鳙鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法与流程

本发明属于鱼类杂交领域，尤其涉及亚科间鱼类中的杂交领域，具体涉及到鳙鱼和团头鲂亚科间远缘杂交的方法。
背景技术：
：世界上具有32000多种鱼类，是脊椎动物中种类最多的类群；其中，绝大多数鱼类的食性为杂食性或肉食性；仅发现3种草食性鱼类，它们分别是团头鲂、草鱼和遮目鱼。草食性鱼类由于饲料来源于自然界，而且属于植物性蛋白来源，其绿色生态养殖价值越来越得到大家重视。远缘杂交是指种间、属间乃至亲缘关系更远的生物类型的杂交，被认为是促进动植物适应性辐射演化和物种形成的有效方式。远缘杂交能够导致基因组基因功能、染色体结构及基因组大小的变化，可以使基因组从一个物种转移到另一个物种，从而导致杂交后代的表现型发生改变。在基因型上，远缘杂交能导致后代在染色体组水平上的改变，从而产生二倍体、三倍体、四倍体后代。在表型方面，远缘杂交能整合双亲的优点，使杂交后代在外形、生长速度、存活率及抗病能力等方面均表现出杂种优势。这种杂交方法为后续的新型多倍体鱼的选育提供了宝贵的资源，在生物进化和鱼类遗传育种中具有重要的生物学意义。然而，远缘杂交领域面临的长期问题是选育后代存活率低，杂种性状分离大、不易稳定。因此，如何利用和改进现有的生物技术方法，在现有的鱼类中挑选合适的亲本鱼进行远缘杂交，从而对其进行遗传改良，以获得性状更为优良、种类更为丰富和对遗传育种研究更加有意义的新型鱼类，就成为了本领域技术人员长期面临和需要解决的问题。与其他类型的鱼相比较，鳙鱼(hypophthalmichthysnobilis)体侧扁，较高，腹部在腹鳍基部之前较圆，其后部至肛门前有狭窄的腹棱；头极大，前部宽阔，头长大于体高；生长在淡水湖泊、河流、水库、池塘里，多分布在淡水区域的中上层；为温水性鱼类，适宜生长的水温为25-30℃，能适应较肥沃的水体环境，具有抗逆性强，净化水质，肉质好，氨基酸含量高等优良特征。团头鲂(megalobramaamblycephala)体高，全体呈菱形，体长约50cm，为体高的2.2-2.8倍；体背部青灰色，两侧银灰色，腹部银白；体侧鳞片基部灰白色，边缘灰黑色，形成灰白相间的条纹；体侧扁而高，呈菱形，头较小，头后背部急剧隆起，具有生长速度快，耐低氧，营养丰富等优良特征。如果将鳙鱼与团头鲂进行远缘杂交，则有望培育出集两种亲本的优点于一身的杂交后代鱼。但是，鳙鱼与团头鲂，不是生活在同一水域，繁殖周期不同步，生活水体环境不一样，通过常规方法难以顺利获得杂交后代，即便能获得杂交后代，催产率、孵化率以及杂交后代存活率都很低，难以实现产业化推广。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，克服以上
背景技术：
中提到的不足和缺陷，提供一种鳙鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：一种鳙鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，包括如下步骤：以鳙鱼为母本，团头鲂为父本，进行人工催产，具体是对母本亲鱼采用两针注射法注射催产剂，对父本亲鱼采用一针注射法注射催产剂，首先对母本亲鱼注射催产剂脑垂体0.5-1mg/kg或促黄体素释放激素类似物1-2μg/kg(母本亲鱼第一针注射)，同时采用与母本亲鱼相同的催产剂对父本亲鱼进行注射，剂量相较于母本亲鱼减半；隔3-4h后再对母本亲鱼注射促黄体素释放激素类似物10-15μg/kg、脑垂体1-2mg/kg和绒毛膜促性腺激素800-1000iu/kg组成的混合催产剂(母本亲鱼第二针注射)；人工催产后获得的卵子与精子进行人工干法授精，然后流水孵化受精卵，孵化成功后即获得鳙鱼和团头鲂的杂交后代。本发明采用了特定的催产剂种类、剂量和注射方式，可以加快性腺成熟，缩短催产时间，提高催产效率。