一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法及其应用与流程

本发明涉及肿瘤移植小鼠模型的建立领域，具体涉及一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术：

恶性神经鞘瘤亦称为神经肉瘤，来源于周围神经鞘，由恶性神经母细胞组成，多由神经纤维瘤或神经鞘瘤恶变而来。其恶性程度高，易发生肺转移，致残率与死亡率极高，预后差。恶性神经鞘瘤为社会乃至国家带来了沉重的经济负担，带来了更大的社会问题。因为恶性神经鞘瘤异质性的存在，既往基于恶性神经鞘瘤细胞系的基础研究结果很少可以在临床恶性神经鞘瘤患者体内得到重现，加上疾病发病率低，就导致了临床恶性神经鞘瘤诊治水平的滞后。

发明专利申请cn201710822683.2公开了人nf2^-/-前庭神经鞘瘤施旺细胞系的建立方法及其细胞系。该建立方法包括：a、对肿瘤中的施万细胞进行分离，获得人nf2^-/-的原代施万细胞进行原代培养；b、建立免疫缺陷小鼠坐骨神经人nf2^-/-原代施万细胞移植瘤模型；c、从小鼠坐骨神经上筛选直径大于1cm的移植瘤；d、分离施万细胞，进行原代细胞培养；e、进行连续5代以上传代培养；f、在筛选获得与人nf2^-/-的原代施万细胞、移植瘤原代细胞株细胞形态及主要生物学特征一致，并且能无限传代的nf2^-/-前庭神经施旺细胞。

肿瘤模型是肿瘤研究的重要载体。研究发现，细胞在传代过程中不断适应体外环境，生物学特点与在体肿瘤细胞不符，细胞系异种移植模型与患者本身肿瘤存在较大一致性，这导致抗肿瘤药物临床试验的失败率高。

人源性肿瘤异种移植(patientderivedxenograft，pdx)模型是一种体内模型，通过将病人的新鲜肿瘤组织处理后直接移植到免疫缺陷小鼠上，依靠小鼠提供的环境生长与逐步传代，能以小鼠为载体大量扩增患者肿瘤组织。pdx模型有如下优点：首先，其相当于一个模型对应一个病人，能很好地反应不同个体间肿瘤的差异性，相较于传统模型更能够反应临床病人的实际情况；其次，pdx模型可以进行传代，并且传代的肿瘤组织能够和初始肿瘤组织在基因拷贝数、基因突变和表达模式等保持高度的一致性，相当于对于病人肿瘤样本进行了扩增，这就为药物筛查和病人患病机制研究提供了很好的条件；再次，pdx培养的肿瘤块，可以冻存起来复苏之后依然能够构建新的pdx模型，相当于构建了不同病人的肿瘤活体库。

现有的技术主要是通过将新鲜恶性神经鞘瘤组织进行切碎处理或进行细胞匀浆化处理后，在皮下建模。

技术实现要素：

但将新鲜的恶性神经鞘瘤组织匀浆处理后被认为破坏了肿瘤组织本身的微环境，不能良好的保持肿瘤与周围间质与患者的一致性。此外，恶性神经鞘瘤来源于神经鞘，相比于皮下建模，原位建模更能良好模拟肿瘤发生环境。本专利成功建立了组织块移植方式，较好的保留了肿瘤与周边间质的稳定关系，成功建立了恶性神经鞘瘤的皮下建模和神经鞘原位建模，保留了模型肿瘤生长环境与患者肿瘤的一致性。

因此，本发明首先提供一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，所述方法包括先采集恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将新鲜的患者肿瘤组织块异种皮下移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种皮下移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将采集到的新鲜的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的皮下，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。

本发明还提供一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，所述方法包括先采集恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将新鲜的患者肿瘤组织块异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种原位移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将采集到的新鲜的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的神经鞘中，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。

在一种具体的实施方式中，所述皮下移植包括在小鼠腋下做皮肤切口，将肿瘤组织植入皮下后缝合手术切口；所述原位移植包括先在小鼠的腋下神经鞘或坐骨神经鞘处作皮肤切口，分离神经鞘并开口，将患者肿瘤组织块植入神经鞘中，然后缝合手术切口。

在一种具体的实施方式中，植入小鼠体内的所述恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块的单边长度小于等于3mm，优选小于等于1mm。

