一种黄绿蜜环菌细胞培养装置及其培养方法与流程

本发明属于菌株培养技术领域，尤其涉及一种黄绿蜜环菌细胞培养装置及其培养方法。

背景技术：

黄绿蜜环菌(armillarialuteo-virens)属于白蘑科(tricholomataceae)，蜜环菌属(armillaria)。其子实体肥厚；味道鲜美；香气浓郁；营养丰富,是一种名贵野生药食兼用真菌。

三十烷醇，英文通用名triacontanol，无公害的植物生长调节剂。具有多种生理作用，促进能量贮存，改善细胞透性，调节生理功能，增强酶的活性，促进矿物质吸收，提高成熟，增加蛋白质含量和干物质量。对水稻、麦类、棉花、大豆、玉米、高粱、甘蔗等均具有明显的增产效果和改善品质的作用。但一直没有在黄绿蜜环菌等食用菌细胞培养中得到应用。黄绿蜜环菌遗传特性及长期的高寒适应性造成其生长发育缓慢，菌株培养需较长时间。黄绿蜜环菌细胞培养过程中，往往是封闭环境和单侧光源，不同平皿之间的光照强度、温度和湿度之间都会产生差异。

技术实现要素：

本发明目的在于解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种黄绿蜜环菌细胞培养装置及其培养方法，能够使培养平台进行转动，减小培养平台上不同平皿之间光照强度、温度和湿度之间的差异，同时提高生长速度。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种黄绿蜜环菌细胞培养装置，其特征在于：包括培养平台、支撑机构、动力机构和固定盘，培养平台设于支撑机构上，培养平台与支撑机构转动连接，动力机构设于支撑机构上，动力机构驱动培养平台转动，固定盘设于培养平台上。通过使培养平台进行转动，减小培养平台上不同平皿之间光照强度、温度和湿度之间的差异。

进一步，动力机构包括电机、主动齿轮、第一齿轮、转杆和第二齿轮，支撑机构设有固定套，固定套固定电机，电机驱动主动齿轮转动，主动齿轮与第一齿轮相啮合，主动齿轮带动第一齿轮转动，第一齿轮与转杆相连接，第二齿轮与转杆相连接，第一齿轮带动转杆转动，转杆带动第二齿轮转动，第二齿轮带动培养平台转动。通过转杆使得电机带动上下两层的培养平台转动，使得上下两层的培养平台转动同步。

进一步，培养平台设有第三齿轮，第三齿轮的底部设有转板，第三齿轮与第二齿轮相啮合，转板设于支撑机构中，转板与支撑机构转动连接。第三齿轮的齿数远远多于第二齿轮的齿数，使得培养平台的转动缓慢，利于黄绿蜜环菌细胞生长。

进一步，支撑机构包括支撑环、卡环、第一支撑杆和第二支撑杆，支撑环中设有转板，转板与支撑环转动连接，卡环设于支撑环上，卡环限位转板，第一支撑杆连接两个支撑环，第二支撑杆连接两个支撑环，转杆设于第一支撑杆上，第一支撑杆与转杆转动连接。通过支撑环与卡环的设置，方便转板的安装，同时在卡环处设置开口，方便第三齿轮与第二齿轮的啮合，带动培养平台转动。

进一步，第一支撑杆设有保护壳，保护壳设有端盖，保护壳能够对电机起到保护作用，防止平皿倾倒培养基流入电机中损坏电机，端盖能够拆卸方便对动力机构进行检查和维护。

进一步，培养平台设有定位杆，第三齿轮设有第一通孔，转板设有第二通孔，第一通孔与第二通孔位置相对应，第一通孔与第二通孔中通有定位杆，培养平台安装时只需要将定位杆对准第一通孔和第二通孔中插入，依靠培养平台自身的重力使得培养平台固定在转板和第三齿轮上。

进一步，培养平台设有卡块，培养平台设有固定框，固定框设于卡块中，卡块设有限位块，限位块限位固定框，固定盘设于固定框中。固定框有多种型号，能固定不同数量的固定盘，可根据培养需求来改变固定框，使得培养平台上放置不同数量的平皿。通过四个卡块与限位块起到将固定框固定在培养平台的作用，同时限位块拆卸方便，方便固定框的更换。

一种黄绿蜜环菌细胞培养装置的培养方法，其特征在于包括如下步骤：

a)细胞培养装置拼装。

b)细胞培养装置的调整：根据在培养平台上所需放置的平皿来设置固定框，将固定框设于卡块中，之后扣上限位块以防止固定框移动，之后在固定框中放置固定盘，打开电机卡关，检查电机带动上下两层培养平台转动，之后将保护壳扣上。在培养平台上固定固定框和固定盘，方便将平皿放置在细胞培养装置上，同时防止培养平台不能正常转动影响黄绿蜜环菌细胞培养。

c)培养基配置：黄绿蜜环菌基本培养基配方，以重量分数计，葡萄糖100-200份；酵母膏20-40份；小麦300-500份；k2hpo43-5份；kh2po46-8份；mgso41-3份，vb10.5-1份；琼脂100-200份；微量元素母液200份；水10000份；

