一种高油酸油菜核不育系的选育方法及其应用与流程

本发明属于油菜育种技术领域，尤其涉及一种高油酸油菜核不育系的选育方法及其应用。

背景技术：

菜籽含油量是一个受各类脂肪酸途径调控的数量性状，含油量与油酸含量呈显著正相关。油酸是天然的一种不饱和脂肪酸，有较高的营养价值，热稳定性好。食用上，油酸可以降低人体血液中低密度脂蛋白的浓度，对人体心血管有益。工业上，高油酸油能有效甲酯化，生产的生物柴油品质更好。

9012a是陈凤祥发现的一种细胞核核不育类型，可以产生全不育群体，解决了生产上需要剔除50％可育株的困境。目前研究认为其调控模型为双隐性上位互作核不育模型，在此模型下，9012a育性受ms3/ms3和ms4(显隐性ms4^a>ms4^b>ms4^c，ms4^b为不育基因)两位点控制，不育植株基因型为ms3ms3ms4^bms4^b和ms3ms3ms4^bms4^c。但是，针对这两个位点开发的基因特异标记并将其有效用于高油酸核不育系尚未见报道。

因此，开发相关的分子标记，在育种过程中配合分子标记的方法筛选目标单株进行育种，对提高选择效率，缩短育种年限具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高油酸油菜核不育系的选育方法及其应用。

本发明是这样实现的，一种高油酸油菜核不育系的选育方法，以高油酸含量品系与普通油酸含量品系杂交；后代与核不育系统里全不育株杂交，并结合分子标记鉴定、气相色谱分析以及基因芯片，选育非转基因高油酸核不育材料。

进一步，所述分子标记包括等位基因特异性标记ms3/ms3标记，引物序列见seqidno:1至seqidno:4。

进一步，所述分子标记包括ms4^b/ms4^c标记，引物序列见seqidno:5和seqidno:6。

进一步，所述分子标记包括油酸kasp标记，引物序列见seqidno:7至seqidno:9。

进一步，所述核不育系统里全不育株为14甲4028-1。

进一步，所述高油酸含量品系为油酸含量大于75％的油菜品系。

进一步，所述普通油酸含量品系为油酸含量小于69％的油菜品系或品种。

如权利要求1-7任一所述的一种高油酸油菜核不育系的选育方法在高油酸油菜核不育系油菜育种的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明利用油酸含量大于75％的品系，通过与油酸含量小于69％的优良油菜品系或品种杂交，再和核不育系统里全不育株杂交，通过分子标记鉴定、气象色谱分析和结合后代农艺性状观察，可以选育出油酸含量稳定大于75％的非转基因高油酸核不育材料。

本发明为选育优良三系高油酸油菜品种提供了一种简单、快速、有效的方法。利用该方法可进一步改良菜籽油的品质和提高产量，提高菜籽油的市场价值和供给，为高端食用油生产企业提供充足优质原料，降低了生产成本，提高企业经济效益和市场竞争力。

附图说明

图1是等位基因特异标记m3c9-1f/1r和m3c9-4f/2r的开发设计；

图2是ms3/ms3等位基因特异引物pcr检测；

图3是ms4基因连锁区段差异；

图4是kasp标记开发；

图5是核不育系育种技术路线；

图6是背景回复率柱形图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种高油酸油菜核不育系的选育方法及其应用，具体如下各实施例所示。

实施例1分子标记的开发与验证

1.ms3/ms3标记的开发与验证

本实施例中对bnms3位点基因序列以及对应的野生型bnc9.tic40和同源基因bna10.tic40之间的序列进行分析，序列比对结果见图1所示，其中表示引物起点位置和终点位置；→表示m3c9-4f/2r序列；→表示m3c9-1f/1r序列。针对bnms3在1200至1222处的差异，bnc9.tic40在1630至2050处的差异，开发了arms-pcr等位基因特异性标记m3c9-1f/1r和m3c9-4f/2r双重pcr体系，引物序列如下：

m3c9-1f：5'-ctgaagcttctttaactgtatgatgc-3'，见seqidno:1；

m3c9-1r：5'-tagagggaacaatctagatgag-3'，见seqidno:2；

m3c9-4f：5'-ggacatgtttttgttttttgg-3'，seqidno:3；

m3c9-2r：5'-aggttgtggcttagacacaggag-3'，seqidno:4。

pcr体系及程序如下：

新标记对ms3/ms3等位基因的扩增产物大小相差141bp，用琼脂糖凝胶能很好的区分两者，用其检测已知基因型的3个对照，结果与预期基因带型一致，如图2所示，其中1-3引物：m3c9-1f/1r，基因型：ms3ms3，ms3ms3，ms3ms3；4-6引物：m3c9-4f/2r，基因型：ms3ms3，ms3ms3，ms3ms3；7-9引物：m3c9-1f/1r和m3c9-4f/2r，基因型：ms3ms3，ms3ms3，ms3ms3。

用开发的双重pcr体系检测中双9号和华双5号材料的三系(不育系和恢复系、临时保持系)进行验证。两型系中ms3ms3:ms3ms3的比例为1:1，临时保持系里面只含有ms3ms3，结果符合预期。用其检测阳光2009和15苗15等群体不育株表型验证准确。

2.ms4^b/ms4^c标记的开发与验证

对bnms4位点基因连锁序列进行分析，以zs11为参考基因组，克隆了ms4^b和ms4^c的连锁区段，见图4，其中a:不育株(ms4bms4b)c:临时保持株(ms4cms4c)，zs11:中双11。针对序列上的差异，开发了分子标记7p-2f/2r，引物序列如下：

