一种软骨组织低温冷藏保存液及其应用的制作方法

本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种软骨组织低温冷藏保存液及其应用。

背景技术：

关节软骨是组成活动关节面的有弹性的负重组织，具有减轻摩擦、吸收震荡、传导以及缓冲负重的特性，为人体几十年的时间内提供以上生物力学功能，截止目前尚无任何材料可以代替关节软骨的功能。

在关节软骨发生较严重的损伤和病变时，含有活性软骨细胞的关节软骨的置换移植是一种理想的治疗方法(较常见的为半月板和踝关节软骨移植)。但在目前的临床治疗过程中常见的治疗手段主要是以药物缓解和人工关节(金属复合材料)置换为主。对于还可勉强进行活动的患者多采用药物进行缓解，治标不治本，同时长期使用药物难免对部分器官组织造成不可逆的损伤。对于较为严重的患者则多采取人工关节置换移植的方法进行治疗。

对于人工关节的置换，除机械强度可靠外，其缺点也较为明显：1、置换后运动受限，人工关节的运动性能无法与正常含软骨关节的运动性能相比；2、植入后长期麻木疼痛，手术过程中需要切除或破坏大量患者自身正常的骨组织，用于对人工关节的固定，在此过程中，关节处大量的血管和神经组织会遭到破坏，手术后几乎无法再生。患者会在今后的生活中长期感觉到手术处麻木和疼痛；3、使用寿命有限，人工关节在负重运动下逐年的磨损消耗递增，在不受较大外力影响下，通常的使用寿命在10-20年之间。接近使用寿命后较容易出现脱臼、关节面断裂等风险，此时则需要进行二次手术；4、手术费用较高，通常人工关节的价格往往是所有植骨材料中价格最高的，仅单关节置换的费用就可达到十几万元。

随着现代医学对关节和关节软骨研究的不断深入，证实关节软骨的形成与不断维持是依赖于软骨细胞的代谢活动，其保证了软骨基质的稳定，使得关节软骨可始终保持在正常状态。成熟的软骨细胞所有的营养来源仅仅是依靠关节滑液，经软骨基质的弥散来获取。所以保持软骨的渗透性是保证软骨细胞存活的关节因素。正常的关节软骨中不含有血管、淋巴管，也不依靠神经来传递信息，这样就使得关节软骨的免疫原性较低，为同种异体之间的移植带来了可能。然而软骨细胞又是非常的敏感，虽然通常情况下处于稳定状态，但许多环境因素变化所带来的刺激都会使其发生反应甚至死亡，同时也会改变软骨的渗透性能。如：生长因子、白细胞介素、基质分子、药物、机械负重、流体压力的变化、水分的缺失、温度的变化等。

软骨组织作为一种较为复杂的组织，由软骨细胞、基质和纤维组成。由于软骨组织中软骨细胞生长活性、倍增时间、培养周期等因素的限制，在临床实践中，一般选择软骨组织直接移植治疗疾病，在以往的手术过程中也使用由商业公司生产的同种异体关节软骨，但使用后效果不佳，在很短的时间内(1年内)患者即出现的移植软骨磨损严重伴有开裂的情况。这说明移植的关节软骨中软骨细胞未成活或材料本身就无细胞活性，制备和实现关节软骨的移植需要解决的问题较多，其中最主要的包括：1、材料的来源，除了需对捐献者病史和疾病情况进行筛查外，还需要严格控制捐献者的年龄、职业以及关节处的健康程度；2、材料的制备，作为植入性医用材料，需做到无菌、无热原、基本无免疫原性，同时不破坏软骨细胞，不改变关节软骨的渗透性；3、软骨的保存。软骨组织的离体保存方法有两种，一种是软骨冷冻保存，一种是软骨冷藏保存。

cn104837339a公开了一种于储存包含软骨在内生物材料的组合物和生物材料性能保存的方法。组合物包含基质金属蛋白酶抑制剂，其中基质金属蛋白酶抑制剂包括多西环素、timp、上调内源性timp的化合物、pck3145、bb-2516和bb-94等，浓度为1.0nm-1000μm。组合物包含dmem等胞外型溶液以及营养混合物等胞内型溶液等。使用0-300um多西环素4℃保存猪软骨一个月，在有活细胞存在的情况下，多西环素提高了软骨电导率和渗透性的保留。

cn109566601a公开了一种软骨保存液及其使用方法，软骨保存液包括磷酸二氢钾、组氨酸或组氨酸盐、乳糖醛酸、蔗糖、别嘌呤醇、低分子右旋糖酐-40、nacl、kcl、硫酸镁、青霉素、还原型谷胱苷肽、腺苷、海藻糖、儿茶素、维生素e和硫酸软骨素，溶剂为去离子水，ph值为7.35-7.52，用于0-4℃保存保存软骨。保存4周，保存液组与传统的-80℃冷冻保存(冷冻保存组)、器官保存液(uw液组)及4℃常规保存(对照组)相比，在软骨形态、软骨细胞形态、胶原纤维完整性及粗细均匀等方面具有最佳保存效果。

