一种银缕梅种子破除休眠快速萌发的方法

本发明涉及一种银缕梅种子破除休眠快速萌发的方法，属于植物种植。

背景技术：

1、银缕梅(parrotia subaequalis)为落叶小乔木，属金缕梅科银缕梅属植物，距今6700万年前就存在，与银杏、水杉、珙桐等，都是古老被子植物。银缕梅是我国特有的“活化石”树种，先后被列入国家一级重点保护野生植物和《全国极小种群野生植物拯救保护工程规划》，《中国红色植物名录》将其濒危等级评定为极危(cr)级别。

2、银缕梅无花瓣，花丝下垂，蒴果近圆形，种子纺锤形，两端尖，褐色有光泽，5月开花。从花芽分化至花苞展开需约1a的时间；从花苞开至雌雄蕊外露20d，过后雄蕊才接近成熟，同时雌蕊还需迟熟5～9d，属于典型的雌雄异熟型，传粉受精成功率低。银缕梅的生境多为沟谷山坡，在一定程度上阻碍了风媒传粉过程。与其它风媒授粉、繁殖体系异交的植株相比，花粉流和与种子流量的比率明显降低，这会导致居群有效种群数量减少，种子结实下降等。由于其开花习性特殊，有时连续三年开花，有时三五年不开花，种子获取也非常困难，同时，又因其为无被花、雌雄蕊异熟，进一步加大了种子获取的难度，对人工繁育产生了一定的影响。关于银缕梅的无性繁殖主要集中于扦插嫁接等方面，一方面存活率低，另一方面可能降低其遗传多样性。

3、银缕梅有性繁殖主要集中在种子萌发的研究上。研究发现物理或化学的方法可以提高种子发芽率，打破休眠。国内外学者利用赤霉素处理和沙藏方式对银缕梅种子进行处理，发现在浓度为1200mg/l ga3溶液浸泡24h，同时在4℃下层积处理120d后，可显著提高银缕梅种子的发芽率，为71.3％，而未经沙藏下种子不能发芽。不少研究表明，不同层积方式、温度变化、赤霉素处理、光照条件对种子萌发的影响均不一致。最适的种子处理方式为常温沙藏120d以上、用浓度为600mg/l的赤霉素处理种子、种子萌发的环境温度为25℃左右的组合方法，可显著提高发芽率，达73.7％。而对于随采随播的种子，发芽率低于10％。有学者将储藏一年、两年的种子进行萌发，发现萌发率较当年大为下降，储藏两年的种子萌发率为12.33％。可见种子寿命不长，有效期短。

4、从上述分析中可以看出，目前银缕梅种子萌发的技术中采用较多的沙藏方式打破休眠，实现萌发。而种子的休眠分为两个方面，一是内源性抑制物，二是其坚硬的外壳阻碍透性。由于银缕梅种子成熟在每年11月份，而种子发芽对于温度要求严格。所以要选择适当播种温度和播种季节。因此，大多数研究通过沙藏的方式与赤霉素结合，越过冬季，待开春进行播种。这就限制了播种季节与温度，对于其坚硬的外壳，有学者提出采用低浓度酸碱进行腐蚀，一方面会不容易控制酸碱腐蚀时长，另一方面对种子破坏性较大，很难萌发。而采用机械剥壳的方法难度也非常大，这是因为银缕梅种子较小且种壳与种皮常常粘连在一起，机械剥壳常常会破坏种子内部完整性，使得种皮甚至种胚被破坏，对于后续萌发造成影响。因此有必要对银缕梅种子打破休眠实现快速萌发的技术进行探索。

技术实现思路

1、为克服现有的银缕梅种子萌发技术中种子处理时间长、萌发率低、存在季节限制的缺点，本发明提供了一种用赤霉素在温水条件下浸种与物理剥壳相结合的方法使银缕梅种子破除休眠快速萌发的方法。该方法与现有的银缕梅的种子打破休眠实现萌发技术相比较，既保证了一定的萌发率，又将整个萌发过程包括种子前处理的时间大为缩短，实现了20天时间内种子发芽率达到80％以上，该方法使银缕梅的萌发率和萌发时间达到了最佳的组合状态。此外，在现有技术中，均需要通过沙藏的方法使11月份收集的种子越过冬季，待开春3、4月份进行播种，对于11月份采集的种子进行随采随播，种子不能萌发。然而，本发明采用的技术可以实现冬季萌发，突破了现有的技术难题。本发明所采用的种子收集于11月初，在实验条件下，均实现了冬季萌发且后续幼苗生长良好。

2、为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种银缕梅种子破除休眠快速萌发的方法，所述步骤如下：

