专利名称:一种提高樟芝活性产物产量的固态培养方法
一种提高樟芝活性产物产量的固态培养方法技术领域：
[0001]本发明涉及一种提高樟芝活性产物产量的培养方法，尤其是一种通过两阶段温度控制固态发酵提高樟芝代谢产物Antrodins和Antroquinonol的方法。技术背景[0002]場HAntrodia是我国台湾特有的珍稀药用真菌,又名牛樟燕、牛樟芝，属于担子菌纲、非褶菌目、多孔科、多年生担子菌，生长在台湾地区的牛樟树腐朽树干的内壁。樟芝成分复杂，含有三萜、留醇、腺苷、多糖、酚类物质等多种活性成分。在民间，樟芝长久以来被用作解救保肝的传统药，用于治疗肝脏疾病，食物和药物所引起的中毒症状以及腹泻，腹痛，高血压，皮肤发痒和肿瘤疾病等。近年来，不少学者研究显示樟芝具有抗癌、保肝、抗炎、抗DNA损伤等生理活性功能。在市场上，樟芝野生子实体售价高达15000美元/公斤，远高于灵芝、人参、冬虫夏草等传统药材，樟芝越来越受大众的关注。[0003]现代研究表明，樟芝活性成分在保肝、抗癌等方面拥有非常良好的效果。民间视樟芝为保肝良药，传说台湾原住民因嗜酒而肝病比例偏高，服用樟芝煎液后肝脏健康状况则大为改善。樟芝菌丝体的乙醇萃取物对野生型和拉米夫定抗性突变株HBV病毒均显示良好的效果。无论体内还是体外实验，樟芝子实体和菌丝体都表现出良好的抗癌活性。Madamanchi等研究显示樟芝子实体的CHCl3/MeOH提取物对P-388鼠细胞具有显著的细胞毒素作用，EC50为4.1 Ug/mL。樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物对癌细胞系H印G2,Hep 3B、PLC/PRF/5显示出良好的凋零作用。[0004]实验表明，樟芝固态发酵菌体所含有的特征活性成分为Antrodins和Antroquinonol。Nakamura等人从樟芝液态发酵菌体中分离得到五种新的马来酸和琥拍酸衍生物(Antrodin A-E)，是液态发酵樟芝菌体中的主要活性成分，具有显著的抗肝炎活性，其中Antrodin B和Antrodin C对LLC癌症细胞具有良好的抑制效果。Phuong研究结果显示樟芝菌丝体中含有的Antrodin A-E对HCV病毒都具有很好的抑制活性，其中Antrodin A抑制能力最高；研究同时发现在体内Antrodin C可以转化为Antrodin A,从而展现良好的保肝活性。樟芝菌体中的Antrodins类化合物是自1968年发现飞水蓟素之后，保肝活性最好的天然产物。Lee等人用正己烷萃取樟芝固态发酵粉末，得到一个新化合物(Antroquinonol)，属于泛醌类化合物，实验表明对乳腺癌、肝癌和前列腺癌等多种癌细胞具有良好的抗癌效果，同时具有抑制HBsAg和HBeAg合成的潜力，从而抑制HBV的复制。[0005]公开号为CN137908 (发明名称:樟芝的固体培养方法，所得固体培养物及其产品与用途)、CN101803534A (发明名称:一种樟芝的大规模固体培养方法)等专利文献公开了一系列樟芝固态培养的方法，但是上述文献所用的技术均为太空包固体培养法，得到的产品是樟芝子实体，培养周期较长，并没有关于樟芝固态发酵特征药用成分Antrodins和Antroquinonol生产方法的报道。。[0006]在CNlOl 151957，黄等人揭示一种以固态培养基培养樟芝的方法，首先在PDA斜面培养基上预培养樟芝菌体， 取出一部分培养出的樟芝并将其接种在一液态培养基中。之后，将液态培养基中的樟芝接种到固态培养基中培养。固态培养基主要由米、琼脂、一种碳源、一种氮源、无机盐等组成。在CN101151957，此方法可以大规模的得到樟芝菌体混合物，并且具有与野生樟芝子实体类似的生理活性。但是，该方法所公开的产物为樟芝固态发酵菌体混合物，并没有关于樟芝固态发酵特征药用成分Antrodins和Antroquinonol生产方法的报道。[0007]由于富含生理活性物质的樟芝产品的需求与日俱增，急需一种特殊的大规模人工培养樟芝的方法，该方法可以有针对性地提高樟芝特征活性产物Antrodins和Antroquinonol类化合物的含量，以提高樟芝产品品质，满足市场的不断更新发展。而根据我们查新报告表明，目前并没有关于樟芝特征活性产物Antrodins和Antroquinonol的培养方法及过程优化的报道。樟芝菌的固态发酵，温度对其生物活性物质的生物合成，有着非常重要的作用。其主要机理是生物合成酶的最佳作用温度在不同的生产阶段是不同的。高温期和中温期的时间也是有一定的规律可循的。因此在一定的时间内采用不同的发酵温度，可以促进生物活性物质的生物合成。故最佳的发酵时间和发酵温度需要通过大量的实验来确定。本专利的关键技术就是基于长期的试验及大量的分析而得出的较佳操作方案。
