本发明属于根肿病鉴定方法技术领域，具体涉及一种十字花科根肿病鉴定方法。
背景技术：
根肿病是威胁十字花科植物的一种世界性土传病害，该病是由芸薹根肿菌(plasmodiophorabrassicaeworonin)侵染十字花科根部，引起薄壁组织细胞大量分裂增殖且增大，进而根部逐渐形成肿瘤。根肿病专性寄生十字花科，我国主要种植的十字花科作物为大白菜，小白菜，结球甘蓝，萝卜，菜心等，根肿病的发生对十字花科作物造成非常严重的危害。
目前，国内外对根肿病的研究越来越多，无论是抗病育种，还是根肿菌生理小种的鉴定，都需要对植株做根肿病性状调查。而目前国内外都是采用传统的基质栽培方法，这种方法在采样，性状调查时存在不易清洗，根部有基质残留，需要耗费大量的时间等问题。尤其是在大田清洗根部的污水无处排放，根肿菌的休眠孢子存活时间又长达20年，这样会造成根肿菌污染的土地面积越来越多，对十字花科作物的危害也愈发严重。
根肿病鉴定过程中有效的接菌方法有很多，目前国内外报道的方法有，插入法(strelkovetal，2007)，菌土法(丁云花等，2005；胡靖峰等，2010)，注射法(donaldetal，2009)，浸根法(李茜等，2012)，浸芽法等(caoetal，2009)，这些接菌方法有着各自的优缺点，到目前为止尚未形成统一稳定的接菌方法。
随着根肿病在国内外的发病面积越来越大，病情也越来越重，对根肿菌的研究是迫在眉睫的任务，而这些研究大多数都需要做根肿病性状调查。为此，建立一个根肿病快速、精准鉴定方法是非常重要的，这样可以大大减轻试验造成的污染，减少人力物力的浪费，从而为根肿菌的研究减轻更多的工作负担。
技术实现要素：
本发明提供了一种十字花科根肿病鉴定方法，解决了传统方法不易清洗，根部有基质残留，耗时长且结果准确性差的问题，本发明是通过如下技术方案来实现的。
本发明目的是提供一种十字花科根肿病鉴定方法，包括以下步骤：
将十字花科植株采用育苗袋栽培方法进行育苗；待植株长出一片真叶后采用注射法将根肿菌菌液注射至植株根部；植株生长期间，对植株喷洒营养液；待植株根部发病，进行根肿病抗病性鉴定；
所述育苗袋栽培方法为将十字花科植株采用陶粒、沙子和珍珠岩混合基质，并配以喷洒营养液，进行育苗。
优选地，所述育苗袋栽培方法具体包括以下步骤：
把灭完菌的由泥炭、蛭石和珍珠岩混合组成的基质a装到育苗袋中，将基质喷水慢慢润湿，待基质水分吸收后将种子播到基质中，待种子发芽后，把植株定植到花盆中，花盆内装有灭完菌的粒径分别为8～15mm的陶粒、沙子和珍珠岩按质量比0.9～1.1:0.9～1.1:1组成的基质b，植株生长期间喷洒营养液，以防幼苗干枯。
优选地，所述注射法具体为：用移液器将菌液接菌到植株根部，每株的根肿菌悬浮液接菌量为1×105～1×108个孢子。
更优选地，所述根肿菌悬浮液是由以下方法制得：
取发病根瘤用清水洗净，室温下进行活化；在活化好的发病根瘤中加入无菌水，所述发病根瘤：无菌水用量比为2～4g：10ml，并用破壁磨菌机粉碎2～3次，过滤，合并滤液，充分摇匀；用血细胞计数板检测摇匀后滤液中根肿菌孢子浓度，并根据检测出的浓度用无菌水稀释至1×105～1×108个孢子/ml，制得根肿菌悬浮液。
优选地，所述营养液为阿夫道宁水培营养液。
优选地，所述根肿病抗病性鉴定包括以下具体步骤：
计算病情指数，根据病情指数计算值进行根肿病鉴定；其中，所述病情指数计算方法如式(ⅰ)所示：
病情指数＝∑[各级病株数×相对病级数]×100/(调查总株数×3)(ⅰ)
根据病情指数计算值进行根肿病鉴定标准如下：在病情指数小于等于25时，判定为抗病；病情指数大于25时为感病；
所述相对病级数为：
0级：根系正常生长，未发病；1级：侧根发病有小瘤，主根未发病；2级：主根有小瘤，或侧根有大瘤，或主根与侧根均有大瘤；3级：主根，侧根均有大瘤。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果:
