克服芸薹属与萝卜属自交不亲和性的试剂及用法和应用的制作方法

本发明属于育种技术领域，更具体地说，特别涉及一种克服芸薹属与萝卜属植物自交不亲和性的试剂及用法和应用。

背景技术：

自交不亲和性是被子植物进化出的一种防止自花授粉促进异花授粉的遗传机制，在防止自交衰退促进后代适应性方面具有重要意义。一般而言，自交不亲和性分为孢子体自交不亲和及配子体自交不亲和。大白菜等芸薹属蔬菜作物与萝卜等萝卜属植物是典型的孢子体自交不亲和，由紧密连锁的s-基因，也就是花粉携带的花药绒毡层表达的sp11/scr信号分子与柱头乳突细胞表达的srk完成自花花粉的识别。当自花授粉时，例如scr1与srk1相互结合，启动乳突细胞内一系列反应从而抑制自花花粉的萌发；而异花授粉时，scr2与srk1不能结合，则不能启动抑制花粉萌发的反应。具体表现为，自花花粉不能在柱头上萌发，或萌发后在柱头乳突细胞上缠绕而无法进入柱头，而异花花粉可以萌发、生长、进入柱头并完成受精过程；而异花花粉可以顺利完成这些过程。

芸薹属作物与萝卜属植物常利用自交不亲和系来制备杂交种。据了解，利用自交不亲和系育种，不用人工去雄因而降低种子生产成本，并且父本和母本都可以收获杂交种因而制种效率高，选用强自交不亲和系也能保证较高的杂种率。但是，在制备杂交种时，选用高度自交不亲和系来提高杂交率的同时会造成亲本繁殖效率低下因而提高制种成本。另外，在利用自交不亲和系或雄性不育系制备杂交种时，除了保证目标性状出现杂种优势，还要兼顾父本与母本携带不同的s基因，这在很大程度上限制了亲本选配自由。因此，探索高效的广泛适用的克服自交不亲和性的方法是自交不亲和性利用的重要组成部分之一。

目前生产上主要运用喷洒食盐水来克服亲本的自交不亲和，但是高浓度食盐水对植物有伤害性，因此繁种效率低下。育种研究中主要利用蕾期授粉繁殖亲本，但是蕾期去雄容易伤害柱头，费时费力。近年来，发现细胞分裂素（6-ba）、生长素（naa、iba）等生长调节物质可以克服大白菜及甘蓝的自交不亲和。除此之外，有些物力及机械方法如高温、电助授粉器、钢刷授粉、co2处理、γ射线辐射等可以提高自交结实率。但是这些操作都不利于推广。因此，急需寻找一种更高效的具有广谱性的克服自交不亲和性的方法。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种克服芸薹属与萝卜属植物自交不亲和性的试剂及用法和应用。

本发明解决技术问题的技术方案是：一种克服芸薹属与萝卜属植物自交不亲和性的试剂，所述试剂为混有tween-20的碘化钾溶液。

所述试剂中每1mm-10mm的碘化钾溶液中含有0.025%tween-20。

克服芸薹属与萝卜属植物自交不亲和性的试剂的用法，包含有如下步骤：

（1）提前配制浓度为1m的碘化钾母液放置于4℃低温冰箱避光保存，母液的配制及工作液的稀释过程中需注意避光。

（2）喷施前选择遮光效果好、目数较高的黑色遮阳网以支架或拉网的方式覆盖于植株顶部与四周，在植株周围营造出一个弱光环境，避免因碘化钾见光易分解而减弱喷施效果。

（3）进入始花期，大量盛开时，于晴天上午8：00-10:00时间段，对大白菜进行碘化钾喷施，共喷施三次，每次间隔15min,每次喷到柱头上有水珠为止。第三次喷施柱头干燥后自交授粉，套收种袋，待果荚成熟后收种。