3、(1)对野外采集的种子进行干燥：用网纱编织袋装好种子，而后悬于通风干燥处进行自然干燥；

4、(2)对种子进行消毒：在无菌操作台内，用浓度为75％的酒精对于银缕梅种子进行时长5分钟浸泡消毒，而后用无菌水冲洗3-5遍，而后用浓度为0.1％的氯化汞进行8-12分钟的浸泡消毒处理，无菌水冲洗3-5遍；

5、(3)温水浸种：配制浓度为600-1200mg/l的赤霉素溶液，将银缕梅种子置于不同浓度赤霉素溶液中，装入种子水培盒，采用恒温水槽进行进行浸种处理，设置浸种温度为36℃，浸泡时间为36-72小时，直至可观察到银缕梅坚硬的种壳全部出现整齐的裂缝；

6、(4)种子剥壳处理：对于浸泡过后的开裂种子，可对其进行人工剥壳处理，将赤霉素溶液倒去，无菌水冲洗3-5遍，而后用镊子夹住开裂的种子，轻轻去除种壳，整个流程中注意保持种子湿润状态，不可置于空调下，种子容易失水而失活；

7、(5)对预处理过后的种子进行光照培养：将剥除外壳的种子在蒸馏水中冲洗浸润，以去除残留的赤霉素溶液，而后置于灭过菌的培养皿内，垫上一层无菌滤纸，将滤纸滴加蒸馏水至完全湿润而不积水的状态，用封口膜对培养皿进行封口处理，将上述处理完成的装有种子的培养皿做好标记，放在恒温光照培养箱内培养,温度25℃，湿度75％，光照强度为3500-4500xl；

8、(6)观察记录：观察记录萌发情况，若培养皿内滤纸出现干燥现象，及时滴加无菌水后封口放回；若培养皿内种子出现染菌现象，则单独挑出染菌的种子，剩余种子更换滤纸后继续培养，统计种子萌发率，萌发标志以胚根刚刚突破种皮作为标准。

9、优选的，所述步骤(2)中，用浓度为75％的酒精对于银缕梅种子进行时长5分钟浸泡消毒，无菌水冲洗3遍。

10、优选的，所述步骤(2)中，0.1％氯化汞浸泡消毒处理时间为10分钟。

11、优选的，所述步骤(3)中，赤霉素溶液浓度为800mg/l。

12、优选的，所述步骤(3)中，浸泡时间为72h。

13、优选的，所述步骤(4)中，无菌水冲洗3遍。

14、优选的，所述步骤(5)中，光照强度设为4000xl。

15、优选的，(1)对野外采集的种子进行干燥：用网纱编织袋装好种子，而后悬于通风干燥处进行自然干燥，

16、(2)对种子进行消毒：在无菌操作台内，用浓度为75％的酒精对于银缕梅种子进行时长5分钟浸泡消毒，而后用无菌水冲洗3遍，而后用浓度为0.1％的氯化汞进行10分钟的浸泡消毒处理，无菌水冲洗5遍；

17、(3)温水浸种：配制浓度为800mg/l的赤霉素溶液，将银缕梅种子置于不同浓度赤霉素溶液中，装入种子水培盒，采用恒温水槽进行进行浸种处理，设置浸种温度为36度，浸泡时间为72小时，直至可观察到银缕梅坚硬的种壳全部出现整齐的裂缝。

18、(4)种子剥壳处理：对于浸泡过后的开裂种子，可对其进行人工剥壳处理。将赤霉素溶液倒去，无菌水冲洗3遍，而后用镊子夹住开裂的种子，轻轻去除种壳，整个流程中注意保持种子湿润状态，不可置于空调下，种子容易失水而失活。

19、(5)对预处理过后的种子进行光照培养：将剥除外壳的种子在蒸馏水中冲洗浸润，以去除残留的赤霉素溶液，而后置于灭过菌的培养皿内，垫上一层无菌滤纸，将滤纸滴加蒸馏水至完全湿润而不积水的状态，用封口膜对培养皿进行封口处理，将上述处理完成的装有种子的培养皿做好标记，放在恒温光照培养箱内培养。放在恒温光照培养箱内培养,温度25℃，湿度75％，光照强度为4000xl；

20、(6)观察记录：观察记录萌发情况，若培养皿内滤纸出现干燥现象，及时滴加无菌水后封口放回；若培养皿内种子出现染菌现象，则单独挑出染菌的种子，剩余种子更换滤纸后继续培养。统计种子萌发率，萌发标志以胚根刚刚突破种皮作为标准。