在一种具体的实施方式中，皮下移植或原位移植时小鼠的体重为8～20g，优选为12～15g，所述无菌孵育液中还包含抗生素，优选所述无菌孵育液中包含抗生素和dmem培养基或rpmi-1640培养基，更优选所述抗生素包含青霉素和链霉素。

在一种具体的实施方式中，所述免疫缺陷小鼠为nod/scid小鼠。

在一种具体的实施方式中，所述方法还包括采用小动物活体成像仪观察小鼠体内恶性神经鞘瘤大小，优选还采用小动物活体成像仪观察肿瘤是否转移到小鼠的内脏。

在一种具体的实施方式中，所述方法还包括饲养小鼠使得其体内肿瘤生长后解剖小鼠，剥离瘤体得到p0代肿瘤瘤体，取p0代肿瘤瘤体异种皮下移植或异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内得到p1代肿瘤瘤体，可选地取p1代肿瘤瘤体异种皮下移植或异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内得到p2代肿瘤瘤体，以此类推传代；优选所述方法还包括将部分p0代肿瘤瘤体程序降温并保存在液氮中，以及可选地包括将部分p1和p2代肿瘤瘤体程序降温并保存在液氮中。

本发明还提供一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，所述方法包括在无菌条件下将新鲜的小鼠模型中的p0代恶性神经鞘瘤肿瘤组织、p1代恶性神经鞘瘤肿瘤组织或p2代恶性神经鞘瘤肿瘤组织异种皮下移植或异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种皮下移植或异种原位移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将所述恶性神经鞘瘤肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将所述恶性神经鞘瘤肿瘤组织块植入小鼠皮下或神经鞘中，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。

本发明还提供一种如上所述方法得到的小鼠模型在筛选预防或治疗恶性神经鞘瘤药物中的应用。

本发明还提供一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括先复苏保存在液氮环境中的恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将复苏的患者肿瘤组织块异种皮下移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种皮下移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将复苏的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的皮下，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。

本发明还提供一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括先复苏保存在液氮环境中的恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，再在无菌条件下将复苏的患者肿瘤组织块异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种原位移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将复苏的患者肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将患者肿瘤组织块植入小鼠的神经鞘中，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。

在一种具体的实施方式中，所述方法还包括对采集到的恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块进行程序降温和液氮保存的过程以及快速升温复苏的过程。

在一种具体的实施方式中，所述恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块保存在含dmso、fbs和neaa的dmem中，三段以上程序降温至液氮温度，并在液氮温度中保存，所述快速升温复苏是指将冻存组织放至36～38℃的恒温水浴中进行复苏。

在一种具体的实施方式中，所述皮下移植包括在小鼠腋下做皮肤切口，将肿瘤组织植入皮下后缝合手术切口；所述原位移植包括先在小鼠的腋下神经鞘或坐骨神经鞘处作皮肤切口，分离神经鞘并开口，将患者肿瘤组织块植入神经鞘中，然后缝合手术切口。

在一种具体的实施方式中，皮下移植或原位移植时小鼠的体重为8～20g，优选为12～15g，所述无菌孵育液中还包含抗生素，优选所述无菌孵育液中包含抗生素和dmem培养基或rpmi-1640培养基，更优选所述抗生素包含青霉素和链霉素。

在一种具体的实施方式中，所述免疫缺陷小鼠为nod/scid小鼠，植入小鼠体内的所述恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块的单边长度小于等于3mm，优选小于等于1mm。

在一种具体的实施方式中，还包括采用小动物活体成像仪观察小鼠体内恶性神经鞘瘤大小，优选还采用小动物活体成像仪观察肿瘤是否转移到小鼠的内脏。

在一种具体的实施方式中，所述方法还包括饲养小鼠使得其体内肿瘤生长后解剖小鼠，剥离瘤体得到p0代肿瘤瘤体，取p0代肿瘤瘤体异种皮下移植或异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内得到p1代肿瘤瘤体，可选地取p1代肿瘤瘤体异种皮下移植或异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内得到p2代肿瘤瘤体，以此类推传代；优选所述方法还包括将部分p0代肿瘤瘤体程序降温并保存在液氮中，以及可选地包括将部分p1和p2代肿瘤瘤体程序降温并保存在液氮中。