克服芸薹属与萝卜属植物自交不亲和性的试剂的用法，采用雾状喷洒将碘化钾溶液喷洒在刚展开呈十字花的柱头上。

克服芸薹属与萝卜属植物自交不亲和性的试剂在由自交时柱头活性氧水平过高造成的自交不亲和植物上的应用。

我们在研究大白菜的自交不亲和调控机制的过程中，发现自花授粉使柱头产生高水平的活性氧，因此抑制自花花粉的萌发。碘化钾是一种过氧化氢清除剂，使用碘化钾喷施花期柱头，可以降低柱头活性氧，减少对自花花粉的抑制，促进自花花粉的萌发、生长、进入柱头并完成受精过程。本发明主要的构思有别于目前任何一种方法，本发明的方法克服自交不亲和的效果显著，且对植物伤害性小，应用范围广，可以应用到白菜、甘蓝等芸薹属作物及萝卜等萝卜属植物，而且该方法可以进一步用于克服十字花科其他作物的自交不亲和，对十字花科作物的育种及制种具有重要的价值。

本发明适用于芸薹属与萝卜属作物自交不亲和系或具有自交不亲和性的雄性不育系。大白菜与萝卜自交不亲和植株的刚展开呈十字花的柱头上喷洒碘化钾溶液，能不同程度地提高自交亲和指数。田间实验结果表明，喷施碘化钾之后，大白菜自交不亲和系的亲和指数由原来的0.54提高到6.06，果荚的长度是原来的2倍；萝卜自交不亲和植株的亲和指数由原来的0.19提高到3.30。

附图说明

图1.使用活性氧特异性染料,二氯二氢荧光素二乙酸酯h2dcfda(2',7-dichlorodihydrofluoresceindiacetate）,发现自花授粉导致柱头活性氧显著升高（自交不亲和大白菜'zy15'与自交不亲和大白菜'848蛋黄白'）；

图2.使用活性氧特异性染料h2dcfda,发现异花授粉导致柱头活性氧显著降低（自交不亲和大白菜'zy15'与自交不亲和大白菜'848蛋黄白'）；

图3.碘化钾离体处理显著降低柱头活性氧（自交不亲和大白菜'zy15'与自交不亲和大白菜'848蛋黄白'）；

图4.离体喷施碘化钾克服大白菜自交不亲和（自交不亲和大白菜'848蛋黄白'）；

图5.离体喷施碘化钾克服大白菜自交不亲和（自交不亲和大白菜'zy15'）；

图6.活体喷施碘化钾不影响大白菜开花及果荚发育（自交不亲和大白菜'848蛋黄白'）；

图7.活体喷施碘化钾显著促进自交不亲和大白菜'848蛋黄白'的果荚伸长；

图8.活体喷施碘化钾促进大白菜自交结籽（自交不亲和大白菜'848蛋黄白'）；

图9.使用h2dcfda发现自花授粉导致萝卜柱头活性氧升高（自交不亲和萝卜'潍县青'）；

图10.使用h2dcfda发现异花授粉导致萝卜柱头活性氧降低（自交不亲和萝卜'潍县青'）；

图11.碘化钾离体处理显著降低萝卜柱头活性氧（自交不亲和萝卜'潍县青'）；

图12.碘化钾离体处理克服萝卜自交不亲和（自交不亲和萝卜'潍县青'）。

具体实施方式：

实施例1：以大白菜为例

大白菜在喷施碘化钾前一天摘除已经开放的花，套收种袋。喷施前选择遮光效果好、目数较高的黑色遮阳网以支架或拉网等的方式覆盖于植株顶部与四周，在植株周围营造出一个弱光环境，避免因碘化钾见光易分解而减弱喷施效果。对新开花序进行碘化钾溶液喷施（碘化钾溶液溶液含有0.025%的tween20，碘化钾浓度为0mm、1mm、5mm、10mm），每次喷施直至能看到柱头上有水珠，共喷施3次，间隔15min，第3次喷施后待柱头干燥后自交授粉，套收种带防止污染其他花粉。20—30天后进行果荚解剖，统计亲和指数，见表1

表1.活体喷施碘化钾提高大白菜自交亲和指数（自交不亲和大白菜'848蛋黄白'）

注：**代表极显著性差异（p<0.01），*代表显著性差异（p<0.05）。

note：**representssignificantdifference(p<0.01),*representssignificantdifference(p<0.05).

