一种以叶片为外植体的樟叶越桔组织培养方法与流程

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以叶片为外植体的樟叶越桔组织培养方法。

背景技术：

樟叶越桔(vacciniumdunalianum)是杜鹃花科(ericaceae)越桔属(vaccinium)植物，常绿灌木。主产于云南、四川、贵州、西藏等地，我国台湾以及锡金、不丹、印度(东北部)、缅甸(东北部)至越南亦有分布，在云南省境内则主要分布于云南西北部经滇中高原至滇南和滇东南。其幼嫩叶芽，因形似雀嘴呈锥状，在云南彝族民间又称“雀嘴茶”，据记载自明代开始就作为一种茶代用品长期饮用至今。樟叶越桔(原变种)全株均可药用，用于风湿关节痛，主要成分6’-o-咖啡酰熊果苷ca广泛用作化妆品行业的皮肤美白天然活性剂原料。但野生植物资源逐渐减少，人工栽培周期过长，生长缓慢，还可能由于生态环境多样性较差存在病虫害危害，导致其有效成分产量下降、品质变差。

目前国内外对樟叶越桔诱导愈伤组织、不定芽获得次生代谢产物的报道甚少，因此展开樟叶越桔的植物组织培养研究非常必要，有补充其人工培养的不足的作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种以叶片为外植体的樟叶越桔组织培养方法。该培养方法下樟叶越桔叶片不定芽诱导率达到86.7％，该方法具有外植体材料易获得、产生丛芽量多、繁殖速度快、周期短等优点，是短期内获取大量樟叶越桔幼苗的有效途径。

为实现本发明的目的，在此所提供的以叶片为外植体的樟叶越桔组织培养方法以樟叶越桔的叶片为外植体进行樟叶越桔组培苗进行培养，包括以下步骤：

步骤一：叶片愈伤诱导，取叶片健壮的樟叶越桔组培苗，在叶片表面进行划伤处理后叶片置于愈伤诱导培养基表面进行愈伤诱导；

步骤二：不定芽诱导培养，将愈伤诱导出的幼苗转入不定芽诱导培养基中不定芽诱导培养；

步骤三：生根诱导，将不定芽诱导培养长成的健壮的樟叶越桔组培苗接种于生根培养基中进行培养，进行诱导生根，得到樟叶越桔生根苗。

进一步的，所述步骤一中的培养基为：wpm+naa0.01～0.1mg/l+tdz0.1～1.5mg/l，ph5.8。

进一步的，所述步骤一的培养条件为：培养温度23±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12。

进一步的，所述步骤二中不定芽诱导培养基为：wpm+0.3mg/lzt，ph5.8。

进一步的，所述步骤二的培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h。

进一步的，所述步骤三中的生根培养基为：wmp+6-ba0.5～3.0mg/l+naa0.1～1.0mg/l。

进一步的，所述步骤三的培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h。

进一步的，培养基的ph值用1mol/lnaoh或hcl来调节。

进一步的，所述步骤一中在樟叶越桔叶片的下表面进行划伤处理。

进一步的，将经划伤处理的下表面平置于培养基表面。

与现有技术相比，本发明的优异性在于：

(1)以樟叶越桔组培苗的叶片为外植体；

(2)所使用的药品价格低廉，成本低；

(3)本发明的特点在于激素配比简单，以wpm为基本培养基，以naa、tdz、zt、6-ba对不定芽诱导及增殖、生根的影响，对樟叶越桔叶片不定芽诱导进行分析以得到诱导叶片产生不定芽至生根；

(4)本发明方法外植体诱导率达86.7％，诱导的不定芽成苗效果好，幼苗粗壮，叶片饱满；幼苗经过生根诱导后，产生了大量的根，生长健壮，移栽的成活率较高。

附图说明

图1为本发明樟叶越桔叶片切成长宽约1cm的方形，并对表面进行划伤处理的示意图；

图2为本发明(wpm+0.05mg·l^-1naa+1.5mg·l^-1tzd)组樟叶越桔叶片诱导愈伤组织示意图；

图3为本发明(wpm+0.05mg·l^-1naa+1.5mg·l^-1tzd)组樟叶越桔叶片愈伤组织诱导不定芽示意图；

图4为本发明(wpm+0.3mg/lzt)组樟叶越桔不定芽诱导成幼苗示意图；

图5为本发明(wmp+6-ba1.5mg/l+naa0.5mg/l)组樟叶越桔幼苗诱导生根示意图；

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图为本发明做进一步的详细描述，在此通过以下实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