其中，促黄体素释放激素类似物(lrh-a)能够促使亲鱼发情产卵，绒毛膜促性腺激素(hcg)不仅能够促进亲鱼排卵，还可以加快性腺成熟，与脑垂体(pg)结合使用可以缩短催产时间，提高催产效率。通过长期系统的摸索，本发明催产鳙鱼时采用两针注射法催产，有利于获取的大量优质的卵子，同时对团头鲂的催产剂量进行了调整，有利于达到最大催产率，提高杂交后代的孵化率和存活率。上述的方法，优选的，在进行人工催产之前，当年的3月上旬，选择成熟特征明显、无病无伤、体征良好的雌性鳙鱼和雄性团头鲂分别作为母本亲鱼和父本亲鱼，置于专门的池子中进行培育，在催产前1个月，每隔1-3天用流水刺激，以促进亲鱼性腺发育成熟。饲养雄性团头鲂的水质指标如下：ph为7.0-7.4，硬度＜15度，铁离子浓度在3×10-7mol/l以下，硫酸根离子浓度＜1.5×10-5mol/l，氯离子浓度＜1.9×10-5mol/l，不含游离氯和其他有毒有害物质，溶氧量≥5mg/l，氨浓度＜1×10-7mg/l，亚硝酸盐浓度＜1×10-7mol/l，硝酸盐浓度在5.5×10-6mg/l-6.0×10-6mg/l，不含硫化氢；饲养雌性鳙鱼的水质指标如下：ph为6.5-8.5，溶氧量≥5mg/l，氨氮含量＜0.025mg/l，生化需氧量＜5mg/l。优选的，在当年的5月下旬到6月上旬，当水温稳定在22-25℃时，从亲鱼中挑选出腹部膨大、松软且有弹性的雌性鳙鱼作为母本，和轻挤压腹部便能挤出乳白色精液的雄性团头鲂作为父本，进行人工催产。优选的，所述人工催产时，对亲鱼的胸鳍基部无鳞处腹腔进行注射。优选的，对母本亲鱼和父本亲鱼注射完催产剂之后，按雌鱼和雄鱼2-3:1的数量比例将亲鱼放在同一产卵池内，等待产卵产精；所述产卵池的水面面积为12-15m2。优选的，所述人工干法授精的具体操作包括如下步骤：擦去父本亲鱼和母本亲鱼体表覆盖的水，将精液和卵子挤入干燥受精盆中，同时用羽毛快速搅拌，避免阳光直射，搅拌2-3min后，均匀泼洒在孵化槽中，进行流水孵化。优选的，所述流水孵化受精卵时控制水温在22-25℃。本发明采用新型的鱼类浮性卵孵化装置来流水孵化，流水孵化优点是：1)不断有活水补充，保证水质和氧气需求≧5mg/l；2)鱼苗出膜后，便于及时清除卵膜，防止污染水质；3)孵化的幼苗生命力更强，成活率高。优选的，所述流水孵化得到的鱼苗在孵化槽中继续培养2-4天，待其出现腰点后转入预先培肥的池塘中进行精细饲养，鱼苗下池后每天泼洒豆浆1-2次，并放入圆藻，待鱼苗长到5-8cm长后开始喂饲料粉。优选的，所述鳙鱼和团头鲂的杂交后代经过检测筛选后，得到二倍体鳙鲂，所述检测筛选的方法包括外形测量、流式细胞dna含量法、血涂片法、血细胞形态鉴定法和染色体制片法。与现有技术相比，本发明的有益效果为：1、本发明的方法，解决了鳙鱼和团头鲂之间远缘杂交困难的问题，本发明采用了特定的混合催产剂，以合适的剂量注入亲鱼体内进行催产，孵化率明显增高，这样对于筛选各种杂交品种后代提供了数量上的最大可能，不仅整合了鳙鱼与团头鲂的优良性状，丰富了市场鱼类品种，而且为优良品种的选育奠定了良好基础，为后续的新型多倍体鱼的选育提供了宝贵的资源，在生物进化和鱼类遗传有种具有重要的生物学意义。2、本发明的杂交后代二倍体鳙鲂，相较于亲本，存在明显的杂交特征，整合了双亲的优良特性，不仅食用价值有所提高，而且生长速度快，抗病性明显增强。3、本发明的二倍体鳙鲂具有草食性的特征，增加了草鱼性鱼类的种质资源，草食性鱼类由于饲料来源于自然界，而且属于植物性蛋白来源，其绿色生态养殖价值越来约得到大家重视，在生产上具有重要的应用价值。4、本发明的杂交方法得到的二倍体鳙鲂，从遗传稳定程度上看，杂交后代中亲本染色体组分离能够有效降低遗传物质不兼容现象，提高杂交后代的存活率；同时，本发明的杂交方法为大规模获得鳙鲂提供了一种手段，丰富了其它杂交组合的一个亲本来源。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为鳙鱼(♀)和团头鲂(♂)杂交后代中二倍体鳙鲂的外形图；图2为鳙鱼(♀)和团头鲂(♂)杂交后代中二倍体鳙鲂养殖试验图；图3为鳙鱼(♀)和团头鲂(♂)杂交后代中二倍体鳙鲂dna含量图；图4为鳙鱼(♀)和团头鲂(♂)杂交后代中二倍体鳙鲂血细胞图；图5为鳙鱼(♀)和团头鲂(♂)杂交后代中二倍体鳙鲂染色体图。