7p-2f：5'-atctactctagggttttcatctac-3'，seqidno:5；

7p-2r：5'-ggtctatgggtgagggtaag-3'，seqidno:6。

pcr体系和扩增程序如下：

新标记对ms4^b和ms4^c的扩增大小相差78bp，用琼脂糖凝胶(较高浓度2％)能很好的区分两者。用其检测中双9号和华双5号材料的三系(不育系和恢复系、临时保持系进行验证)。两型系中只含有ms4^bms4^b基因型，临时保持系里面只含有ms4^cms4^c，结果符合预期。用其检测阳光2009和15苗15等群体不育株表型验证准确。

3.油酸kasp标记的开发

根据bna5.fad2和野生型bna5.fad2序列，并参考同源拷贝bnc5.fad2的序列，见图4，针对序列上的差异，开发了能同时区分bna5.fad2和bna5.fad2的kasp标记ll-2f/lh-1f/ll-1r，引物序列如下：

ll-2f：5'-gaaggtgaccaagttcatgctttcagttcactctcggct-3'，seqidno:7；

lh-1f：5'-gaaggtcggagtcaacggattcagttcactctcggcagc-3'，seqidno:8；

ll-1r：5'-cgttgaaggctaagtacaaa-3'，seqidno:9。

pcr体系和扩增程序如下：

*引物混合液制备：将ll-2f、lh-1f分别制备成36um溶液，ll-1r制备成90um溶液，然后三种引物按体积比1:1:1混匀为引物混合液。

对已经得到验证的植株(纯合低油酸和纯合高油酸、油酸杂合)进行验证，结果一致符合预期。

实施例2高油酸油菜核不育系的选育

1.本发明的育种路线见图5。本发明育种路线图中前景选择鉴定的目标基因型为高油酸的ms3ms3ms4^bms4^b(纯合不育株a)和ms3ms3ms4^bms4^b(保持株b)以及ms3ms3ms4^cms4^c(临时保持株c)。背景选择是基于前景选择的结果，对长势和形态一致的中选单株使用6k育种芯片(中玉金公司出品)标记分析，以轮回亲本为参照，同时比较abc三系的遗传相似性，选取遗传相似性较好的单株进入下一个世代。本发明通过分子标记鉴定、气相色谱分析和结合后代农艺性状观察，最终选育出油酸含量稳定大于75％的非转基因高油酸核不育材料。具体选育过程如下：

(1)首先，利用油酸含量大于75％的品系甲a254(2012年测定的油酸含量为78％。该材料的来源参见：中国发明专利授权；专利权人：华中农业大学；专利号zl2009102734352；发明名称：甘蓝型油菜高油酸分子标记及制备方法与应用；公开号cn101824472a；公开日2010.09.08)，与油酸含量小于69％的优良油菜品系或品种中双9号(中国农业部主管，全国农作物品种审定委员会审定，国审油2005014)杂交，得到f1。

(2)之后，利用上述得到的f1材料和核不育系统里全不育株14甲4028-1(基因型为ms3ms3ms4^bms4^c)杂交，得到f1。

(3)利用高油酸分子标记对上步f1的每一个株系的幼苗进行标记分析，可以在苗期获得每个株系的油酸基因型(具体方法已在专利号为zl2009102734352文献中有详细描述，中双9号用的油酸标记是holly)。通过标记分析可以减少花期及后续种子分析的工作量，提高鉴定的准确性。

(4)利用气相色谱仪测定每个株系种子的油酸含量，测定方法参照：杨燕宇等.无芥酸甘蓝型油菜十八碳不饱和脂肪酸含量的qtl定位.作物学报，(2011).37(8):1342-1350，确认每个初选系的油酸含量。

(5)种植上步所得f1，利用实施例1开发的分子标记及pcr体系及程序对f1代进行前景选择，选择目标单株与轮回亲本中双9号(zs9)亲本杂交。各代植株中参照育种路线图中的要求，进行前景或背景选择，直到获得高世代群体(bc3f1)。

(6)在高世代群体(bc3f1)通过自交获得(bc3f2)群体，种植(bc3f2)群体获得高背景回复率的不育系、临保系和恢复系。

2.育性分离比的观查

对实验材料中两型系(不育系和保持系，a指代不育系，b指代保持系)育性分离进行观察和统计，和理论分离比无明显差异，结果见下表。

3.回交群体后代遗传背景回复率分析

利用油菜6k基因芯片对群体后代的遗传背景回复率进行分析，计算公式为：

背景回复率计算公式g(g)＝[l+x(g)]/2l。

其中，x(g)表示与亲本带型相同的分子标记数，l为具有多态性的分子标记数(总标记数)。

在上表以zs9为轮回亲本的bc2(ab)6群体中，共检测了57个单株，按其背景回复率可分为5个区间，其背景回复率范围为90％～92％，见图6。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种高油酸油菜核不育系的选育方法及其应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(m3c9-1f)

<400>1

ctgaagcttctttaactgtatgatgc26

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(m3c9-1r)

<400>2

tagagggaacaatctagatgag22

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(m3c9-4f)

<400>3

ggacatgtttttgttttttgg21

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(m3c9-2r)

<400>4

aggttgtggcttagacacaggag23

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(7p-2f)

<400>5

atctactctagggttttcatctac24

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(7p-2r)

<400>6

ggtctatgggtgagggtaag20

<210>7

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(ll-2f)

<400>7

gaaggtgaccaagttcatgctttcagttcactctcggct39

<210>8

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(lh-1f)

<400>8

gaaggtcggagtcaacggattcagttcactctcggcagc39

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(ll-1r)

<400>9

cgttgaaggctaagtacaaa20