cn102308787b公开了一种软骨保护液，每1000ml的软骨保存液含磷酸二氢钾20-30mmol、组氨酸80mmol或组氨酸盐15mmol、乳糖醛酸75-95mmol、蔗糖50-70mmol、别嘌呤醇0.8-1.2mmol、低分子右旋糖酐-40：45-55g、nacl45-55mmol、kcl25-35mmol、硫酸镁3-7mmol、青霉素70-90u、还原型谷胱苷肽2-4mmol、腺苷3-7mmol、海藻糖2-5g、余量为去离子水，该软骨保存液的ph值为7.33-7.53。保存5周时间，电子显微镜显示该保存液4℃保存软骨细胞及软骨结构变化速度明显小于传统的冷冻方法保存组。

cn104938476b公开了一种骨软骨移植物保存液及其制备方法，包括：葡萄糖80～125mmol、氨基酸0.1～2.0mmol、抗氧化剂0.2～2.0mmol、碱性成纤维细胞生长因子5～60nmol、无机盐1～120mmol、维生素1～9mmol、丙酮酸钠1～2mmol、青霉素50～70u、余为去离子水；配制成溶液，调节ph值至7.30～7.50，过滤除菌；把新鲜同种异体骨软骨移植物经无菌生理盐水清洗3-5次，放入已配制好骨软骨移植物保存液中浸泡；4℃保存。保存21天，其软骨细胞存活率为85％。

margies在《enhancingosteochondralallograftviability》文章中展示了4℃条件下保存软骨3周，在保存液中加入细胞因子igf-1和zvad可以分别提高软骨细胞活性至56.4％和52.4％，对照组存活率31.2％。

上述现有技术虽然在保存关节软骨中取得一定的进展，但仍然存在以下不足：

(1)软骨保存时间短，小于5周时间；

(2)长期保存软骨细胞存活率仍然较低。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种软骨组织低温冷藏保存液及其应用，本发明所述的软骨组织低温冷藏保存液可以延长新鲜软骨的保存时间，在保存8周后，软骨依然满足临床移植要求的活性和功能性。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种软骨组织保存液，成分包括dmem培养基、hepes1-30mm/l、组分a1-20mm/ml、转化生长因子β(tgf-β)10-100ng/ml、组分b10-100ng/ml、硫酸软骨素10-100g/l、基质金属蛋白酶(mmp)抑制剂100-1000ug/ml中的一种或几种；其中，组分a为米酵菌酸(bongkrekicacid)或q-vd-oph；组分b为软骨源性形态发生蛋白1(cdmp-1)、bmp或pdgf。

本发明保存液中的dmem培养基和hepes(是指4-羟乙基哌嗪乙磺酸)可以通过市面上常规购买。

在本发明的一种实施例中，本发明所述的软骨组织保存液为弱碱性，优选的ph为7.30-7.50。弱碱性的环境有利于软骨细胞活性和渗透性的保持。

在本发明的一种优选的实施例中，hepes含量为20mm/l。

在本发明的一种优选的实施例中，组分a的含量为5-20mm/ml。本发明的q-vd-oph是一种有效的caspase-7抑制剂，cas1135695-98-5。为了更好的提延长保存时间，组分a优选为米酵菌酸(bongkrekicacid)。

在本发明的一种优选的实施例中，转化生长因子β的含量为10-20ng/ml。

在本发明的一种优选的实施例中，组分b的含量为50ng/ml。为了更好的提延长保存时间，组分b优选为软骨源性形态发生蛋白1(cdmp-1)。

在本发明的一种优选的实施例中，硫酸软骨素的含量为50-100g/l，更优选为75-100g/l。

在本发明的一种优选的实施例中，基质金属蛋白酶抑制剂为gm6001或sb-3ct；在一种具体的实施例中，基质金属蛋白酶抑制剂含量为200-600ug/ml。

本发明还提供了本发明所述的软骨组织保存液在软骨保存中的应用，在一种具体的实施例中，是在3-4℃冷藏保存中的应用。

本发明还提供一种软骨组织低温冷藏方法，将无菌新鲜软骨组织放入本发明的低温冷藏保存液中，无菌密封，置于3～4℃的低温环境保藏。

本发明所述的无菌新鲜软骨组织可按照本领域常规方法获取。

本发明所述的应用可以作为在科研和临床中长时间冷藏保存新鲜软骨组织的方法。

本发明的有益效果：

软骨保存后，移植效果不理想很大因素来自于软骨细胞死亡以及软骨基质破坏，因此能否保持软骨细胞活力以及基质功能完整性是软骨保存的关键。本发明有效保留软骨细胞的活性，抑制软骨基质降解破坏，同时促进软骨生长，有利于软骨性能保存及其后的移植使用。