先将小麦浸泡24小时，之后加水煮沸30分钟，过滤小麦汁，将煮沸后的小麦与基本培养基的剩余成份混合搅拌溶化，最后对培养基进行灭菌处理。配置培养基以便对黄绿蜜环菌细胞进行培养。

d)生长调节剂配置：将三十烷醇配置成10^-4mg.ml^-1母液，之后在培养基中加入1.5×10^-7mg.ml^-1的三十烷醇母液。

e)原种培养：将黄绿蜜环菌子实体放入体积浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡10-20秒，灭菌，用无菌水冲洗，用灭菌接种刀切取菌柄与菌盖结合处的组织块，以无菌操作方式接种于灭菌后的黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿上,之后将黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿置于细胞培养装置的固定盘上，将细胞培养装置置于23-24℃条件下恒温培养，同时对光和汽等环境条件进行控制，之后打开细胞培养装置的开关，培养平台转动。对黄绿蜜环菌细胞进行接种，之后通过细胞培养装置转动进行培养，减少培养平台上不同平皿之间的差异。

进一步，步骤c)中的微量元素母液配方，以重量份数计，fecl30.2521-0.5042份；caso40.2508-0.5015份；zncl0.0993-0.1986份；cu(no3)20.0511-0.1021份，水1000份。通过微量元素提高黄绿蜜环菌细胞的培养速度。

进一步，步骤a)中的详细步骤为，先将转板置于支撑环中，之后再支撑环上安装卡环，在将第三齿轮置于转板上，之后安装第一支撑杆和第二支撑杆来连接两个支撑环，再在第一支撑杆上安装转杆，然后在转杆上安装第一齿轮和第二齿轮，同时第二齿轮与第三齿轮啮合，之后在第三齿轮上放上培养平台，将电机安装在固定套中，然后在第一支撑杆上安装固定套，在电机上安装主动齿轮，主动齿轮与第一齿轮相啮合。通过上述步骤安装细胞培养装置，能够使细胞培养装置的安装更加方便，同时使得第三齿轮与第二齿轮、第一齿轮与主动齿轮之间的啮合性高，有利于培养平台的转动。

本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：

本发明包括培养平台、支撑机构、动力机构和固定盘，培养平台设于支撑机构上，培养平台与支撑机构转动连接，动力机构设于支撑机构上，动力机构驱动培养平台转动，培养平台上设有固定盘。通过使培养平台进行转动，减小培养平台上不同平皿之间光照强度、温度和湿度之间的差异。

本发明动力机构包括电机、主动齿轮、第一齿轮、转杆和第二齿轮，支撑机构设有固定套，固定套固定电机，电机驱动主动齿轮转动，主动齿轮与第一齿轮相啮合，主动齿轮带动第一齿轮转动，第一齿轮与转杆相连接，第二齿轮与转杆相连接，第一齿轮带动转杆转动，转杆带动第二齿轮转动，第二齿轮带动培养平台转动。本发明通过转杆使得电机带动上下两层的培养平台转动，使得上下两层的培养平台转动同步，同时动力机构设置在外侧，不会占用培养平台的空间，减少了对培养平台的遮挡，有利于细胞的培养。

本发明通过在培养黄绿蜜环菌细胞时采用细胞培养装置减少不同位置之间的平皿的光照、温度和湿度之间的差异，使得细胞培养的条件更加一致，利于黄绿蜜环菌细胞培养，同时在培养基中增加10^-4mg.ml^-1的三十烷醇母液，来提高黄绿蜜环菌细胞的培养速度，提高黄绿蜜环菌的生长速度。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明：

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明中去除保护壳的结构示意图；

图3为本发明中拆除培养平台的结构示意图；

图4为本发明中支撑机构和动力机构的结构示意图；

图5为本发明中第三齿轮和转板设于培养平台的结构示意图；

图6为本发明中卡块安装在培养平台的结构示意图；

图7为本发明中限位块安装在卡块上的结构示意图

图8为本发明中固定框的结构示意图；

图9为三十烷醇对菌丝生长的影响的曲线图。

图中，1-培养平台；2-支撑机构；3-动力机构；4-固定盘；5-电机；6-主动齿轮；7-第一齿轮；8-转杆；9-第二齿轮；10-固定套；11-第三齿轮；12-转板；13-支撑环；14-卡环；15-第一支撑杆；16-第二支撑杆；17-保护壳；18-端盖；19-定位杆；20-第一通孔；21-第二通孔；22-卡块；23-固定框；24-限位块。

