具有半乳聚糖酶活性的酶的制作方法

专利名称：具有半乳聚糖酶活性的酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有半乳聚糖酶活性的酶、编码具有半乳聚糖酶活性的酶的DNA构建体、产生所说酶的方法、含有所说的具有半乳聚糖酶活性的酶的酶组合物以及所说的酶和酶组合物在许多工业上的应用。
背景技术：
半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖作为果胶多毛区的成分存在于许多植物中。它们通常与多毛区的鼠李糖半乳聚糖骨架的鼠李糖残基的O-4相连。侧链的分布和组成随不同的细胞类型和生理状态变化较大，但是，一般来说，鼠李糖半乳聚糖区大约一半的鼠李糖基单元具有结合的侧链。在大多数植物中，半乳聚糖侧链为1型半乳聚糖，这些半乳聚糖是由带有一些分支点的通过β-1,4连接的半乳糖吡喃糖组成的，总长度多达60个糖单元(DP60)。阿拉伯呋喃糖残基或短的阿拉伯聚糖寡聚物可以在半乳糖基单元的O-3上与半乳聚糖链连接，因此将其命名为阿拉伯半乳聚糖。半乳聚糖(或阿拉伯半乳聚糖)在初生细胞壁中具有重要作用，它们与细胞壁中的其它结构成分(例如木葡聚糖和阿拉伯木聚糖)相互作用。因此，它们的作用是将果胶基质锚定在细胞壁中。而且，它们增加了水合和结合水的能力，并减少了果胶聚合物之间的链间缔合，所说的果胶聚合物被认为是调节孔隙率和被动扩散的重要物质(Carpita和Gibeaut,1993，植物杂志3,1-30；O′Neill等，1990，植物生物化学方法，415-441；Selvendran,1983，植物细胞壁化学，食用纤维；Hwang等，食用水状胶质，7,39-53；Fry,1988，正在生长的植物细胞壁化学和代谢分析)。
β-1,4-半乳聚糖酶(E.C.3.2.1.89)能够降解半乳聚糖(阿拉伯半乳聚糖)，并已经从各种微生物中纯化得到了这种酶(Nakano等，1985，农业生物化学，49,3445-3454；Emi和Yamamoto,1972，农业生物化学，36,1945-1954；Araujo和Ward,1990,J.Ind,Microbiol.,6,171-178；Van DeVis等，1991，碳水化合物聚合物，16,167-187)。
尽管已经纯化出了很多β-1,4-半乳聚糖酶，但是克隆并进行DNA测序的只有一种。
WO 92/13945描述了真菌β-1,4-半乳聚糖酶(棘孢曲霉)的克隆和测序方法。
发明概述按照本发明，目前发明人首次成功地从担子菌门真菌分离了编码具有半乳聚糖酶活性的酶的DNA序列，并鉴定了它的性质，因此使制备单一组分的半乳聚糖酶组合物成为可能。
因此，本发明的第一个方面涉及包含编码具有半乳聚糖酶活性的酶的DNA序列的DNA构建体，所说的DNA序列包括(a)克隆到质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分，所说的质粒存在于大肠杆菌DSM 10355中；(b)在SEQ ID NO 1的1-1026位(更优选的为55-1026位)所示的DNA序列，或者它的互补链；(c)在(a)或(b)中限定的DNA序列的类似物，其和所说的DNA序列至少有70％的同源性；(d)在低的严格性条件下与SEQ ID NO 1的1-1026位所示的DNA序列杂交的DNA序列；(e)一种DNA序列，由于遗传密码的简并性，其不能和(b)或(d)序列杂交，但是其编码与由这些DNA序列之任一编码的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽；或(f)一种DNA序列，其是(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中限定的DNA序列的等位形式或片段。
编码半乳聚糖酶的全长DNA序列来源于丝状真菌Meripilusgiganteus的菌株，并且已经将其克隆到存在于大肠杆菌菌株DSM 10355的质粒pYES 2.0中。
一般认为，所说的包含在大肠杆菌DSM 10355中的编码半乳聚糖酶的DNA序列与SEQ ID No.1所示的DNA序列具有相同的序列。因此，凡是提及克隆到质粒pYES 2.0(存在于DSM 10355中)中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分，也旨在包括存在于SEQ ID No.1的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分。