(1)根部清洗方便、快捷；本发明采用陶粒、沙子、珍珠岩方便清洗的栽培介质种植，用阿夫道宁营养液为植株提供营养来源，这样根部周围的栽培介质处于松散状态，在根部采样或根肿病性状调查需要洗根时，可以很快将根部清洗干净，且不要需要太多的水；
(2)减少根部损伤，降低误差；本发明采用的栽培介质与基质有很大区别，珍珠岩、沙子、陶粒不会像传统的鉴定方法采用的基质栽培方法，基质块紧密的附着在植株根部，在清洗时会扯掉大量的须根，造成试验结果不准确；本发明鉴定方法清洗方便，且速度快，避免了须根上小瘤在清洗过程中洗掉，也大大减少了根部在清洗过程的损伤，提高试验的准确度；
(3)减少对土壤的污染；本发明减少对基质的使用，降低了洗根时的用水量，使携带根肿菌的污水和基质的排放量减少，这样可以大大减少对土壤和水资源的污染，使根肿菌污染面积的扩大的速度降低；
(4)减少人力物力的浪费；传统栽培方法使用的基质价格高且不能重复利用，而陶粒，珍珠岩，沙子栽培介质在使用后可以采用高温闷热灭菌方法，这些可以重复利用，这样大大减少了资源的浪费，而在大批量的根肿病性状调查中，较大的根瘤完全不用清洗，直接将根部的沙子、陶粒、珍珠岩轻轻抖掉就能清晰地区分发病等级，只有未发病和须根上的小瘤需要用水简单地清洗一下，不需要像传统方法调查时清洗三四遍，这样可以大大提高调查速度，减轻调查时的工作量，从而节省人力；
(5)本发明鉴定方法采用育苗袋法栽培、注射法接菌，操作简单且植株发病率、病情指数最高，鉴定方法精确。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和数据对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
为了充分说明本发明根肿病鉴定方法，我们选取了国内不同地区的根肿菌材料，并将各材料的根肿菌接种到四个不同寄主上，植株接菌6周后进行根肿病抗病性调查。
本发明使用的根肿菌材料来自国内各地区收集并扩繁得到的，且该12种根肿菌已通过传统方法完成了生理小种的鉴定，选取该12种根肿菌，使用本发明鉴定方法，通过比较两者的鉴定结果，验证本发明鉴定方法的准确性，该12种根肿菌材料具体详见表1：
表1本试验使用根肿菌来源
将表1中12种根肿菌材料制备成根肿菌悬液，具体制备方法如下。
制备实施例1
(1)取表1中各发病根瘤材料30g用清水洗净，在室温下活化24h；
(2)将活化好的根瘤，加入100ml无菌水，破壁磨菌机10s粉碎2次，8层纱布1层云母布过滤；
(3)将两次滤液放到一起，充分摇匀，用血细胞计数板检测滤液中根肿菌滤液的浓度，并根据检测出的根肿菌滤液的浓度用无菌水稀释至1×107个孢子ml-1，制得根肿菌悬浮液。
制备实施例2
(1)取表1中各发病根瘤材料20g用清水洗净，在室温下活化24h；
(2)将活化好的根瘤，加入100ml无菌水，破壁磨菌机10s粉碎2次，8层纱布1层云母布过滤；
(3)将两次滤液放到一起，充分摇匀，用血细胞计数板检测滤液中根肿菌滤液的浓度，并根据检测出的根肿菌滤液的浓度用无菌水稀释至1×105个孢子ml-1，制得根肿菌悬浮液。
制备实施例3
(1)取表1中各发病根瘤材料40g用清水洗净，在室温下活化24h；
(2)将活化好的根瘤，加入100ml无菌水，破壁磨菌机15s粉碎3次，8层纱布1层云母布过滤；
(3)将两次滤液放到一起，充分摇匀，用血细胞计数板检测滤液中根肿菌的浓度，并根据检测出的根肿菌滤液的浓度用无菌水稀释至1×108个孢子ml-1，制得根肿菌悬浮液。
上述用血细胞计数板检测滤液中根肿菌浓度的测定方法：
将上述各组根肿菌滤液充分摇匀，取10μl根肿菌滤液加入100μl的苯胺蓝溶液，加双蒸水至1ml，混匀，待染色5min，取10μl混液加到血球计数板上盖上盖玻片，在光学显微镜下观察孢子的个数，经计算得出菌液的浓度。
本发明采用的根肿病抗病性鉴定方法为：病情指数是划分大白菜品种对某一根肿菌是否抗病的标准，在病情指数小于等于25时，判定为抗病，病情指数大于25时为感病，所述病情指数计算方法如下式(ⅰ)所示：
病情指数＝∑[各级病株数×相对病级数]×100/(调查总株数×3)
