璃化长期冻存效果，并且使用该辅料冻存的细胞注射液解冻后能够直接移植，具有安全、方便、快捷等特点，此外还具有补充营养、增强免疫力、 增强细胞治疗效果的功能，更适于细胞治疗。
发明内容
本发明的目的在于针对细胞治疗的特殊需求，提供一种药用细胞注射液的冻存保护辅料，使细胞治疗更加安全、方便、快捷。本发明涉及一种药用的生物组织样本，例如，细胞注射液的冻存保护辅料，其含有聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白和氯化钠成分。在具体的实施方案中，所述聚乙二醇在所述
3生物组织样本，例如细胞注射液中的终浓度为5-100g/L、25-100g/L、50-100g/L、75-100g/ L、80-100g/L、90-100g/L;所述1，2-丙二醇在所述生物组织样本，例如细胞注射液中的终浓度为 50-400g/L、100-400g/L、150-400g/L、200-400g/L、250-400g/L、300-400g/L ；所述白蛋白在所述生物组织样本，例如细胞注射液中的终浓度为10-100g/L、30-100g/L、 50-100g/L、70-100g/L、80-100g/L、90-100g/L ；所述氯化钠在所述生物组织样本，例如细胞注射液中的终浓度为 8. 5-9. 5g/L、8. 6-9. 4g/L、8. 7-9. 3g/L、8. 8-9. 2g/L、8. 9-9. lg/L、9g/ L。以上所列聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白和氯化钠成分的终浓度范围可以任意组合，配制成本发明的药用细胞注射液的冻存保护辅料。例如，在一个实施方案中，所述聚乙二醇、1， 2-丙二醇、白蛋白和氯化钠成分在所述细胞注射液中的终浓度为聚乙二醇(PEG)，5-100g/L；1，2_ 丙二醇，50-400g/L ；白蛋白，10-100g/L;氯化钠，8.5_9.5g/L。优选，所述聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白和氯化钠在所述细胞注射液中的终浓度为聚乙二醇，50_100g/L，1,2-丙二醇，100_400g/L，白蛋白，50_100g/L，氯化钠，8.5_9.5g/L。更优选，所述聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白和氯化钠在所述细胞注射液中的终浓度为聚乙二醇，80_100g/L，1,2-丙二醇，200_400g/L，白蛋白，80_100g/L，氯化钠，9g/L。配制本发明的冻存保护辅料所采用的所述聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白、氯化钠优选均为药用级产品；所述的白蛋白优选是人血白蛋白或称为人血清白蛋白；所述的聚乙二醇优选是分子量为400的聚乙二醇(PEG400)。本发明的细胞注射液的冻存保护辅料可以用作细胞注射液的冻存保护剂，还可以用做生物组织样本玻璃化冻存的保护剂。本发明涉及一种生物组织样本冻存保护剂，含有聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白和氯化钠成分。在一个实施方案中，所述成分在所述生物组织样本中的终浓度分别为聚乙二醇(PEG)，5-100g/L；1，2_ 丙二醇，50_400g/L ；白蛋白，10-100g/L;氯化钠，8.5_9.5g/L。优选，所述成分在所述生物组织样本中的终浓度为聚乙二醇，50_100g/L，1，2-丙二醇，100_400g/L，白蛋白，50_100g/L，
氯化钠，8.5_9.5g/L。更优选，所述成分在所述生物组织样本中的终浓度为聚乙二醇，80_100g/L，1，2-丙二醇，200_400g/L，白蛋白，80_100g/L，氯化钠，9g/L。在以上实施方案中，所述的白蛋白是人血白蛋白；所述的聚乙二醇是分子量为 400的聚乙二醇(PEG400)。以上所述的生物组织样本优选为用于细胞移植的新鲜分离后的细胞悬液或冻存复苏后的细胞悬液等等。术语“细胞治疗”或称为“活细胞治疗”，是指将活性细胞注入体内，刺激退化、衰老、损伤细胞，促进其更新、修复，从而恢复器官功能。根据尼汉斯医生证明的理论，这些细胞从注射的位置开始循环，甚至它们识别出与其来源器官相似的器官，并在其上聚集，例如，肝脏细胞进入肝脏、性细胞移至性器官、心脏细胞进入心脏等等。