如图1-5所示，本发明在此提供的以叶片为外植体的樟叶越桔组织培养方法以樟叶越桔的叶片为外植体进行樟叶越桔组培苗进行培养，包括以下步骤：

步骤一：叶片愈伤诱导，取长成5cm左右的叶片健壮的樟叶越桔组培苗，在叶片表面进行划伤处理后叶片置于培养基表面，如图1所示，进行愈伤诱导，如图2所示；可以根据培养要求同时进行多组培养，如培养2组以上，每组5瓶，每瓶接种叶片6片；在此步骤中使用的培养基以wpm为基本培养基，加入激素，并调节培养基的ph在灭菌后的ph为5.8；加入的激素为naa和tdz，naa和tdz的浓度根据培养情况设定，在此采用naa0.01mg/l～0.1mg/l，具体为0.01mg/l、0.05mg/l或0.1mg/l；tdz0.1～1.5mg/l，具体为0.1mg/l、0.5mg/l、0.6mg/l、0.8mg/l、1.0mg/l或1.5mg/l；为了更好地保证樟叶越桔叶片不定芽诱导率达到86.7％，采用的愈伤诱导培养基为：0.05mg/lnaa+1.5mg/ltdz+wpm，使愈伤生长快速且旺盛，伴有大量新植株长出，生长情况最好，颜色较绿；有芽点，诱导的不定芽成苗效果好，幼苗粗壮，叶片饱满；

步骤二：不定芽诱导培养，愈伤诱导进行诱导40天使叶片成型，将成型的幼苗转入不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养；不定芽诱导培养基为：wpm+0.3mg/lzt，ph5.8；利用樟叶越桔的叶片愈伤组织诱导不定芽，进而植株再生，建立再生体系；步骤一成型的幼苗在不定芽诱导培养基上生长40d左右后，可长至3-5cm，有4-8片叶子，长成的植株健壮，叶片深绿，长势良好；

步骤三：生根诱导，将不定芽诱导培养长成的健壮的樟叶越桔组培苗接种于生根培养基中进行培养，进行诱导生根，得到樟叶越桔生根苗，如图5所示；此处所用的生根培养基为：wmp+6-ba0.5～3.0mg/l+naa0.1～1.0mg/l，根据情况设定生根培养时间，一般为30d，幼苗经过生根诱导后，产生了大量的根，生长健壮，移栽的成活率较高。

步骤一中在进行叶片划伤处理时，需要在无菌操作台内用解剖刀除去叶尖、叶柄和叶两侧组织，得到一个长宽约1cm左右的方形叶片。

步骤一的培养条件为：培养温度23±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12；步骤二的培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h；步骤三的培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h。

在此，本发明用用1mol/lnaoh或hcl来调节ph值。

为了更好地对樟叶越桔进行诱导，在对樟叶越桔进行划伤处理时，本发明在樟叶越桔叶片的下表面进行划伤处理，并将经划伤处理的下表面平置于培养基表面，保证了诱导的成功率。

本发明以组织培养的樟叶越桔组培苗为材料，利用叶片作为外植体，进一步优化樟叶越桔的培育条件，拓宽其不定芽的再生途径，期待使用较少的外植体产生较多的不定芽，一定程度上加快了樟叶越桔的繁殖周期。建立此组培体系后，为樟叶越桔的转基因技术提供前期基础，便于将目的基因从愈伤组织转入樟叶越桔中，为获得高含量ca奠定基础，为樟叶越桔的植物资源进一步的综合开发与成分提取利用提供理论参考。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的修改或等同替换，只要不脱离本发明的技术方案的精神和范围，均涵盖在本发明的权利要求范围内。