21、有益效果：

22、本发明涉及一种银缕梅种子破除休眠快速萌发的方法，属于植物种植技术领域。本发明提供了一种用赤霉素浸泡与物理剥壳相结合使珍稀濒危植物银缕梅种子破除休眠快速萌发的方法，该方法采用对野外收集干燥后的种子进行预处理，包括种子消毒、36℃恒温水浴条件下赤霉素浸种、物理剥除外壳，然后将种子置于培养皿内，垫上一层滤纸，于恒温光照培养箱中培养，设置温度为25度，湿度75％，光照强度为4000xl,每日观察直至种子萌发完全结束。这种萌发方法不仅操作简便，可实行性高，而且在大大缩短育种周期的前提下保证了较高的萌发率。用本发明方法可使银缕梅种子经过实验室萌发后直接播种到育苗框内进行培养。于其他的银缕梅种子萌发技术相比，不仅萌发时间短，而且无需越过冬季进行播种，对于新鲜采集的银缕梅种子，可及时播种萌发，保证了种子的活力最佳。银缕梅作为珍稀濒危植物，具有数年开一次花的现象，对于收集的种子进行有效的破除休眠快速萌发，在提高种子利用率方面有重要的意义，同时，银缕梅作为极具观赏性的植物，找到其种子高效萌发的技术，在生产实践中亦具有重要的经济价值。

23、本发明，通过赤霉素解决内源性抑制的问题，同时银缕梅坚硬的外壳通过36℃水浴加热72小时，会自主开裂，对于后续的剥壳带来了极大的便捷，也增加了种子的透性。温度与光照因素采用光照培养箱控制，在设定的条件下，无需经过漫长的沙藏，即可打破种子休眠，实现了萌发无需越过冬季，提供了季节的可选择性。同时实验结果表明，在相关条件下，萌发率得到了极大的提高，达81.1％，与未进行浸种、剥壳处理、随采随播等对照相比，有显著的提高。

24、本发明通过将采摘的种子进行干燥处理、消毒，利用36℃恒温水浴的方法，达到银缕梅种子自主开裂的效果，然而通常的手段是冷水浸种或赤霉素常温浸种，但常温条件下短时间的浸种效果均未使得银缕梅种子自主开裂，因此必须经过长时间沙藏继续软化种皮实现种壳开裂，在种子收集后通常需要越过整个冬季才能实现种壳软化开裂，即使采用低浓度酸腐蚀或机械强行剥除外壳，也难以实现完整剥离外壳。由于银缕梅种壳非常坚硬且粘连种皮种胚，采用酸蚀的方法无法把控具体时长以及酸的浓度，而且对于不同大小的种子，无法统一酸蚀时长，对种子造成了不同程度的损伤，后续萌发无法实现。同样，采用机械剥壳的方法，时间久技术难度大，完全获取完整的去壳种子。在36℃下恒温水浴，利用赤霉素溶液浸泡处理可以轻松实现人工剥壳，所获得的种子置于无菌培养皿内，于人工气候培养箱25℃、湿度75％恒温光照培养，直至种子萌发完成。通过实验统计，采用本方法培养7天的种子，有46.67％的胚根突破种皮，培养第14天有73.33％，培养20天时种子的萌发率达到81.1％％，比现有技术条件下萌发率都高。

25、可见，本发明提供的是一种萌发时间短、萌发率高的银缕梅种子繁殖技术。该方法不仅操作简便，可实行性高，而且在大大缩短育种周期的前提下保证了较高的萌发率，突破了季节限制，在冬季完全可以实现种子萌发和幼苗生长。后续操作中，待胚根突破种皮至一定长度时，将其转移到装有泥炭土和珍珠岩的育苗框内，约两周可见两片子叶伸展且株高达2厘米以上。

26、当浸泡温度高于36℃时，在40℃及以上温度持续浸种，种子受高温影响，活力不强，将种子播撒于土壤基质中，经过70余天未见发芽；而当采用常温如20-25℃时，外壳完全不开裂，无法进行剥壳处理，必须经过后续沙藏达到开裂效果从而实现萌发。因此，浸种最佳温度为36℃。当浸泡时间低于36h时，银缕梅种壳开裂不完全。所有经过浸泡的银缕梅种子，有近70％实现了开裂，有30％的种子仅出现裂缝，开口程度低，此时若剥离外壳会导致种皮破损甚至种胚连带外壳同时分裂，后续萌发过程受到影响。浸泡温度36℃时、浸泡时间72h、800mg/l的赤霉素浓度下，如实施例2所示为最佳的银缕梅种子的萌发条件。相比于36小时浸种去壳后的发芽率，在此条件下第7天、第14天以及第20天，800mg/l的赤霉素浓度浸种仍然为各浓度梯度下最高的萌发率，分别为38.9％、54.4％以及78.3％；而在1200mg/l的赤霉素浓度下，浸种时长更长72h，萌发率也略有提高。大大缩短育种周期的前提下保证了较高的萌发率，突破了季节限制，在冬季完全可以实现种子萌发和幼苗生长。