多壁碳纳米管在抑制烟草花叶病毒感染中的应用的制作方法

本发明属于植物病毒防控领域，特别涉及一种多壁碳纳米管在抑制烟草花叶病毒感染中的应用。

背景技术：

烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus；tmv)，是一种单链rna病毒，因最初在烟草中发现而得名。现在被认为是一种严重的病原体，可感染的植物多达350余种，尤其是烟草及其他茄科植物。其病毒粒体为直杆状，大小300nm×18nm。烟草花叶病毒具有极强的致病力和抗逆性，该病毒在干烟叶中能存活52年，稀释100万倍后仍具有侵染活性。

烟草花叶病毒可通过带病残体、未充分腐熟的带毒肥料、其它寄主植物以及蝗虫、烟青虫等咀嚼式口器的昆虫传播。烟草花叶病毒感染植物后，会破坏植株的组织结构，病毒的rna还会严重影响植物细胞的正常分裂，使植物无法正常生长，在成熟期不能正常的开花结果，抵抗能力极差，容易受到外界的干扰，叶片和花果容易脱落，种子量少。被烟草花叶病毒感染后的植株无法根治，并且还应清除带病残株，冬前深翻晒土，以防再次感染。烟草花叶病毒可使烟草减产幅度达50％-70％，严重危害了烟叶的产量和质量，给烟草产业造成了巨大的经济损失。

由于纳米材料其巨大的比表面积、灵活的表面功能化和固有的理化性质在纳米农业方面已经被美国纳米技术行动列为8个交叉领域之一，具有巨大的应用潜力。纳米材料的叶面施用可以促进植物生长，提高非生物胁迫下的光合作用效率，并提高生物量/产量和果实品质。除此之外，纳米材料的施用还被证明可以通过直接抑制病原菌来提高植物的抗病能力。例如，涂有n杂环的纳米金对细菌具有显着的抑制性，包括革兰氏阳性和多药耐药菌株。

植物病毒抑制剂目前已在世界范围内广泛应用，其在抑制各种各样的植物病毒(烟草花叶病毒、大蒜e病毒、水稻瘤矮病毒、马铃薯a病毒、甘蔗花叶病毒)上具有极大的潜力。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供多壁碳纳米管在抑制烟草花叶病毒感染中的应用。

一种多壁碳纳米管在抑制烟草花叶病毒感染中的应用，包括：

(1)将多壁碳纳米管与水充分混合，形成烟草花叶病毒抑制剂，所述病毒抑制剂中多壁碳纳米管的浓度为100-500mg/l；

(2)将所病毒抑制剂均匀喷施于植物叶片。

多壁碳纳米管是碳的一种同素异形体，其径向尺寸较小，在本发明中尺寸为20-30nm；而其长度一般在微米级，长度和直径比非常大，可达103～106。研究表明，适当浓度的多壁碳纳米管不会对植物产生明显的毒理作用，反而施加适量浓度还可以提升种子萌发率，并且激活植物的防御系统并提升植物的抗逆性，提升逆境下植物的品质与产量。除此之外，我们还发现了一种全新的机制，多壁碳纳米管抑制了烟草花叶病毒的复制，并且限制了烟草花叶病毒向植物的根尖组织以及全身扩散。这是本发明中抑制烟草花叶病毒感染，并改善病毒感染后植物生长状况的重要机理。

本发明采用多壁碳纳米管和水配制而成的烟草花叶病毒抑制剂，从抑制烟草花叶病毒的复制，限制了烟草花叶病毒向植物的根尖组织以及全身扩散；激活植物的防御系统，提升植物的抗逆性；使多壁碳纳米管充分分散，并促进植物对碳纳米管的吸收；这三个角度共同作用以抑制烟草花叶病毒对植物的感染，并综合的改善被感染后植物的生长状况。