本发明提供的软骨保存液中米酵菌酸能抑制软骨细胞凋亡，提高软骨细胞的存活率，提高移植后软骨的存活及功能恢复；转化生长因子β(tgf-β)、软骨源性形态发生蛋白1(cdmp-1)有利于软骨细胞再生；硫酸软骨素、gm6001作为有益的基质金属蛋白酶抑制剂，可以有效抑制基质金属蛋白酶分解细胞外基质，避免软骨组织功能遭到破坏，提高软骨性能的保存；hepes缓冲液作为有益的缓冲溶液，其作用是较长时间控制恒定的ph范围，维持细胞内外液体的渗透压。

利用本发明保存新鲜软骨组织，软骨组织无需冷冻保存，降低冷冻损伤和灌注损伤。利用本发明保存新鲜软骨组织，软骨组织细胞活性高、组织功能性好。相较于传统软骨低温保存方法，本发明使用的方法可有效将软骨保存时间从现有报道的5周延长至8周。在保存8周后，软骨细胞的生物活性以及软骨的渗透性不发生明显变化，软骨依然满足临床移植要求的活性和功能性。为移植新鲜软骨提供更长的时间窗口，同时保存时间的延长有利于提高移植前病原微生物检测的准确性，提高软骨移植安全性。因此本软骨长期保存技术，对于软骨移植有重要意义。

附图说明

图1人软骨样本；

图2检测软骨细胞荧光度rfu值，比较软骨细胞储存4、6、8周的软骨细胞活力和增殖；

图3计算得到的4、6、8周软骨细胞存活率；

图4比较软骨细胞储存4、6、8周的软骨渗透压变化；

图5比较软骨细胞储存4、6、8周的软骨肿胀压力变化；

图6比较软骨细胞储存4、6、8周的软骨蛋白多糖变化；

图7猪膝关节软骨缺损模型植入新鲜软骨和冷藏保存软骨；

图8猪膝关节软骨缺损模型植入软骨12周后的病理图；

图9猪膝关节软骨缺损模型植入软骨12周后的番红o染色图；

图10软骨移植后o’driscoll组织学评分。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1

1.取500mldmem细胞培养基，在生物安全柜中取样进行无菌检测。

2.加入硫酸软骨素配置成硫酸软骨素含量75g/l的dmem细胞培养基。

3.向上一步骤中加入hepes，配置成hepes含量为20mm/l的均匀软骨保存液。

4.加入米酵菌酸、转化生长因子β、软骨源性形态发生蛋白1，配置成米酵菌酸10mm/ml，转化生长因子β50ng/ml、软骨源性形态发生蛋白110ng/ml，ph7.30-7.50。

5.将上一步骤中的溶液置于无菌容器内，密封，避光保存于4℃的低温环境中。

实施例2

1.取500mldmem细胞培养基，在生物安全柜中取样进行无菌检测。

2.加入硫酸软骨素配置成硫酸软骨素含量75g/l的dmem细胞培养基。

4.取500ml无菌检验合格的dmem细胞培养基，向其中加入200mggm6001，配置成gm6001含量400ug/ml的dmem细胞培养基。

5.向上一步骤中加入hepes，配置成hepes含量为20mm/l的均匀软骨保存液。

6.加入米酵菌酸、转化生长因子β、软骨源性形态发生蛋白1，配置成米酵菌酸5mm/ml、转化生长因子β10ng/ml、软骨源性形态发生蛋150ng/ml，ph7.30-7.50。

7.将上一步骤中的溶液置于无菌容器内，密封，避光保存于4℃的低温环境中。

实施例3(差异较大实施案例)：

1.取500mldmem细胞培养基，在生物安全柜中取样进行无菌检测。

2.加入硫酸软骨素配置成硫酸软骨素含量100g/l的dmem细胞培养基。

4.取500ml无菌检验合格的dmem细胞培养基，向其中加入400mggm6001，配置成gm6001含量800ug/ml的dmem细胞培养基。

3.向上一步骤中加入hepes，配置成hepes含量为10mm/l的均匀软骨保存液。

4.加入米酵菌酸、转化生长因子β、软骨源性形态发生蛋白1，配置成米酵菌酸20mm/ml、转化生长因子β100ng/ml、软骨源性形态发生蛋白1100ng/ml，ph7.30-7.50。