发明内容
[0009]本发明所要解决的技术问题是提供一种提高樟芝活性产物产量的固态培养方法，以显著提高樟芝特征活性产物Antrodins和Antroquinonol类化合物的产量。[0010]为解决上述技术问题，本发明的技术方案为:[0011]首先制备樟芝斜面菌种和液态种子，之后将液态种子接种于固态培养基上进行培养。在培养的第一阶段(0-20d)，控制培养温度在26-32°C之间；在培养的第二阶段(20-40d)，控制培养温度在18-26°C之间。[0012]第一阶段主要是樟芝菌丝体的生长阶段；第二阶段是樟芝生理活性物质的生物合成阶段。[0013]本发明所用的樟芝菌株C4/7tro￡/ia来源于台资企业上海福茂食用菌有限公司。菌种来源可参考中国专利:201010164142.3，已公开。[0014]所述樟芝的接种量为10%_50%之间，其是以固态培养基的总重量为100%计。[0015]固态培养基包括基质、氮源以及一种以上的无机盐，所述基质为玉米、薏仁米、高粱、大米、糯米、小米及其组合；所述氮源为NH4C1、蛋白胨、黄豆粉、玉米浆粉、麦芽抽提物、酵母抽提物及其组合，氮源的添加重量百分比是0.3-6% ;所述无机盐例为磷酸盐、硫酸镁、柠檬酸盐、氯化钠及其组合其中；磷酸盐为K2HP04、KH2P04、NaH2P04、Na2HPO4及其组合；所述无机盐的添加重量百分比是0.02-2 %;固态培养基配制完成后121°C灭菌10-40min，然后冷却至15-25 °C待用。[0016]Antrodin B> Antrodin C 和 Antroquinonol 米用高效液相色谱法(HPLC)进行分析。取粉碎的樟芝固态发酵粉末0.5g,加入60ml乙醇，50°C,振荡萃取1.5h,静置后取上清经过0.22 ii m滤膜微滤,进行HPLC分析。分析条件如下:色谱柱:Sepax AmethystC18 (4.6 mmX 250 mm);流速:1 mL/min ;检测波长:254 nm ;流动相 A:水 / 乙酸=100/0.5,流动相B:乙腈；洗脱梯度如下:0-10min，流动相B 35%_50% ;10_35min，流动相B 50%-60% ；35-50min，流动相 B 60%_80% ;50_60min，流动相 B 80%_100%。[0017]利用本发明能显著提高樟芝活性产物Antrodins和Antroquinonol类化合物的产量。用此两阶段温度控制工艺固态培养樟芝活性产物，其中Antrodin C产量达5.0-7.0mg/g, Antrodin B 产量达 1.0-2.0mg/g, Antroquinonol 产量达 L 2-2.5mg/g。本发明所提供的樟芝活性产物两阶段温度控制技术工艺简单、高效，有着重要的工业应用价值，同时樟芝其他活性代谢产物的生产具有一定的启迪意义。
具体实施方式
[0018]实施例1[0019]樟芝菌种先转斜面在28°C培养箱中培养12d，然后接入液态培养基中培养。液态培养基(g/L):葡萄糖20, Na2HPO4 0.5，MgSO4 0.5，柠檬酸0.5，黄豆粉4，玉米浆粉2。[0020]液体培养条件为:培养温度28°C，摇床转速100 r/min, pH 4.0，培养时间4d。固态培养基:采用食品级谷物(玉米、小米、高粱等)发酵。NH4Cl 0.3%, Na2HPO4 0.02%，以固态培养基的总重量为100%计。将氮源及盐类配制成营养液，谷物与营养液的比例为4:1，pH3，121°C 灭菌 20min。[0021]两阶段温度控制技术:在固态培养的第一阶段(0-20d)控制培养温度为26_32°C，以获得菌体的较快生长。在固态培养的第二阶段(20-40d)控制培养温度为18°C。用此两阶段温度控制策略固态培养樟芝生产特征活性产物，Antrodin C产量达5.0mg/g, AntrodinB 产量达 1.0mg/g, Antroquinonol 产量达 1.2mg/g。[0022]实施例2[0023]樟芝菌种先转斜面在28°C培养箱中培养12d，然后接入液态培养基中培养。液态培养基(g/L):葡萄糖20，Na2HPO4 0.5，MgSO4 0.5，柠檬酸0.5，黄豆粉4，玉米浆粉2。[0024]液体培养条件为:培养温度28°C，摇床转速100 r/min, pH 4.0，培养时间4d。固态培养基:采用食品级谷物(玉米、小米、高粱等)发酵。