优选情况下，多壁碳纳米管的粒径为20-30nm，纯度＞99.9％。

本发明的烟草花叶病毒抑制剂的施用方法：将病毒抑制剂均匀喷施于植物叶片，每日单次施用量约为5-8ml/株，21天总施用量为150ml/株。

本发明基于我国烟草花叶病毒肆虐的严峻现状，以及对于以上重要的多壁碳纳米管、病毒抑制剂在抑制病毒感染，促进植物生长方面的认识，通过调整配比，发明一种新型病毒抑制剂以缓解烟草受烟草花叶病毒的侵袭，同时有效提升被病毒感染植物的抗逆性，碳纳米材料在抑制烟草花叶病毒上具有较大的可行性和巨大的应用潜力。

附图说明

图1为本发明中采用的多壁碳纳米管的透射电镜图像。

图2为本发明中采用的多壁碳纳米管的透射电镜图像。

图3示出了实施例1在人为接种烟草花叶病毒下施加不同浓度的病毒抑制剂后，烟草的叶片叶面积以及净重。

图4示出了实施例1在人为接种烟草花叶病毒下施加不同浓度的病毒抑制剂后，烟草叶片中的病毒外壳蛋白的mrna以及gfp的mrna转录表达水平(该图使用gapdhmrna将二者的转录表达水平标准化)。

图5示出了实施例1在人为接种烟草花叶病毒下施加不同浓度的病毒抑制剂后，烟草的叶片图像以及gfp标记的荧光图像。

图6示出了实施例1在人为接种烟草花叶病毒下施加200mg/l的病毒抑制剂后，烟草的叶片透射电镜图。

图7示出了实施例1在人为接种烟草花叶病毒下施加不同浓度的病毒抑制剂后，烟草的叶片中的叶绿素含量。

图8示出了实施例1在人为接种烟草花叶病毒下施加不同浓度的病毒抑制剂后，烟草的叶片中叶绿素荧光参数以及叶绿素荧光图像。

图9示出了实施例1在人为接种烟草花叶病毒下施加不同浓度的病毒抑制剂后，烟草的叶片光合参数的影响。

图10示出了实施例1在人为接种烟草花叶病毒下施加不同浓度的病毒抑制剂后，烟草的叶片中水杨酸(sa)脱落酸(aba)的浓度以及它们二者受控基因的mrna表达水平。

图11示出了实施例1在人为接种烟草花叶病毒下施加不同浓度的病毒抑制剂后，烟草的叶片中各种活性氧清除剂的活性。

具体实施方式

下面通过具体的实施例1详细说明本发明涉及的一种具有抑制烟草花叶病毒功能的病毒抑制剂及其使用方法，该实施例仅仅是用于更具体详细地介绍该发明，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

以下实施例中使用的试剂如下:

多壁碳纳米管(mwcnts)购自于上海攀田粉体公司，多壁碳纳米管的粒径为20-30nm，纯度＞99.9％。多壁碳纳米管的透射电镜图像见图1。

实验中其他化学试剂均购自北京市化工厂。

实施例1

本实施例用于说明本发明所涉及的病毒抑制剂有效抑制了烟草花叶病毒的感染。总体实验过程和作用机理可参见图2。

实验所需烟草(野生型)购买于中国农业科学院，萌发前用5％的双氧水消毒30min，使用去离子水清洗3遍，挑选大小相近的种子放入基质中，基质的组成为人造土壤，蛭石，珍珠岩和黑土(质量比2：2：1：2)，在25℃的温度下发芽一周。然后将均匀的烟草幼苗移到装满上述基质的塑料盆(高10cm，直径8cm)，在150μmolm^-2s^-1的光合有效辐射(par)，相对湿度60-65％，温度25-28℃的环境下培养。

在人为接种烟草花叶病毒前，每天分别用5～8ml的100、200、500mgl^-1的病毒抑制剂通过叶面喷施21天，每株烟苗总共喷施约150ml。在叶面曝光期间，用黑色塑料覆盖花盆，以避免病毒抑制剂接触基质混合物。处理包括3个重复。土壤保持在60％的含水量，并且在对照植物上喷洒等量的水。