本发明还提供一种恶性神经鞘瘤异种移植小鼠模型的构建方法，所述方法包括在无菌条件下将冻存在液氮环境中并复苏的小鼠模型中的p0代恶性神经鞘瘤肿瘤组织、p1代恶性神经鞘瘤肿瘤组织或p2代恶性神经鞘瘤肿瘤组织异种皮下移植或异种原位移植进免疫缺陷小鼠体内，所述异种皮下移植或异种原位移植包括选用年龄在2～6周的免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致，将所述恶性神经鞘瘤肿瘤组织块浸泡在含胎牛血清的无菌孵育液中，小鼠麻醉后固定，将所述恶性神经鞘瘤肿瘤组织块植入小鼠皮下或神经鞘中，缝合切口，饲养小鼠使得其体内肿瘤生长。

所述饲养小鼠具体为在spf级环境下饲养小鼠。

本发明至少具有如下有益效果：

本发明利用与患者原发肿瘤同质性更好的pdx模型，其可以深入探讨恶性神经鞘瘤发病机制，基于pdx研发的成果可在患者体内得到较好的重复，同时可以大量扩增临床患者体内有限的恶性神经鞘瘤样本，使用异种移植小鼠代替临床患者进行不同组合药物筛选，从而选择最合适的药物，大大提高有效性并降低药物副作用。

本发明pdx模型建立与应用可有望提高临床恶性神经鞘瘤治疗的有效性和患者的预后，防止患者致残甚至死亡而带来极大的医疗社会负担，减少治疗费用及政府财政支出，这些方面都具有重大的现实意义，具有极大的经济效益。

此外，恶性神经鞘瘤研究滞后，本身可用来研究的动物模型很少，且与临床差别很大，此原位种植pdx模型，可以更好的反应患者实际情况，为恶性神经鞘瘤的基础研究、药物筛选提供更好的动物模型。也就是说，相比于皮下建模，原位建模情况更真实，筛选出来的药物方案能更好地用在患者身上，且原位建模理论上来说比皮下建模会更容易发生肿瘤转移。

附图说明

图1为患者病理报告照片。

图2为肿瘤组织块在免疫缺陷小鼠体内进行pdx建模的照片。

图3为新鲜的患者肿瘤组织块原代细胞培养成功的照片。

具体实施方式

经医院伦理委员会审核批准，样本收集前患者均签署知情同意书，采集到的组织经过组织病理学检查，经病理确诊的恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织块，保存在无菌生理盐水中，置于冰上。将组织块分为3部分，第1部分无菌条件下直接处理(详见下文)异种移植进免疫缺陷小鼠体内；第2部分置入加入10％dmso(二甲基亚砜)，90％fbs(胎牛血清)和1％neaa(非必需氨基酸)的dmem(一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)中，梯度冷冻至-80度，置入液氮中保存；第3部分放入液氮中速冻，然后置入液氮中保存。其中，第1部分用于建模，第二部分用于复苏和接种，第三部分用于送检做基因检测。

实施例

皮下接种：选用4周龄nod/scid小鼠10只，nod/scid小鼠即非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠，小鼠性别与患者性别保持一致(以免受到一些未知的激素干扰)，体重约12-15g，将新鲜肿瘤组织(或经液氮冻存和复苏后的恶性神经鞘瘤患者肿瘤组织)浸泡在纯fbs+青霉素和链霉素的无菌孵育液中(青霉素的终浓度为100u/ml，链霉素的终浓度为100u/ml)，用无菌剪刀切成1*1*1mm小块。小鼠麻醉后固定，在右侧近腋下处作皮肤切口，将肿瘤组织块植入皮下(p0)，缝合手术切口。每天观察小鼠肿瘤生长情况。肿瘤生长至直径超过5mm时。每周用游标卡尺测量2次瘤体并记录瘤体长(a)与宽(b)，计算肿瘤体积(v＝a*b²/2)。同时采用小动物活体成像仪观察内脏转移情况，待瘤体体积v增长至1500mm³时或42d后解剖动物，剥离瘤体称重，部分瘤块接种传代，其余置入液氮中保存。

