本发明涉及一种利用固定化球毛壳孢子提高人参不定根中人参皂苷含量的方法，属于中药人参组织培养领域。
背景技术：
人参(panaxginsengc.a.mey.)，是五加科人参属植物，产于中国东北、朝鲜、日本、韩国、俄罗斯东部，其根茎是名贵的中药材，号称“百草之王”。人参皂苷是其主要的活性成分，有抗氧化，促进血液循环，降血糖，镇痛，抗癌和提高免疫等作用。近年来，人参作为补药被广泛地应用于各类保健产品中，包括胶囊(参一胶囊、人参归脾丸等)，饮品(人参源、蜂王浆等)和化妆品等。市场需求逐年加大，市场前景越来越广阔。然而栽培人参所需的生长周期较长、受环境影响严重以及“老参地”等问题难以解决，使得人参原料供应难以满足市场的需求。因此，植物组织培养技术被用来部分解决人参资源问题，生产人参药用活性成分。然而，组培人参不定根中皂苷含量较低是目前亟待解决的问题。
球毛壳，已经被用于改善多种有效化合物的生产，如紫衫醇、丹参酮、长春新碱。目前常用灭活菌丝体和培养滤液作为诱导子促进药用植物活性成分的生产。但很少见到直接应用活菌孢子当作诱导子的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的人参不定根组织培养过程中人参皂苷含量较低的不足，提供一种利用固定化球毛壳孢子提高人参不定根中人参皂苷含量的方法。
本发明的技术方案概述如下：
利用固定化球毛壳孢子提高人参不定根中人参皂苷含量的方法，包括如下步骤：
(1)在3/4ms培养基中加入蔗糖使终浓度为40g/l，加入吲哚丁酸使终浓度为5mg/l，加入6-糠氨基嘌呤使终浓度为0.1mg/l，调节ph＝6.5，灭菌，得到液体培养基；
(2)将人参不定根切成0.5～1cm的小段接种于盛放有100ml步骤(1)获得的液体培养基的锥形瓶中，在25℃及黑暗条件下培养30天；
(3)取海藻酸钠，加入蒸馏水中，使海藻酸钠质量浓度为6％，搅拌使之完全溶解，4℃放置24h，121℃下灭菌25min，降温至室温，紫外灭菌30min，得到海藻酸钠水溶液；
(4)取无菌的生理盐水进行球毛壳孢子的收集与稀释，用血球计数板计数，得到104个/ml的孢子悬浮液；
(5)将海藻酸钠水溶液与所述孢子悬浮液等体积混合均匀得混合液；按比例，将1ml混合液滴入10ml质量浓度2％的cacl2水溶液中，有颗粒生成，4℃放置2h；滤出颗粒，用生理盐水洗净，过滤，得到固定化球毛壳孢子；
(6)将10g步骤(5)获得的固定化球毛壳孢子加入到步骤(2)所述锥形瓶中，25℃及黑暗条件下继续培养5天，收获。
本发明的优点：
本发明的方法具有操作简单，生长周期短，生产成本低等优点。本发明的方法有效促进了人参皂苷的积累，显著提高了人参不定根中人参皂苷含量，便于人参皂苷的工业化大规模生产。
具体实施方式
实施例中的球毛壳孢子是以球毛壳(cicc2641)为例，购自中国工业微生物菌种保藏中心，但对本发明不进行限定。
2018年5月从中国工业微生物菌种保藏中心购买，该机构位于中国，北京。网址：www.china-cicc.org
球毛壳(chaetomiumglobosum)
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
利用固定化球毛壳孢子提高人参不定根中人参皂苷含量的方法，包括如下步骤：
(1)在3/4ms培养基中加入蔗糖使终浓度为40g/l，加入吲哚丁酸使终浓度为5mg/l，加入6-糠氨基嘌呤使终浓度为0.1mg/l，调节ph＝6.5，灭菌，得到液体培养基；
(2)将人参不定根切成0.5～1cm的小段接种于盛放有100ml步骤(1)获得的液体培养基的锥形瓶中，在25℃及黑暗条件下培养30天；
(3)取海藻酸钠，加入蒸馏水中，使海藻酸钠质量浓度为6％，搅拌使之完全溶解，4℃放置24h，121℃下灭菌25min，降温至室温，紫外灭菌30min，得到海藻酸钠水溶液；
(4)取无菌的生理盐水进行球毛壳孢子的收集与稀释，用血球计数板计数，得到104个/ml的孢子悬浮液；
(5)将海藻酸钠水溶液与所述孢子悬浮液等体积混合均匀得混合液；按比例，将1ml混合液滴入10ml质量浓度2％的cacl2水溶液中，有颗粒生成，4℃放置2h；滤出颗粒，用生理盐水洗净，过滤，得到固定化球毛壳孢子；
(6)将10g步骤(5)获得的固定化球毛壳孢子加入到步骤(2)所述锥形瓶中，25℃及黑暗条件下继续培养5天，收获。
对照例1
人参不定根的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)在3/4ms培养基中加入蔗糖使终浓度为40g/l，加入吲哚丁酸使终浓度为5mg/l，加入6-糠氨基嘌呤使终浓度为0.1mg/l，调节ph＝6.5，灭菌，得到液体培养基；
(2)将人参不定根切成0.5～1cm的小段接种于盛放有100ml步骤(1)获得的液体培养基的锥形瓶中，在25℃及黑暗条件下培养35天，收获。
人参皂苷类化合物含量的测定
1)色谱条件
液相色谱条件：色谱柱为kromasilc18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相(a)为乙腈，流动相(b)为超纯水；梯度洗脱程序：0→35min，a:20％；35→40min，a：20％→30％；40→50min,a：30％→31％；50→60min，a:31％→32％；60→70min，a：32％→45％；70→100min,a：45％→60％；100→110min,a：60％→60％；流速1.0ml/min；进样体积为20μl；柱温35℃；检测波长203nm。
2)标准品溶液的制备
精密称取经减压干燥24小时以上的单体人参皂苷rg1、re、ro、rf、rb1、rg2、rh1、rc、rb2、rb3、rd、rg3、rh2标准品各1mg，置于5ml容量瓶中，少量甲醇超声溶解，再用甲醇定容，配成0.2mg/ml的人参皂苷混合标准品储备液，密封置冰箱4℃保存。
3)样品溶液的制备
精密称取0.2g干燥的实施例1和对照例1取得的不定根样品置于100ml具塞三角瓶中，加入20ml甲醇，60℃水浴1h，趁热抽滤，重复抽提一次，合并滤液。滤液挥干，再加入10ml蒸馏水溶解，用20ml正丁醇萃取两次，收集正丁醇层，经旋转蒸发处理后，用甲醇定容至1ml。用0.22μm微孔滤膜过滤，得样品溶液。
4)人参皂苷类化合物含量的测定结果
表1对照组与实施组的人参皂苷含量(mg/g)测量结果
每个值代表三个重复组的平均值±标准误差
根据duncan的多范围检验，一列平均数中后面的不同字母代表在p<0.05时有显著差异。
对照例1人参皂苷含量(17.56±0.49mg/g)，实施例1人参皂苷含量(56.29±0.62mg/g)。
与对照例1比，实施例1的方法获得的产物其人参皂苷含量远高于对照例1的含量，与对照例1相比提高了3.21倍。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。