使用gfp标记烟草花叶病毒病毒(tmv：gfp)来研究病毒抑制剂在病毒感染过程中的作用。简而言之，通过电穿孔技术将tmv：gfp重组质粒导入根癌农杆菌(eha-105)，然后培养这些细菌一夜，使其od600＝0.5。在5-7张完全展开的叶期，使用1ml注射器将gfp标记的烟草花叶病毒(tmv：gfp)人为注射到烟草叶脉中。

烟草花叶病毒感染状况的测定：我们选择了生长状态相似的烟草叶片，用手持紫外灯定期检查植物的荧光信号强度，并在人为接种病毒5天后拍摄照片(dpi)。使用扫描电子显微镜(sem)观察感染后的植物叶片，用透射电镜(tem)观察叶片中的叶绿体。

定量pcr分析：从感染病毒的烟草叶片中提取总rna，合成第一链cdna，并制备总体积为50μl的聚合酶链反应混合物，并使用abi-7500型实时聚合酶链反应系统进行测定。

叶片光合参数测定：叶片使用荧光计测量叶绿素荧光参数，使用叶绿素测定仪测定烟草叶片的总叶绿素(chla+b)含量，使用气体分析仪测量净光合作用速率(pn)，蒸腾速率(tr)，气孔导度(gs)和细胞间co2浓度(ci)。

叶片激素、酶的测定：使用生物试剂盒测量病毒感染叶片中的水杨酸(sa)，脱落酸(aba)的浓度以及过氧化氢酶(cat)，过氧化物酶(pod)，丙二醛(mda)和超氧化物歧化酶(sod)的活性。

数据处理：所有实验均设置12个平行样，每种处理的数据代表平均值±标准偏差(sd)。使用statistix8.1(一种分析软件)进行了方差分析(anova)和t检验，以计算实验数据之间的统计学差异(p≤0.05)。

表1.实验数据汇总表

结果显示，在人为注射新型烟草花叶病毒条件下，与对照组相比，不添加病毒抑制剂的处理组中烟草的生长受到了极大抑制，烟草净重以及叶面积均大幅下降(图3)；病毒外壳蛋白的mrna以及gfp的mrna转录表达水平大幅上升(图4)；通过gfp标记病毒后的荧光图像可知，烟草花叶病毒在叶片中出现了明显的扩散(图5)；由叶片的透射电镜图可知，烟草叶片中叶绿体的数量大幅减少，并且叶绿体超微结构以及总细胞器结构完整性受到明显破坏(图6)；并且光合作用相关参数大幅下降，如叶绿素含量以及叶绿素荧光参数等均大幅下降，光合作用受到明显抑制(图7，8，9)；同时与抵抗病原体胁迫相关的激素有所上升(图10)；并且烟草叶片中各种活性氧清除剂均大幅上升(图11)。

但在施加了烟草花叶病毒抑制剂的处理组中，与未施用病毒抑制剂的处理组相比，烟草净重以及叶面积均大幅上升(图3)；烟草叶片中的病毒外壳蛋白的mrna以及gfp的mrna转录表达水平大幅下降(图4)；通过gfp标记病毒后的荧光图像可知，病毒抑制剂有效的抑制了烟草花叶病毒的扩散(图5)；由叶片的透射电镜图可知，施加病毒抑制剂后烟草叶片中叶绿体的数量略有减少，叶绿体超微结构以及总细胞器结构完整性未受明显影响(图6)；光合作用相关参数大幅上升，如总叶绿素含量、叶绿素荧光参数、净光合作用速率(pn)、蒸腾速率(tr)、气孔导度(gs)和细胞间co2浓度(ci)，这表明光合作用能力大幅提升(图7，8，9)；同时与抵抗病原体胁迫相关的植物激素进一步得到提升，如水杨酸(sa)可通过诱导抗菌基因的重新编程来促进针对生物营养性病原体的防御反应；脱落酸(aba)可调节气孔运动并可以直接限制病原体进入(图10)；并且各种活性氧清除剂有所下降，这表明由病毒扩散产生的氧化应激大幅下降(图11)。