(ⅰ)
所述相对病级数为：
0级：根系正常生长，未发病；
1级：侧根发病有小瘤，主根未发病；
2级：主根有小瘤，或侧根有大瘤，或主根与侧根均有大瘤；
3级：主根，侧根均有大瘤。
选用四种寄主，分别接种上述12种根瘤菌，具体实施方式如下。
实施例1
十字花科根肿病鉴定方法，包括以下步骤：
(1)将育苗袋中装入基质(基质即市场销售的园艺栽培基质，成分为泥炭、蛭石和珍珠岩以任意比例混合制得)，用喷壶喷洒水分，将基质润湿，将寄主结球甘蓝(badgershipper)18株播种到育苗袋中，设置大白菜感病品种91-12为对照，播种的数量也为18株；
(2)待badgershipper发芽后移栽到花盆中，花盆内装有灭完菌的粒径分别为8～15mm的陶粒、沙子和珍珠岩按质量比1:1:1组成的混匀物，生长期间给植株喷洒阿夫道宁水培营养液，以防干枯；移栽1周(植株长出一片真叶)后采用注射法进行接菌，将表1中类别编号为1的根肿菌接种至badgershipper和对照组中，检测根肿菌孢子浓度配制浓度为1×107个孢子/ml的孢子悬浮液，移液器将菌液接菌到植株根部，每株根肿菌悬浮液的接菌量为1ml，注意在接菌前后24h内不要浇灌营养液，以防菌液被稀释，降低植株发病率；
(3)在植株接菌6周后进行根肿病抗病性调查，此时被侵染的植株根部已经发病，形成根瘤，将植株根部轻轻拔出，把根部附着的沙子珍珠岩等轻轻抖掉，在清水中慢慢清洗根部以免使根瘤受损掉落，影响发病等级划分。
实施例2
步骤同实施例1，不同之处在于，根肿菌孢子浓度为1×105个孢子/ml，陶粒、沙子和珍珠岩质量比为0.9:0.9:1，接种类别编号为2的根肿菌。
实施例3
步骤同实施例1，不同之处在于，根肿菌孢子浓度为1×108个孢子/ml，陶粒、沙子和珍珠岩质量比为1.1:1.1:1，接种类别编号为3的根肿菌。
实施例4
步骤同实施例1，不同之处在于，接种类别编号为4的根肿菌。
实施例5
步骤同实施例1，不同之处在于，接种类别编号为5的根肿菌。
实施例6
步骤同实施例1，不同之处在于，接种类别编号为6的根肿菌。
实施例7
步骤同实施例1，不同之处在于，接种类别编号为7的根肿菌。
实施例8
步骤同实施例1，不同之处在于，接种类别编号为8的根肿菌。
实施例9
步骤同实施例1，不同之处在于，接种类别编号为9的根肿菌。
实施例10
步骤同实施例1，不同之处在于，接种类别编号为10的根肿菌。
实施例11
步骤同实施例1，不同之处在于，接种类别编号为11的根肿菌。
实施例12
步骤同实施例1，不同之处在于，接种类别编号为12的根肿菌。
实施例13
步骤同实施例1，不同之处在于，寄主为结球甘蓝(jerseyqueen)。
实施例14
步骤同实施例13，不同之处在于，接种类别编号为2的根肿菌。
实施例15
步骤同实施例13，不同之处在于，接种类别编号为3的根肿菌。
实施例16
步骤同实施例13，不同之处在于，接种类别编号为4的根肿菌。
实施例17
步骤同实施例13，不同之处在于，接种类别编号为5的根肿菌。
实施例18
步骤同实施例13，不同之处在于，接种类别编号为6的根肿菌。
实施例19
步骤同实施例13，不同之处在于，接种类别编号为7的根肿菌。
实施例20
步骤同实施例13，不同之处在于，接种类别编号为8的根肿菌。
实施例21
步骤同实施例13，不同之处在于，接种类别编号为9的根肿菌。
实施例22
步骤同实施例13，不同之处在于，接种类别编号为10的根肿菌。
实施例23
步骤同实施例13，不同之处在于，接种类别编号为11的根肿菌。
实施例24
步骤同实施例13，不同之处在于，接种类别编号为12的根肿菌。
实施例25
步骤同实施例1，不同之处在于，寄主为芜菁甘蓝(wilhelmsburger)。
实施例26
步骤同实施例25，不同之处在于，接种类别编号为2的根肿菌。
实施例27
步骤同实施例25，不同之处在于，接种类别编号为3的根肿菌。
实施例28
步骤同实施例25，不同之处在于，接种类别编号为4的根肿菌。
实施例29
步骤同实施例25，不同之处在于，接种类别编号为5的根肿菌。
实施例30
步骤同实施例25，不同之处在于，接种类别编号为6的根肿菌。
实施例31
步骤同实施例25，不同之处在于，接种类别编号为7的根肿菌。
实施例32
步骤同实施例25，不同之处在于，接种类别编号为8的根肿菌。
实施例33
步骤同实施例25，不同之处在于，接种类别编号为9的根肿菌。
实施例34
步骤同实施例25，不同之处在于，接种类别编号为10的根肿菌。
实施例35
步骤同实施例25，不同之处在于，接种类别编号为11的根肿菌。
实施例36
步骤同实施例25，不同之处在于，接种类别编号为12的根肿菌。
实施例37
步骤同实施例1，不同之处在于，寄主为芜菁甘蓝(laurentian)。
实施例38
步骤同实施例37，不同之处在于，接种类别编号为2的根肿菌。
实施例39
步骤同实施例37，不同之处在于，接种类别编号为3的根肿菌。
实施例40
步骤同实施例37，不同之处在于，接种类别编号为4的根肿菌。
实施例41
步骤同实施例37，不同之处在于，接种类别编号为5的根肿菌。
实施例42
步骤同实施例37，不同之处在于，接种类别编号为6的根肿菌。
实施例43
步骤同实施例37，不同之处在于，接种类别编号为7的根肿菌。
实施例44
步骤同实施例37，不同之处在于，接种类别编号为8的根肿菌。
实施例45
步骤同实施例37，不同之处在于，接种类别编号为9的根肿菌。
实施例46
步骤同实施例37，不同之处在于，接种类别编号为10的根肿菌。
实施例47
步骤同实施例37，不同之处在于，接种类别编号为11的根肿菌。
实施例48
步骤同实施例37，不同之处在于，接种类别编号为12的根肿菌。
实施例1～实施例48分别是四个寄主(badgershipper、jerseyqueen、wilhelmsburger和laurentian)分别接种表1中的12种根肿菌，待植株接菌后生长6周，对植株进行根肿病性状鉴定，将植株根部清洗干净，按根瘤大小划分等级，具体发病情况见表2，按williams生理小种鉴别系统进行生理小种划分，将本次鉴定结果与前人鉴定结果(即表1中已通过传统方法完成了生理小种的鉴定)对比，对比结果见表3。
表2实施例1～实施例48接种12份根肿菌后寄主发病结果
表3上述12份根肿菌生理小种鉴定结果
注：+表示寄主感病，－表示寄主抗病。
由表2和表3结果可知，本发明鉴定方法鉴定结果与前人鉴定鉴定结果一致，证明了本发明鉴定方法的准确性，另外，本发明采用陶粒、沙子、珍珠岩等方便清洗的栽培介质种植，用阿夫道宁营养液为植株提供营养来源，这样根部周围的栽培介质处于松散状态，在根部采样或根肿病性状鉴定需要洗根时，可以很快将根部清洗干净，且不要需要太多的水；本发明采用的栽培介质与基质有很大区别，珍珠岩、沙子、陶粒不会像传统的鉴定方法采用的基质栽培方法，基质块紧密的附着在植株根部，在清洗时会扯掉大量的须根，造成试验结果不准确；本发明鉴定方法清洗方便，且速度快，避免了须根上小瘤在清洗过程中洗掉，也大大减少了根部在清洗过程的损伤，提高试验的准确度。
本发明减少了对基质的使用，降低了洗根时的用水量，使携带根肿菌的污水和基质的排放量减少，这样可以大大减少对土壤和水资源的污染，使根肿菌污染面积的扩大的速度降低；传统栽培方法使用的基质价格高且不能重复利用，而陶粒，珍珠岩，沙子等栽培介质在使用后可以采用高温闷热灭菌方法，这些可以重复利用，这样大大减少了资源的浪费，而在大批量的根肿病性状鉴定中，较大的根瘤完全不用清洗，直接将根部的沙子、陶粒、珍珠岩轻轻抖掉就能清晰地区分发病等级，只有未发病和须根上的小瘤需要用水简单地清洗一下，不需要像原来鉴定时清洗三四遍，这样可以大大提高鉴定速度，减轻鉴定时的工作量，从而节省人力。
综上所述，本发明鉴定方法采用育苗袋法栽培、注射法接菌，操作简单且植株发病率、病情指数最高，鉴定方法精确。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内也意图包含这些改动和变型在内。