通过图1-图8及表1我们可以得出：以自交不亲和大白菜（'zy15'与'848蛋黄白'）为实验材料，采用50μm的h2dcfda染色方法测定，我们发现自交引起柱头活性氧显著升高（图1），异交引起柱头活性氧显著下降（图2）；我们因此使用离体处理方法，将柱头从3mm处切下，插入含有碘化钾这种针对过氧化氢的活性氧清除剂的培养基中，发现碘化钾离体处理柱头显著减低柱头活性氧（图3）；我们进而用碘化钾对离体培养的柱头进行喷施（碘化钾喷施溶液中加有0.025%的tween20），发现可以显著抑制其自交不亲和性，促进自花花粉管的萌发与生长，并进入柱头（图4，图5）；接下来我们开始在大白菜植株上进行花序的活体喷施（在喷施之前将花序上已经开放的花去掉并套纱网袋，用黑色遮阳网营造一个弱光环境，对新开花序进行含有0.025%的tween20的0mm、1mm、5mm、10mm碘化钾溶液喷施，每次喷施直至能看到柱头上有水珠，共喷施3次，间隔15min，第3次喷施后待柱头干燥后自交授粉，套收种带防止污染其他花粉。20天后进行果荚长度测量并解剖果荚，统计亲和指数），我们发现活体喷施碘化钾不抑制开花及果荚发育（图6）；且促进自花授粉后的果荚伸长（图7）及结籽（图8）；显著提高自交亲和指数（表1）。

实施例2：以萝卜为例

萝卜在喷施碘化钾前一天摘除已经开放的花，套收种袋。喷施前选择遮光效果好、目数较高的黑色遮阳网以支架或拉网等的方式覆盖于植株顶部与四周，在植株周围营造出一个弱光环境，避免因碘化钾见光易分解而减弱喷施效果。对新开花序进行碘化钾溶液喷施（碘化钾溶液含有0.025%的tween20，碘化钾浓度为0mm、0.5mm、1mm、5mm），每次喷施直至能看到柱头上有水珠，共喷施3次，间隔15min，第3次喷施后待柱头干燥后自交授粉，套收种带防止污染其他花粉。20天后进行果荚解剖，统计亲和指数，见表2。

表2.碘化钾提高萝卜自交亲和指数（自交不亲和萝卜'潍县青'）

注：**代表极显著性差异（p<0.01），*代表显著性差异（p<0.05）。

note：**representssignificantdifference(p<0.01),*representssignificantdifference(p<0.05).

通过图9-图12及表2我们可以得出：以自交不亲和大白菜（'维县青'）为实验材料，采用50μm的h2dcfda染色方法测定，我们发现自交引起柱头活性氧显著升高（图9），异交引起柱头活性氧显著下降（图10）；我们因此使用离体处理方法，将萝卜柱头从3mm处切下，插入含有碘化钾这种针对过氧化氢的活性氧清除剂的培养基中，发现碘化钾离体处理柱头显著减低柱头活性氧（图11）；我们进而用相似的放到对离体培养的柱头进行处理，发现可以显著抑制其自交不亲和性，促进自花花粉管的萌发与生长，并进入柱头（图12）；接下来我们开始在大白菜植株上进行花序的活体喷施（在喷施之前将花序上已经开放的花去掉并套纱网袋，用黑色遮阳网营造一个弱光环境，对新开花序进行含有0.025%的tween20的0mm、0.5mm、1mm、5mm碘化钾溶液喷施，每次喷施直至能看到柱头上有水珠，共喷施3次，间隔15min，第3次喷施后待柱头干燥后自交授粉，套收种带防止污染其他花粉。20天后进行果荚长度测量并解剖果荚，统计亲和指数），我们发现活体喷施碘化钾显著提高萝卜的自交亲和指数（表2）。