目前国内外骨髓间充质干细胞、脐带血巨核系祖细胞、神经干细胞、胚胎干细胞、视网膜色素上皮细胞等多种细胞作为药物已进入临床试验或动物试验。在活细胞的临床应用中，保持细胞的活性是至关重要的。本发明的细胞注射液冻存保护辅料能够使复溶的细胞注射液在90小时和30天后活细胞的数量仍保持在85%以上。同时，本发明的冻存保护辅料通过动物实验证明也是安全的。“玻璃化”冻存是指在降温过程中，不产生冰晶，而使溶液固化的过程。它与常见的液体变晶体或部分结晶的冻结过程不同。在本发明的辅料中，聚乙二醇和白蛋白起非渗透性冻存保护作用，能够深入细胞内部，具有降低冰点、减少冰晶形成、稀释溶液中电解质的浓度、减少溶质损伤、平衡细胞内外渗透压、减轻细胞缩水程度等作用。1，2_丙二醇和氯化钠起渗透性冻存保护作用。上述成分联合使用，产生了显著的协同效果，迫使某些热力学参数发生了改变，比如玻璃化温度升高、玻璃化所需浓度降低，提高了保存效果，实现了细胞注射液的低温玻璃化长期冻存。本发明上述辅料中的各成分均是常用的化学试剂或生物制品，其中聚乙二醇可购自青岛天力源生物科技有限公司，1，2_丙二醇可购自锦化化工(集团)有限责任公司，白蛋白可购自上海生物制品所，氯化钠可以生理盐水的形式购自吉林都邦药业股份有限公司。
具体实施例方式(1)配置辅料将聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白、氯化钠各辅料成分按照前述浓度添加到水中溶解，或者将聚乙二醇、1，2_丙二醇、白蛋白各辅料成分按照前述浓度添加到生理盐水中溶解，制成辅料溶液；(2)制备注射液将培养液中的细胞放到离心管中离心，弃上清，将步骤(1)制备的辅料溶液添加到离心管中，重悬细胞，使细胞在溶液中的浓度达到1. OX 10~6个细胞/ ml，制成药用细胞注射液；(3)冻存将步骤(2)制备的药用细胞注射液按照“4°C 1小时一-200C 1小时 —-700C 10小时一液氮长期储存”的步骤储存于液氮中；(4)复溶使用前，将步骤(3)中储存的药用细胞注射液从液氮中取出，放置于
535°C中复溶，然后用于细胞移植。实施例1 (1)按照下面的配方配置IOOml辅料溶液
权利要求
1.一种药用细胞注射液的冻存保护辅料，含有聚乙二醇、1，2-丙二醇、白蛋白和氯化钠成分。
2.权利要求1的细胞注射液的冻存保护辅料，其中所述成分在所述细胞注射液中的终浓度分别为聚乙二醇(PEG)，5-100g/L ； 1，2-丙二醇，50-400g/L; 白蛋白，10-100g/L;氯化钠，8. 5-9. 5g/L。
3.权利要求1或2的细胞注射液的冻存保护辅料，其中所述成分在所述细胞注射液中的终浓度分别为聚乙二醇， 50-100g/L， 1,2-丙二醇，100-400g/L， 白蛋白，50-100g/L，氯化钠，8. 5-9. 5g/L。
4.权利要求1-3任一项的细胞注射液的冻存保护辅料，其中所述成分在所述细胞注射液中的终浓度分别为聚乙二醇， 80-100g/L， 1,2-丙二醇，200-400g/L， 白蛋白，80-100g/L，氯化钠，9g/L。
5.权利要求1-4任一项所述的细胞注射液的冻存保护辅料，其中所述的白蛋白是人血白蛋白。
6.权利要求1-5任一项所述的细胞注射液的冻存保护辅料，其中所述的聚乙二醇是分子量为400的聚乙二醇(PEG400)。
7.权利要求1-6任一项所述的细胞注射液的冻存保护辅料，其还可以用做生物组织样本玻璃化冻存的保护剂。
8.权利要求1-6任一项所述的细胞注射液的冻存保护辅料，其为生物组织样本冻存保护剂。
9.权利要求1-8任一项所述的冻存保护辅料在细胞注射液冻存或生物组织样本玻璃化冻存方面的用途。
全文摘要
本发明提供了一种药用细胞注射液的冻存保护辅料，包括一定含量的聚乙二醇、丙二醇、白蛋白、氯化钠。该辅料还可以用作生物组织样本玻璃化冻存的保护剂。该辅料在药用细胞注射液冻存、复苏过程中能够减轻对细胞的伤害、维持细胞活性，含有该辅料的药用细胞注射液可实现低温玻璃化长期冻存，解冻后可直接用于细胞移植，具有使用安全、方便、快捷等特点。此外，该辅料还具有补充营养、增强免疫力、增强细胞治疗效果的功能，更适于细胞治疗。
文档编号A01N1/02GK102273438SQ20111023198
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月15日 优先权日2011年8月15日
发明者刘军, 杨立敏, 金宜强 申请人:上海安集协康生物技术有限公司