原位神经鞘植入：选用4周龄nod/scid小鼠10只，小鼠性别与患者性别保持一致，体重约12-15g，将新鲜肿瘤组织(或液氮保存并复苏后的肿瘤组织)浸泡在纯fbs+青霉素和链霉素的无菌孵育液中(青霉素的终浓度为100u/ml，链霉素的终浓度为100u/ml)，用无菌剪刀剪切成1*1*1mm小块，小鼠麻醉后固定，在腋下神经鞘或坐骨神经鞘处作皮肤切口，分离神经鞘并开口，将患者肿瘤组织块植入鞘中(p0)，张力不宜太大，缝合手术切口。术后小鼠置于37℃温床上直至复苏，常规可腹腔给予青霉素预防手术后感染。每天观察小鼠肿瘤生长情况。待种植处皮肤肿胀，每3周采用小动物活体成像仪观察恶性神经鞘瘤大小及内脏转移情况(肿瘤是否转移到小鼠的内脏)，待瘤体体积增长至1500mm³时或42d后解剖动物，剥离瘤体称重，部分瘤块接种传代，其余置入液氮中保存。液氮中保存组织块或整个瘤体的过程包括程序降温，具体是4℃、-20℃、-80℃(专用冷冻冰箱)和液氮这几个温度梯度。

恶性神经鞘瘤异种移植小鼠肿瘤组织的传代：取长势良好的p0代异种移植接种成瘤小鼠，待瘤体体积增长至1500mm³时或42d时，处死小鼠，完整剥离肿瘤，同前所述接种于10只nod/scid小鼠腋下皮肤、腋下神经鞘、坐骨神经鞘等(p1)，每天观察小鼠肿瘤生长情况，同前用游标卡尺测量瘤体长、宽，计算瘤体体积，小动物活体成像仪观察内脏转移情况，42d后解剖动物，剥离瘤体称重，部分瘤块以此类推传代(p2、p3等)，其余梯度降温并置入液氮中保存。

恶性神经鞘瘤原代及传代肿瘤组织复苏接种：取液氮中冻存的p0、p1及p2代恶性神经鞘瘤肿瘤组织，快速复温至常温，分别接种于10只同性别nod/scid小鼠腋下和神经鞘内，方法同前所述。

因病人的恶性神经鞘瘤组织是很珍贵的研究用材，因此需要对荷瘤小鼠的肿瘤组织进行传代，以便产生更多的实验用荷瘤小鼠。而对肿瘤组织进行冻存复苏则是因为每次建模实验都用不了太大的肿瘤块，下次实验的时候就可以使用留种的即冻存复苏的肿瘤块。肿瘤组织传代p0、p1和p2等，理论上该肿瘤组织不会改变，因而各代的实验效果可视为相同。且原位建模或皮下建模时，只要p0代成瘤成功，则后续p1及p2等传代和复苏是很简单和容易的，会全部成功。

本课题组已收集患者1例，通过原位及皮下成瘤建立pdx模型，得到相应的成瘤案例。患者杨某，男，28岁，右大腿恶性神经鞘瘤术后复发。2010年曾行“左侧腘窝血管纤维粘液瘤切除术”，2015年11月行“l3/4右侧椎旁神经鞘瘤切除术”，2017年2月行“右大腿神经鞘瘤切除术”，2017年12月行“右大腿恶性神经鞘瘤瘤段切除重建内固定软组织修复术”，2018年4月行“右髋关节离断术”。

图1为患者病理报告照片。从图1可见，该患者的病理诊断为恶性神经鞘瘤。

图2为肿瘤组织块在免疫缺陷小鼠体内进行pdx建模的照片。其中所述免疫缺陷小鼠为浑身白毛的nod/scid鼠。具体是在其腋下皮下成瘤成功，且在其腋下神经鞘原位成瘤成功。

图3为新鲜的患者肿瘤组织块原代细胞培养成功的照片。该原代细胞可以用于恶性神经鞘瘤的体外实验，但本发明中并不用细胞进行动物建模，而是用组织块进行免疫缺陷小鼠体内的原位建模和皮下建模。

pdx中的原位建模意义深远，原位建模所得肿瘤与患者原发肿瘤同质性更好，建模成功后可以深入探讨恶性神经鞘瘤发病机制，基于其研发的成果可在患者体内得到较好的重复，同时可以大量扩增临床患者体内有限的恶性神经鞘瘤样本，使用异种移植小鼠代替临床患者进行不同组合药物筛选，从而选择最合适的药物，大大提高有效性并降低药物副作用。因此，原位建模与应用可有望提高临床恶性神经鞘瘤治疗的有效性和患者的预后，防止患者致残甚至死亡而带来极大的医疗社会负担，减少治疗费用及政府财政支出，这些方面都具有重大的现实意义，具有极大的经济效益。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。