具体实施方式为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。实施例1：一种鳙鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，包括如下步骤：(1)在当年的3月初，拉网打鱼，从中挑选性成熟特征明显、无病无伤、体征良好的雌性鳙鱼和雄性团头鲂作为远缘杂交的亲本，置于专门的池子中进行培育，并在培育期间，时刻注意保持水体水质良好、水中含氧量充足，保证繁殖期的亲本具有良好的状态，做好饲养管理工作，在繁殖期前一个月，每天都用流水来刺激，以促进亲鱼性腺发育成熟；(2)在当年的5月中旬到6月上旬，当水温稳定在20℃以上，以22-25℃最佳，从步骤(1)得到的亲鱼中挑选出腹部膨大、松软且有弹性的雌性鳙鱼作为母本，和轻挤压腹部便能挤出乳白色精液的雄性团头鲂作为父本，进行人工催产，具体是对母本亲鱼采用两针注射法注射催产剂，对父本亲鱼采用一针注射法注射催产剂，首先对母本亲鱼注射催产剂pg1mg/kg或lrh-a1μg/kg，同时采用与母本亲鱼相同的催产剂对父本亲鱼进行注射，剂量相较于母本亲鱼减半；隔3h后进行母本亲鱼第二针注射，对母本亲鱼注射lrh-a15μg/kg、pg2mg/kg和hcg1000iu/kg组成的混合催产剂；等注射完毕后，将母本亲鱼和父本亲鱼按照不同比例数量放在同一产卵池内，便于观察亲鱼产卵，一般注射完毕6-7h后会发现雌雄鱼追逐现象，立即拉网检查，轻轻挤压母本腹部，有卵粒源源流出，同时选出相应父本，尽快准备人工授精。(3)在步骤(2)得到的母本亲鱼和父本亲鱼中，挑选产卵顺利的母本亲鱼和产精量大父本亲鱼进行人工干法授精，授精时，要尽量保证亲本体表不覆盖大量水体，将精、卵挤入干燥受精盆中，同时用羽毛快速搅拌，避免阳光直射，搅拌2-3min后，均匀泼洒在孵化槽中；得到的受精卵置于水温为22℃左右的孵化槽中继续进行流水孵化，得到鳙鱼和团头鲂的杂交后代鱼苗。(4)将孵化培养得到后的杂交后代鱼苗置于孵化槽中继续培养3天，待所述杂交后代鱼苗出现腰点后，后转入事先用豆浆已培肥的水泥池中饲养，放苗后每天向水泥池中泼洒豆浆两次，放入圆藻，以保证鱼苗的营养供给，待鱼苗长到5-8cm长后开始喂饲料粉；然后采用外形测量法、流式细胞dna含量法、血涂片法、血细胞形态鉴定法和染色体形态制片法对饲养的后代进行检测筛分，得到二倍体鳙鲂的外形见图1。将上述的杂交后代饲养3-4个月左右后，随即检测杂交后代的相关指标，并与母本鳙鱼和父本团头鲂进行比较，结果如表1所示：表1：鳙鱼、团头鲂及其杂交后代的可数性状比较(单位：片或条)鱼品种侧线鳞侧线上鳞侧线下鳞背鳍条腹鳍条臀鳍条鳙鱼103-10528-2915-16ⅲ±7-87-8ⅲ±13-14团头鲂50-528-109-11ⅲ±8-98-10ⅲ±26-28鳙鲂74-7615-197-10ⅲ±8-108-9ⅲ±17-18由表1可知杂交后代二倍体鳙鲂在外形上(侧线鳞、背鳍条、胸鳍条、腹鳍条、臀鳍条)都介于母本鳙鱼和父本团头鲂之间，具有明显的杂交特征。表2：鳙鱼、团头鲂及其杂交后代的可量性状比较鱼品种体长/全长体高/体长头长/体长头高/头长尾柄高/尾柄长头高/体高鳙鱼0.65±0.090.31±0.010.43±0.040.70±0.050.13±0.100.96±0.01团头鲂0.84±0.060.53±0.050.23±0.070.88±0.041.03±0.040.58±0.05鳙鲂0.80±0.010.31±0.010.29±0.010.79±0.040.73±0.070.73±0.07从表2的可量性状发现，二倍体鳙鲂的可量性状都介于母本鳙鱼和父本团头鲂之间，具有明显的杂交特征。杂交后代二倍体鳙鲂养殖试验图如图2所示，养殖试验表明，该杂交鱼具有生长速度快，抗病性强，净化水质，草食性的特征。