Na2HPO4 1%，MgSO4 0.02%，玉米浆粉3%，以固态培养基的总重量为100%计。将氮源及盐类配制成营养液，谷物与营养液的比例为 2:1，pH 5.0，121°C灭菌 20min。[0025]采用两阶段温度控制固态培养法，其余条件同实施例1。在固态培养的第一阶段(0-20d)控制培养温度为26-32°C，以获`得菌体的较快生长。在固态培养的第二阶段(20-40d)控制培养温度为22°C。用此两阶段温度控制策略固态培养樟芝生产特征活性产物，Antrodin C产量达7.0mg/g, Antrodin B产量达2.0mg/g, Antroquinonol 产量达2.5mg/g°[0026]实施例3[0027]樟芝菌种先转斜面在28°C培养箱中培养12d，然后接入液态培养基中培养。液态培养基(g/L):葡萄糖20, Na2HPO4 0.5，MgSO4 0.5，柠檬酸0.5，黄豆粉4，玉米浆粉2。[0028]液体培养条件为:培养温度28°C，摇床转速100 r/min, pH 4.0，培养时间4d。固态培养基:采用食品级谷物(玉米、小米、高粱等)发酵。KH2PO4 2%，黄豆粉6%，以固态培养基的总重量为100%计。将氮源及盐类配制成营养液，谷物与营养液的比例为1: l，pH 7.0。121°C 灭菌 20min。[0029]采用两阶段温度控制固态培养法，其余条件同实施例1。在固态培养的第一阶段(0-20d)控制培养温度为26-32°C，以获得菌体的较快生长。在固态培养的第二阶段(20-40d)控制培养温度为26°C。用此两阶段温度控制策略固态培养樟芝生产特征活性产物,Antrodin C产量达6.5mg/g, Antrodin B 产量达 1.7mg/g, Antroquinonol 产量达 2.0mg/g°[0030]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求
书所 界定的为准。
权利要求
1.一种提高樟芝Antrodins和Antroquinonol类化合物产量的固态培养方法,其特征在于樟芝种子液接种后采用阶段培养法，第一阶段培养温度为26-32°C，培养时间为20天，第二阶段培养温度为22°C，培养时间为20-40天。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于固态培养的培养基包括基质、氮源以及一种以上的无机盐，PH3.0-7.0 ;所述基质为玉米、薏仁米、高粱、大米、糯米、小米及其组合。
3.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述氮源为NH4C1、蛋白胨、黄豆粉、玉米浆粉、麦芽抽提物、酵母抽提物及其组合，氮源的添加重量百分比是0.3-6%。
4.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于所述无机盐为磷酸盐、硫酸镁、柠檬酸盐、氯化钠及其组合，其中，磷酸盐为K2HP04、KH2PO4, NaH2PO4, Na2HPO4及其组合；所述无机盐的添加重量百分比是0.02-2%;固态培养基配制完成后121°C灭菌10-40min，然后冷却至15-25 °C 待用。
5.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于所述樟芝的接种量为10%-50%之间，其是以固态培养基的总重量为100%计。`
专利摘要
本发明公开了一种用两阶段温度控制技术提高樟芝活性产物产量的固态培养方法。首先制备樟芝斜面菌种和液态种子，之后将液态种子接种于固态培养基上进行培养。在培养的第一阶段(0-20d)，控制培养温度在26-32℃之间；在培养的第二阶段(20-40d)，控制培养温度在18-26℃之间。用此两阶段温度控制工艺固态培养樟芝活性产物，其中AntrodinC产量达5.0-7.0mg/g，AntrodinB产量达1.0-2.0mg/g，Antroquinonol产量达1.2-2.5mg/g。本发明所提供的樟芝活性产物两阶段温度控制技术工艺简单、高效，有着重要的工业应用价值，同时樟芝其他活性代谢产物的生产具有一定的启迪意义。
文档编号C05G1/00GKCN102356728 B发布类型授权 专利申请号CN 201110231868
公开日2013年6月26日 申请日期2011年8月15日
发明者许赣荣, 夏永军, 喻学淳 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan