本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种防治稻瘟病的生防制剂及其制备方法。
背景技术：
水稻是世界上重要的粮食作物之一，全球有半数以上人口以水稻为食。水稻的种植面积约占世界粮食总种植面积的20％。稻瘟病(病菌为magnaportheoryzae，其无性世代为pyiculariaoryzae)是全世界危害最严重水稻病害之一。水稻种植国家都无法避免稻瘟病造成的损失，稻瘟病不仅会降低水稻的产量，对水稻的质量也有很大的影响。有植病专家估计，目前我国每年因稻瘟病发病直接损失稻谷300万吨。
目前稻瘟病的防治措施主要包括抗病品种选育、药剂防治和栽培管理。选育抗病品种是一种经济环保的方式，但由于稻瘟病菌的遗传背景复杂，易变异，加上抗瘟品种单一化，主栽品种的遗传同质性，使抗病品种难以跟上致病性稻瘟病菌生理小种的变异速度，常常导致一个新的具有抗瘟性的水稻品种在大面积种植几年后丧失抗性，沦为感病品种。栽培管理难以形成系统性、规范性的技术体系，因此在实际生产中难以达到理想效果。为满足生产需要，药剂防治是防治稻瘟病的常用手段，但由于化学药剂的不合理运用，稻瘟病菌对生产上常用的几种主要杀菌剂(环唑、异稻瘟净)抗药性逐渐增强，使其防效不断下降，并且给生态环境和人类健康带来了不可忽视的严重危害。
技术实现要素：
针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种防治稻瘟病的生防制剂及其制备方法，既可抑制稻瘟病的发生，又可避免化学农药所产生的毒性和残留问题，绿色、环保、高效且不易产生抗药性。
本发明的目的是提供一种防治稻瘟病的生防制剂，其包括以重量份计的以下成分：银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液20-40份、银杏叶提取物10-20份和银杏外种皮提取物5-15份；将尖孢镰刀菌经固体培养和液体培养制备得到的发酵液、银杏叶提取物和银杏外种皮提取物按所述重量份混合即得到所述生防制剂。
优选地，所述生防制剂包括以重量份计的以下成分：银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液30份、银杏叶提取物10份和银杏外种皮提取物15份。
本发明的另一目的是提供一种防治稻瘟病的生防制剂的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将尖孢镰刀菌接种于pda固体斜面培养基上培养24-48h，待菌株生长旺盛，挑取菌丝接种于pdb液体培养基，于恒温振荡培养箱中发酵培养5-7d，得到所述尖孢镰刀菌发酵液；
(2)将银杏叶干燥后粉碎过40-60目筛，再放入提取罐中，同时加入体积浓度为60-80％的乙醇提取2-3次，每次提取60-70min，合并提取液；将提取液减压蒸馏至原体积的1/5-1/10，得到浓缩液，向浓缩液中加入等体积的纯化水，沉淀12-15h，取上清液；将上清液减压干燥后上酸性氧化铝柱，用含乙酸的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压蒸馏得到流浸膏，流浸膏减压干燥，得到所述银杏叶提取物；
(3)将银杏外种皮采用90-99℃热水煎煮，每次1-2h，共煎煮2-3次，料液比为1:6-12(w/v)，将煎煮液分别过滤，合并滤液减压浓缩，将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢滴加入浓缩液中，使乙醇终浓度达到60-80％(v/v)，在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器搅拌，静置后将沉淀物再用体积浓度为80-90％的乙醇洗涤3-5次后真空干燥，得到所述银杏外种皮提取物；
(4)将尖孢镰刀菌发酵液、银杏叶提取物和银杏外种皮提取物按重量份混合均匀即得所述生防制剂。
进一步地，所述银杏内生真菌尖孢镰刀菌购自北京北纳创联生物技术研究院。
进一步地，所述步骤(1)中发酵培养时的温度为26-28℃，转速为180-200r/min。
进一步地，所述步骤(1)得到的尖孢镰刀菌发酵液中尖孢镰刀菌的菌体浓度≥1×107cfu/ml。
进一步地，所述步骤(2)提取罐中乙醇的用量为银杏叶重量的4-8倍。
进一步地，所述步骤(2)中含乙酸的乙醇为体积浓度为80-90％的乙醇和体积百分比0.1-0.5％的乙酸组成。
进一步地，所述步骤(3)中磁力搅拌器的搅拌温度为20-30℃，转速为1400-1800r/min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)银杏外种皮提取物中含有丰富的银杏酚酸和黄酮类化合物，其中银杏酚酸具有一定的抑菌能力，酚酸的烷基侧链在抑菌中起了重要作用。银杏叶提取物中的黄酮类化合物可以抑制病菌细胞内dna拓扑异构酶的活性，使菌体内核酸的代谢活动受到抑制，菌体内相关蛋白的表达受阻，从而达到抑菌杀菌作用。
(2)银杏内生真菌尖孢镰刀菌及其代谢物可激活水稻的保护酶系统。喷施含银杏内生真菌尖孢镰刀菌及其代谢物的制剂后能提高茎秆、叶片、穗器官中过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)活性以及增加脯氨酸的含量。pod活性提高可以大大增加酚氧化物的含量，并促进木质素的积累，使细胞壁增厚，从而抵抗病原的侵染和扩展，pod是细胞内重要的内源活性氧清除剂，pod活性上升，能增强水稻自身的抗病性，cat活性与水稻抗瘟性也呈一定的正相关关系，游离脯氨酸的积累也能诱导水稻抗病性的产生。
(3)银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液、银杏叶提取物和银杏外种皮提取物作为单一活性成分在实际应用中由于多种复杂因素(如ph、温度、土壤微生物环境等)导致防效不稳定，对稻瘟病的防效并不显著。将其按照一定比例复配混合后，由于银杏内生真菌尖孢镰刀菌及其代谢物与银杏叶提取物和银杏外种皮提取物两者作用靶标不一样，银杏内生真菌尖孢镰刀菌及其代谢物在于激活水稻的保护酶系统，而银杏外种皮提取物作用在于通过酚酸的强氧化性作用直接杀死稻瘟病菌，银杏叶提取物中的黄酮类化合物通过抑制病菌细胞内dna拓扑异构酶的活性抑制病菌的生长。三者复配能够增强对稻瘟病的防治效果，且能够减少稻瘟病菌对制剂的抗性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所使用的银杏内生真菌尖孢镰刀菌购自北京北纳创联生物技术研究院，银杏叶和银杏外种皮为自行采集，其他所用到的化学仪器和药品均可自常规途径购买得到。
实施例1
(1)将银杏内生真菌尖孢镰刀菌接种于pda固体斜面培养基上培养24-48h，待菌株生长旺盛，挑取菌丝接种于pdb液体培养基，于恒温振荡培养箱中26-28℃，180r/min发酵培养7d，得到尖孢镰刀菌发酵液，所述发酵液中尖孢镰刀菌的菌体浓度≥1×107cfu/ml；
(2)将银杏叶干燥后粉碎过40目筛，再放入提取罐中，同时加入银杏叶重量4倍，体积浓度为60％的乙醇提取2次，每次提取70min，合并提取液；将提取液减压蒸馏至原体积的1/5，得到浓缩液，向浓缩液中加入等体积的纯化水，沉淀12-15h，取上清液；将上清液减压干燥后上酸性氧化铝柱，用含乙酸的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压蒸馏得到流浸膏，流浸膏减压干燥，得到银杏叶提取物；所述含乙酸的乙醇为体积浓度为80％的乙醇和体积百分比0.1％的乙酸组成；
(3)将银杏外种皮采用90-99℃热水煎煮，每次1h，共煎煮3次，料液比为1:6(w/v)，将煎煮液分别过滤，合并滤液减压浓缩，将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢滴加入浓缩液中，使乙醇终浓度达到60％(v/v)，在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器搅拌，搅拌温度为20℃，转速为1800r/min，静置后将沉淀物再用体积浓度为80％的乙醇洗涤3-5次后真空干燥，得到银杏外种皮提取物；
(4)将银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液20份、银杏叶提取物20份和银杏外种皮提取物10份混合均匀即得所述生防制剂。
实施例2
(1)将银杏内生真菌尖孢镰刀菌接种于pda固体斜面培养基上培养24-48h，待菌株生长旺盛，挑取菌丝接种于pdb液体培养基，于恒温振荡培养箱中26-28℃，200r/min发酵培养5d，得到尖孢镰刀菌发酵液，所述发酵液中尖孢镰刀菌的菌体浓度≥1×107cfu/ml；
(2)将银杏叶干燥后粉碎过50目筛，再放入提取罐中，同时加入银杏叶重量6倍，体积浓度为80％的乙醇提取3次，每次提取60min，合并提取液；将提取液减压蒸馏至原体积的1/10，得到浓缩液，向浓缩液中加入等体积的纯化水，沉淀12-15h，取上清液；将上清液减压干燥后上酸性氧化铝柱，用含乙酸的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压蒸馏得到流浸膏，流浸膏减压干燥，得到银杏叶提取物；所述含乙酸的乙醇为体积浓度为85％的乙醇和体积百分比0.3％的乙酸组成；
(3)将银杏外种皮采用90-99℃热水煎煮，每次2h，共煎煮2次，料液比为1:8(w/v)，将煎煮液分别过滤，合并滤液减压浓缩，将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢滴加入浓缩液中，使乙醇终浓度达到70％(v/v)，在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器搅拌，搅拌温度为25℃，转速为1600r/min，静置后将沉淀物再用体积浓度为90％的乙醇洗涤3-5次后真空干燥，得到银杏外种皮提取物；
(4)将银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液30份、银杏叶提取物10份和银杏外种皮提取物15份混合均匀即得所述生防制剂。
实施例3
(1)将银杏内生真菌尖孢镰刀菌接种于pda固体斜面培养基上培养24-48h，待菌株生长旺盛，挑取菌丝接种于pdb液体培养基，于恒温振荡培养箱中26-28℃，190r/min发酵培养6d，得到尖孢镰刀菌发酵液，所述发酵液中尖孢镰刀菌的菌体浓度≥1×107cfu/ml；
(2)将银杏叶干燥后粉碎过60目筛，再放入提取罐中，同时加入银杏叶重量8倍，体积浓度为70％的乙醇提取2次，每次提取70min，合并提取液；将提取液减压蒸馏至原体积的1/8，得到浓缩液，向浓缩液中加入等体积的纯化水，沉淀12-15h，取上清液；将上清液减压干燥后上酸性氧化铝柱，用含乙酸的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压蒸馏得到流浸膏，流浸膏减压干燥，得到银杏叶提取物；所述含乙酸的乙醇为体积浓度为90％的乙醇和体积百分比0.5％的乙酸组成；
(3)将银杏外种皮采用90-99℃热水煎煮，每次1h，共煎煮3次，料液比为1:10(w/v)，将煎煮液分别过滤，合并滤液减压浓缩，将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢滴加入浓缩液中，使乙醇终浓度达到80％(v/v)，在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器搅拌，搅拌温度为30℃，转速为1400r/min，静置后将沉淀物再用体积浓度为85％的乙醇洗涤3-5次后真空干燥，得到银杏外种皮提取物；
(4)将银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液40份、银杏叶提取物15份和银杏外种皮提取物5份混合均匀即得所述生防制剂。
实施例4
(1)将银杏内生真菌尖孢镰刀菌接种于pda固体斜面培养基上培养24-48h，待菌株生长旺盛，挑取菌丝接种于pdb液体培养基，于恒温振荡培养箱中26-28℃，180r/min发酵培养7d，得到尖孢镰刀菌发酵液，所述发酵液中尖孢镰刀菌的菌体浓度≥1×107cfu/ml；
(2)将银杏叶干燥后粉碎过40目筛，再放入提取罐中，同时加入银杏叶重量6倍，体积浓度为70％的乙醇提取3次，每次提取60min，合并提取液；将提取液减压蒸馏至原体积的1/5，得到浓缩液，向浓缩液中加入等体积的纯化水，沉淀12-15h，取上清液；将上清液减压干燥后上酸性氧化铝柱，用含乙酸的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压蒸馏得到流浸膏，流浸膏减压干燥，得到银杏叶提取物；所述含乙酸的乙醇为体积浓度为80％的乙醇和体积百分比0.3％的乙酸组成；
(3)将银杏外种皮采用90-99℃热水煎煮，每次2h，共煎煮2次，料液比为1:12(w/v)，将煎煮液分别过滤，合并滤液减压浓缩，将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢滴加入浓缩液中，使乙醇终浓度达到60％(v/v)，在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器搅拌，搅拌温度为20℃，转速为1800r/min，静置后将沉淀物再用体积浓度为90％的乙醇洗涤3-5次后真空干燥，得到银杏外种皮提取物；
(4)将银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液25份、银杏叶提取物10份和银杏外种皮提取物10份混合均匀即得所述生防制剂。
实施例5
(1)将银杏内生真菌尖孢镰刀菌接种于pda固体斜面培养基上培养24-48h，待菌株生长旺盛，挑取菌丝接种于pdb液体培养基，于恒温振荡培养箱中26-28℃，190r/min发酵培养6d，得到尖孢镰刀菌发酵液，所述发酵液中尖孢镰刀菌的菌体浓度≥1×107cfu/ml；
(2)将银杏叶干燥后粉碎过50目筛，再放入提取罐中，同时加入银杏叶重量8倍，体积浓度为80％的乙醇提取2次，每次提取70min，合并提取液；将提取液减压蒸馏至原体积的1/10，得到浓缩液，向浓缩液中加入等体积的纯化水，沉淀12-15h，取上清液；将上清液减压干燥后上酸性氧化铝柱，用含乙酸的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压蒸馏得到流浸膏，流浸膏减压干燥，得到银杏叶提取物；所述含乙酸的乙醇为体积浓度为85％的乙醇和体积百分比0.5％的乙酸组成；
(3)将银杏外种皮采用90-99℃热水煎煮，每次1h，共煎煮3次，料液比为1:8(w/v)，将煎煮液分别过滤，合并滤液减压浓缩，将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢滴加入浓缩液中，使乙醇终浓度达到70％(v/v)，在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器搅拌，搅拌温度为25℃，转速为1600r/min，静置后将沉淀物再用体积浓度为85％的乙醇洗涤3-5次后真空干燥，得到银杏外种皮提取物；
(4)将银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液35份、银杏叶提取物15份和银杏外种皮提取物15份混合均匀即得所述生防制剂。
实施例6
(1)将银杏内生真菌尖孢镰刀菌接种于pda固体斜面培养基上培养24-48h，待菌株生长旺盛，挑取菌丝接种于pdb液体培养基，于恒温振荡培养箱中26-28℃，200r/min发酵培养5d，得到尖孢镰刀菌发酵液，所述发酵液中尖孢镰刀菌的菌体浓度≥1×107cfu/ml；
(2)将银杏叶干燥后粉碎过60目筛，再放入提取罐中，同时加入银杏叶重量4倍，体积浓度为60％的乙醇提取3次，每次提取60min，合并提取液；将提取液减压蒸馏至原体积的1/8，得到浓缩液，向浓缩液中加入等体积的纯化水，沉淀12-15h，取上清液；将上清液减压干燥后上酸性氧化铝柱，用含乙酸的乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压蒸馏得到流浸膏，流浸膏减压干燥，得到银杏叶提取物；所述含乙酸的乙醇为体积浓度为90％的乙醇和体积百分比0.1％的乙酸组成；
(3)将银杏外种皮采用90-99℃热水煎煮，每次2h，共煎煮2次，料液比为1:10(w/v)，将煎煮液分别过滤，合并滤液减压浓缩，将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢滴加入浓缩液中，使乙醇终浓度达到80％(v/v)，在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器搅拌，搅拌温度为30℃，转速为1400r/min，静置后将沉淀物再用体积浓度为80％的乙醇洗涤3-5次后真空干燥，得到银杏外种皮提取物；
(4)将银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液30份、银杏叶提取物20份和银杏外种皮提取物5份混合均匀即得所述生防制剂。
对比例1为施用清水的空白对照。
对比例2为施用常规化学农药40％稻瘟灵ec(×500倍液)的对照。
对比例3与实施例1的区别在于仅施用银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液。
对比例4与实施例1的区别在于仅施用银杏叶提取物。
对比例5与实施例1的区别在于仅施用银杏外种皮提取物。
对比例6与实施例1的区别在于仅施用银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液和银杏叶提取物。
对比例7与实施例1的区别在于仅施用银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液和银杏外种皮提取物。
对比例8与实施例1的区别在于仅施用银杏叶提取物和银杏外种皮提取物。
采用水稻活体接种法接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液(浓度为1×105个/ml)诱发稻瘟病，分别施用以上6个实施例和8个对比例中的药剂，每种处理方式3钵，每钵30株。接种后10d对稻瘟病发病率和病情指数进行调查，同时进行防治稻瘟病效果评价。
表1不同处理下对稻瘟病防治效果
由上表数据可知，与仅施等量清水的对比例1和施用常规化学农药的对比例2相比，施用本发明生防制剂的实施例1-6中稻瘟病的发病率和病情指数显著降低，其中稻瘟病发病率平均降低82.63％和10.83％，病情指数平均降低91.32％和54.69％，相对防效均达到90％以上，说明本发明的生防制剂对稻瘟病具有良好的防治效果。
与实施例1相比，仅施用银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液的对比例3和仅施用银杏外种皮提取物的对比例5处理下发病率和病情指数均较高，相对防效仅有28.19％和13.58％；仅施用银杏叶提取物的对比例4对稻瘟病有一定的防治效果，相对防效达到55.14％，但还是低于40％稻瘟灵的防效。采用其中任意两种成分复配的对比例6-8中，施用银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液和银杏叶提取物的对比例6和施用银杏叶提取物和银杏外种皮提取物的对比例8效果接近，施用银杏内生真菌尖孢镰刀菌发酵液和银杏外种皮提取物的对比例7防治效果较差，相对防效仅有21.38％，说明本发明生防制剂中的单独一种或两种成分复配均有一定的稻瘟病防治效果，但效果仍低于常规的化学防治，也低于本发明的生防制剂，本发明采用特定比例复配的生防制剂能协同作用，极大提高对稻瘟病的防治效率，且不易产生抗药性，具有一定的应用前景。