具体实施方式

如图1至图8所示，为本发明一种黄绿蜜环菌细胞培养装置，包括培养平台1、支撑机构2、动力机构3和固定盘4，培养平台1设于支撑机构2上，培养平台1与支撑机构2转动连接，动力机构3设于支撑机构2上，动力机构3驱动培养平台1转动，固定盘4设于培养平台1上。通过使培养平台1进行转动，减小培养平台1上不同平皿之间光照强度、温度和湿度之间的差异。

动力机构3包括电机5、主动齿轮6、第一齿轮7、转杆8和第二齿轮9，支撑机构2设有固定套10，固定套10固定电机5，电机5驱动主动齿轮6转动，主动齿轮6与第一齿轮7相啮合，主动齿轮6带动第一齿轮7转动，第一齿轮7与转杆8相连接，第二齿轮9与转杆8相连接，第一齿轮7带动转杆8转动，转杆8带动第二齿轮9转动，第二齿轮9带动培养平台1转动。通过转杆8使得电机5带动上下两层的培养平台1转动，使得上下两层的培养平台1转动同步。

培养平台1设有第三齿轮11，第三齿轮11的底部设有转板12，第三齿轮11与第二齿轮9相啮合，转板12设于支撑机构2中，转板12与支撑机构2转动连接。第三齿轮11的齿数远远多于第二齿轮9的齿数，使得培养平台1的转动缓慢，利于黄绿蜜环菌细胞生长。

支撑机构2包括支撑环13、卡环14、第一支撑杆15和第二支撑杆16，支撑环13中设有转板12，转板12与支撑环13转动连接，卡环14设于支撑环13上，卡环14限位转板12，第一支撑杆15连接两个支撑环13，第二支撑杆16连接两个支撑环13，转杆8设于第一支撑杆15上，第一支撑杆15与转杆8转动连接。通过支撑环13与卡环14的设置，方便转板12的安装，同时在卡环14处设置开口，方便第三齿轮11与第二齿轮9的啮合，带动培养平台1转动。

第一支撑杆15设有保护壳17，保护壳17设有端盖18，保护壳17能够对电机5起到保护作用，防止平皿倾倒培养基流入电机5中损坏电机5，端盖18能够拆卸方便对动力机构3进行检查和维护。

培养平台1设有定位杆19，第三齿轮11设有第一通孔20，转板12设有第二通孔21，第一通孔20与第二通孔21位置相对应，第一通孔20与第二通孔21中通有定位杆19，培养平台1安装时只需要将定位杆19对准第一通孔20和第二通孔21中插入，依靠培养平台1自身的重力使得培养平台1固定在转板12和第三齿轮11上。

培养平台1设有卡块22，培养平台1设有固定框23，固定框23设于卡块22中，卡块22设有限位块24，限位块24限位固定框23，固定盘4设于固定框23中。固定框23有多种型号，能固定不同数量的固定盘4，可根据培养需求来改变固定框23，使得培养平台1上放置不同数量的平皿。通过四个卡块22与限位块24起到将固定框23固定在培养平台1的作用，同时限位块24拆卸方便，方便固定框23的更换。

一种黄绿蜜环菌细胞培养装置的培养方法，其特征在于包括如下步骤：

a)细胞培养装置拼装。

b)细胞培养装置的调整：根据在培养平台1上所需放置的平皿来设置固定框23，将固定框23设于卡块22中，之后扣上限位块24以防止固定框23移动，之后在固定框23中放置固定盘4，打开电机5卡关，检查电机5带动上下两层培养平台1转动，之后将保护壳17扣上。在培养平台1上固定固定框23和固定盘4，方便将平皿放置在细胞培养装置上，同时防止培养平台1不能正常转动影响黄绿蜜环菌细胞培养。

c)培养基配置：黄绿蜜环菌基本培养基配方，以重量分数计，葡萄糖100-200份；酵母膏20-40份；小麦300-500份；k2hpo43-5份；kh2po46-8份；mgso41-3份，vb10.5-1份；琼脂100-200份；微量元素母液200份；水10000份；

先将小麦浸泡24小时，之后加水煮沸30分钟，过滤小麦汁，将煮沸后的小麦与基本培养基的剩余成份混合搅拌溶化，最后对培养基进行灭菌处理。配置培养基以便对黄绿蜜环菌细胞进行培养。

d)生长调节剂配置：将三十烷醇配置成10^-4mg.ml^-1母液，之后在培养基中加入1.5×10^-7mg.ml^-1的三十烷醇母液。通过采用单因素实验设计，1.5(×10^-7mg.ml^-1)菌丝生长最快。