鳙鱼与团头鲂杂交后代经过检测筛选：以母本鳙鱼和父本团头鲂作对照，用流式细胞仪测量二倍体鳙鲂dna含量，如图3所示，其dna含量为54.88，从而说明杂交后代为二倍体鱼。为了鉴定这几种鱼的细胞核差异形态，我们制备了血涂片，如图4所示，通过比较，我们发现二倍体鳙鲂和二倍体团头鲂的细胞核大小一致。再用外周血细胞制片法对母本鳙鱼和父本团头鲂的杂交后代体细胞染色体数目进行检测，如图5所示，通过计数发现杂交后代的染色体数目都为48条，从而证明杂交后代是二倍体。流式细胞dna含量测定的步骤：先用络合碘纱布将实验鱼尾静脉部位擦拭干净，用经抗凝剂润湿的1ml一次性注射器从实验鱼尾静脉血管部采血约0.2ml，注入eppendorf管中，用移液枪将被测样品加入到新的eppendorf管中并将其稀释至微红色，然后再加入500微升细胞核提取液dapi-a，避光条件下，反应10-15min。然后将样品导入20μm尼龙过滤器中过滤，最后上机检测。血涂片法步骤为：用棉签蘸取75％酒精擦拭鱼尾静脉部位，用经抗凝剂润湿的1ml一次性注射器取0.5ml血液，注入到无菌干燥并且装有抗凝剂的eppendorf管中，用移液枪取10微升血液滴于玻片的一侧。取一个新的无菌玻片成45度方向压在血液上迅速推到载玻片的一端，使血滴均匀的铺在玻片上成一直线。经空气中干燥后，滴加瑞氏染色液(6-8滴)，使涂片被染色液覆盖；染色1min后，再加入磷酸缓冲液继续染10min，最后用流水轻轻冲洗载玻片背面，空气中自然晾干后，镜检。外周血细胞培养的染色体倍性检测法：在超净工作台中配制培养基，100ml培养基包含以下成分：84mlrpmi-1640，15ml小牛血清，2支pha，1ml0.1％肝素钠，以7.5％nahco3(无菌)或nacl调ph至7.2-7.4。用注射器吸取少量灭菌肝素钠溶液，于用碘酒消毒后的实验鱼尾部静脉取血。按每10ml培养液中加入约0.2ml抗凝血的标准将抗凝血加入培养液中，于24℃5％二氧化碳浓度的培养箱中培养68-72h，培养期间，定期轻轻摇匀，以使细胞充分接触培养基。终止培养前24h，在培养液中用1ml注射器滴加入10μg/ml的秋水仙碱，使其终浓度为0.05-0.07μg/ml。以上步骤均需无菌操作。取杂交鱼的培养物经处理后转入无菌洁净的10ml离心管中，以1500rpm离心5min，弃上清液。向离心管中加入低渗液5ml，用吸管轻轻吹打使其混匀，然后加至9ml后，低渗45-60min。加入1ml固定液(甲醇：冰醋酸约3:1)，用吸管轻轻吹打使其混匀1500rpm离心5min，弃上清液。加入5ml固定液，轻轻混匀，静置10min后1000rpm离心5min，弃上清液终止培养前24h，在培养液中用1ml注射器滴加入10μg/ml的秋水仙碱，使终浓度为0.05-0.07μg/ml。以上步骤均需无菌操作。最后根据细胞数量加入适量固定液制成细胞悬液(一般为1-2ml)后，然后吸取细胞悬液从50cm高处滴片，平直端起，用酒精灯外焰缓慢烘干。再giemsa染液染色40-60min，细流水冲洗载玻片背面洗去染液，自然干燥后镜检、拍照。本发明的方法，解决了鳙鱼和团头鲂之间远缘杂交困难的问题，本发明采用人工催产的方式并选用特定的混合催产剂，以合适的剂量注入亲鱼腹腔内进行催产，可以加快性腺成熟，缩短催产时间，催产率(90％)和孵化率(95.36％)明显增高，这样对于筛选各种杂交品种后代提供了数量上的最大可能，不仅整合了鳙鱼与团头鲂的优良性状，丰富了市场鱼类品种，而且为优良品种的选育奠定了良好基础，在生物进化和鱼类遗传育种具有重要的生物学意义。本发明方法获得的二倍体鳙鲂杂交鱼，从遗传稳定程度上看，杂交后代中亲本染色体组分离能够有效降低遗传物质不兼容现象，提高杂交后代的存活率(95.36％)，整合了亲本的优良性状，不仅食用价值很高，而且生长速度快，抗病性强，耐低氧；同时，本发明的杂交方法为大规模获得鳙鲂提供了一种手段，丰富了其它杂交组合的一个亲本来源。当前第1页12