5.将上一步骤中的溶液置于无菌容器内，密封，避光保存于4℃的低温环境中。

实施例4

将新鲜人软骨组织浸没于实施例2制备的保存液中密封，置于4℃环境中保存。0周、4周、6周和8周4个时间点观察检测软骨的性状、活性等生物功能参数，检测方法如下。

软骨细胞成活率测试和软骨基质测定的实验方法：

(1)软骨细胞成活率测试实验

对于使用本专利保存液的软骨组织中的细胞成活率的测定可通过阿尔玛蓝染色，在分光光度计下以固定波长进行测定，在样品保存至预定时间后，对比正常新鲜的软骨组织细胞，最终计算出每毫升中的细胞荧光度。

(2)软骨细胞外基质的功能测定实验

软骨基质的渗透性等功能是决定软骨细胞成活和保存是否成功的主要因素，其中共设计了两种方法来测量软骨基质功能，即：a、dma测试法，一种测量弹性材料随时间和外部环境变化而发生的变化，该测试方法可用于检测软骨基质的渗透压和肿胀压力；b、番红o染色检测蛋白多糖含量，对比保存前后软骨活性差异。

实验过程：选用健康的人软骨，制备成为圆柱形样本(图1)，直径约5-6毫米，数量若干。样本在4℃保存液中保存8周时间，在0周、4周、6周和8周时间点使用阿尔玛蓝测试样本软骨细胞荧光度/毫克(rfu/mg)，判断保存软骨中软骨细胞的活性。同时采用dma测试法测量基质的渗透压和肿胀压力，番红o染色检测蛋白多糖含量。

结果如图2-图6所示：

通过阿尔玛蓝染色测量各样品的软骨细胞荧光度rfu值(图2)，计算得到软骨细胞存活率(图3)，统计得到软骨组织保存8周与4周rfu值无显著差异(p＞0.05)。软骨细胞存活率4周83.46％±1.07％，6周71.26％±2.64％，8周64.21％±2.48％。该数据表示为平均值±标准误，n＝5，使用单项方差分析(anova)。

图4测试结果表明，软骨组织保存8周与0周渗透压没有显著差异(p＞0.05)。该数据表示为平均值±标准误，n＝5，使用单项方差分析(anova)。

图5测试结果表明，软骨组织保存8周与0周肿胀压力没有显著差异(p＞0.05)。该数据表示为平均值±标准误，n＝5，使用单项方差分析(anova)。

图6显示软骨保存8周，番红o染色显示8周与4周软骨的蛋白多糖含量无显著差异(p＞0.05)。该数据表示为平均值±标准误，n＝5，使用单项方差分析(anova)。

实施例5

将新鲜猪软骨组织浸没于实施例2的保存液中密封，置于4℃环境中保存8周。制作猪膝关节软骨缺损模型6只，分成两组每组各3只，分别移植新鲜软骨和冷藏保存8周软骨，图7是猪膝关节软骨缺损模型植入新鲜软骨(左图)和冷藏保存8周软骨(右图)。移植12周后，对移植部位软骨进行病理切片观察和番红o染色。

图8左图是猪膝关节软骨缺损模型植入新鲜软骨12周后的病理图，愈合良好；右图是猪膝关节软骨缺损模型部位植入冷藏保存8周的软骨12周后的病理图，愈合效果虽然略低于新鲜软骨，但依旧愈合较好，可用于临床移植。

图9左图是猪膝关节软骨缺损模型植入新鲜软骨12周后的番红o染色图，软骨基质染色较深，软骨细胞均匀分散；右图是猪膝关节软骨缺损模型部位植入冷藏保存8周的软骨12周后番红o染色图，软骨基质染色较深，番红o染色未见减退，表明基质蛋白多糖成份未丢失，含量较丰富，软骨细胞代谢活跃，且软骨细胞均匀分散。

图10软骨移植12周后o’driscoll组织学评分，移植冷藏保存8周的软骨与移植新鲜软骨没有显著差异(p＞0.05)。该数据表示为平均值±标准误，n＝3，使用t检验。

综上，使用本保存液保存8周，软骨细胞的成活率以及细胞外基质的功能未发生明显变化，使用本保存液冷藏保存8周的软骨移植12周后与关节愈合良好，番红o染色显示基质蛋白多糖成份未丢失，软骨细胞数量多，代谢活跃。证明该冷藏保存软骨方法可维持有效软骨至少8周。

此外，发明人还发现，当保存液中的成分配比不在给定的米酵菌酸(bongkrekicacid)1-20mm/ml、转化生长因子β(tgf-β)10-100ng/ml、软骨源性形态发生蛋白1(cdmp-1)10-100ng/ml范围内，低于或高于这个范围，在其他相同条件相同的情况下，软骨保存4周软骨细胞存活率为60％，6周存活率为40％，8周存活率为30％；蛋白多糖含量降低，软骨移植后愈合较差。