选用生长调节剂三十烷醇，采用单因素实验设计,实验重复5次。先将生长调节剂配置成10^-4mg.ml^-1母液，在培养基中分别加入0、0.5、1、1.5、2、2.5ml/l三十烷醇10^-4mg.ml^-1母液。加入培养基的培养皿在126℃条件下灭菌30分钟。在23-24℃条件下恒温培养60天测定菌落生长直径。

黄绿蜜环菌菌丝细胞在培养基中添加不同浓度的三十烷醇对菌丝细胞生长的影响见表1。可以看出，三十烷醇对菌丝生长有明显的影响，在0-1.5(×10^-7mg.ml^-1)之间随着浓度提高菌丝生长加快，1.5(×10^-7mg.ml^-1)菌丝生长最快，但超过2.5(×10^-7mg.ml^-1)时，对菌丝细胞生长反而有抑制作用。菌落生长直径与三十烷醇添加浓度符合：y＝0.3523x⁴-2.0373x³+3.1709x²-0.7182x+3.2453数学模型；拟合度为r²＝0.9825，见图9。

表1三十烷醇对菌丝生长的影响

lsd(5％)＝0.0718lsd(1％)＝0.0974

e)原种培养：将黄绿蜜环菌子实体放入体积浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡10-20秒，灭菌，用无菌水冲洗，用灭菌接种刀切取菌柄与菌盖结合处的组织块，以无菌操作方式接种于灭菌后的黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿上,之后将黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿置于细胞培养装置的固定盘4上，将细胞培养装置置于23-24℃条件下恒温培养，同时对光和汽等环境条件进行控制，之后打开细胞培养装置的开关，培养平台1转动。对黄绿蜜环菌细胞进行接种，之后通过细胞培养装置转动进行培养，减少培养平台1上不同平皿之间的差异。

步骤c)中的微量元素母液配方，以重量份数计，fecl30.2521-0.5042份；caso40.2508-0.5015份；zncl0.0993-0.1986份；cu(no3)20.0511-0.1021份，水1000份。通过微量元素提高黄绿蜜环菌细胞的培养速度。

步骤a)中的详细步骤为，先将转板12置于支撑环13中，之后再支撑环13上安装卡环14，在将第三齿轮11置于转板12上，之后安装第一支撑杆15和第二支撑杆16来连接两个支撑环13，再在第一支撑杆15上安装转杆8，然后在转杆8上安装第一齿轮7和第二齿轮9，同时第二齿轮9与第三齿轮11啮合，之后在第三齿轮11上放上培养平台1，将电机5安装在固定套10中，然后在第一支撑杆15上安装固定套10，在电机5上安装主动齿轮6，主动齿轮6与第一齿轮7相啮合。通过上述步骤安装细胞培养装置，能够使细胞培养装置的安装更加方便，同时使得第三齿轮11与第二齿轮9、第一齿轮7与主动齿轮6之间的啮合性高，有利于培养平台1的转动。

本发明包括培养平台1、支撑机构2、动力机构3和固定盘4，培养平台1设于支撑机构2上，培养平台1与支撑机构2转动连接，动力机构3设于支撑机构2上，动力机构3驱动培养平台1转动，培养平台1上设有固定盘4。通过使培养平台1进行转动，减小培养平台1上不同平皿之间光照强度、温度和湿度之间的差异。

本发明动力机构3包括电机5、主动齿轮6、第一齿轮7、转杆8和第二齿轮9，支撑机构2设有固定套10，固定套10固定电机5，电机5驱动主动齿轮6转动，主动齿轮6与第一齿轮7相啮合，主动齿轮6带动第一齿轮7转动，第一齿轮7与转杆8相连接，第二齿轮9与转杆8相连接，第一齿轮7带动转杆8转动，转杆8带动第二齿轮9转动，第二齿轮9带动培养平台1转动。本发明通过转杆8使得电机5带动上下两层的培养平台1转动，使得上下两层的培养平台1转动同步，同时动力机构3设置在外侧，不会占用培养平台1的空间，减少了对培养平台1的遮挡，有利于细胞的培养。

本发明通过在培养黄绿蜜环菌细胞时采用细胞培养装置减少不同位置之间的平皿的光照、温度和湿度之间的差异，使得细胞培养的条件更加一致，利于黄绿蜜环菌细胞培养，同时在培养基中增加10^-4mg.ml^-1的三十烷醇母液，来提高黄绿蜜环菌细胞的培养速度，提高黄绿蜜环菌的生长速度。

以上仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此。任何以本发明为基础，为解决基本相同的技术问题，实现基本相同的技术效果，所作出的简单变化、等同替换或者修饰等，皆涵盖于本发明的保护范围之中。