因此，术语“克隆到质拉pYES 2.0(存在于DSM 10355中)中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分”和“存在于SEQ ID No.1的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分”可以交换使用。
另一方面，本发明提供了含有本发明DNA构建体的表达载体、包含所说的DNA构建体或所说的表达载体的细胞、产生具有半乳聚糖酶活性的酶的方法，所说的方法包括在允许产生此酶的条件下培养所说的细胞，并从培养物中回收所说的酶。
另一方面，本发明提供了具有半乳聚糖酶活性的分离的酶，所说的酶选自下组(a)由克隆到存在于大肠杆菌DSM 10355中的质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分编码的多肽；(b)包含SEQ ID NO 2的1-1026位所示的氨基酸序列的多肽；(c)在(a)或(b)中限定的多肽的类似物，其和所说的多肽至少有70％的同源性；(d)一种(a)、(b)或(c)的等位形式或片段。
在另一方面，本发明涉及本发明的酶和酶组合物在各种工业上的用途。
最后，本发明涉及分离的基本上纯的大肠杆菌菌株DSM 10355(此菌株含有编码半乳聚糖酶的DNA序列)(DNA序列的半乳聚糖酶编码部分已经克隆到存在于大肠杆菌DSM 10355的质粒pYES 2.0中)的生物培养物，所说的DNA序列来源于丝状真菌Meripilus giganteus的菌株或者所说的仍保留编码半乳聚糖酶能力的大肠杆菌菌株的任何突变体；本发明还涉及分离的基本上纯的丝状真菌Meripilus giganteus CBS 521.95的生物培养物，从此真菌中已经获得了如SEQ ID No.1所示的DNA序列。定义在进一步详细地讨论本发明之前，首先定义下面的术语。
“DNA构建体”术语“DNA构建体”指按照遗传工程所用的标准克隆方法克隆的DNA序列，以便将DNA片段从它的天然来源处重新定位在不同的其将复制的位点。所说的克隆方法包括切割和分离所需的DNA片段、将DNA片段插入到载体分子中以及将重组载体引入到DNA片段的多个拷贝或克隆体能够复制的细胞中。
另外，本发明的“DNA构建体”也可以表述为“克隆的DNA序列”或“分离的DNA序列”。
“从…获得”在本发明中，本文使用的和特殊微生物来源有关的术语“从…获得”是指通过特定来源或通过其中已经插入了特定来源的基因的细胞来产生所说的酶。
“分离的多肽”本文所定义的用于本发明半乳聚糖酶的术语“分离的多肽”或“分离的半乳聚糖酶”是一种半乳聚糖酶或半乳聚糖酶部分，其纯度至少大约为20％，优选的纯度至少大约为40％，更优选的纯度大约为60％，更优选的纯度大约为80％，最优选的纯度大约为90％，甚至最优选的纯度大约为95％(通过SDS-PAGE测定)。术语“分离的多肽”也可以表述为“纯化的多肽”。
“同种杂质”本文使用的术语“同种杂质”是指来源于同源细胞(从其中得到本发明的酶)的杂质(例如不同于本发明的酶的其它多肽)。在本发明中，例如同源细胞可以是Meripilus giganteus的菌株。
“编码半乳聚糖酶的部分”用于本文的与DNA序列有关的术语“编码半乳聚糖酶的部分”是指与翻译成多肽序列的区域相对应的DNA序列区。在SEQ ID NO 1所示的DNA序列中，所说的部分是在第一个“ATG”起始密码子(mRNA中的“AUG”密码子)和后面的终止密码子(“TAA”、“TAG”或“TGA”)之间的区域。换句话说，它是翻译后的多肽。
除了具有半乳聚糖酶活性的成熟序列之外，翻译的多肽还包括N-末端信号序列。信号序列通常引导多肽的分泌。为获得进一步的信息请参见(Stryer,L.，“生物化学”，W.H.,Freeman和Company/纽约，ISBN 0-7167-1920-7))。
在本文中，术语“编码半乳聚糖酶的部分”是指包括翻译后的多肽以及它的成熟部分。
“半乳聚糖酶”在本发明中的半乳聚糖酶是按照酶学分类(EC)来定义的，其EC号为3.2.1.89。
官方名称阿拉伯半乳聚糖内-1,4-β-半乳聚糖酶。
其它名称内-1,4-β-半乳聚糖酶。
半乳聚糖酶。
阿拉伯半乳聚糖酶。
催化的反应在阿拉伯半乳聚糖中的1,4-β-D-半乳糖苷键的内水解。
发明详述DNA构建体本发明提供了含有编码具有半乳聚糖酶活性的酶的DNA序列的DNA构建体，所说的DNA序列含有(a)克隆到质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分，所说的质粒存在于大肠杆菌DSM 10355中；(b)在SEQ ID NO 1的1-1026位(更优选的为55-1026位)所示的DNA序列，或者它的互补链；(c)在(a)或(b)中限定的DNA序列的类似物，其和所说的DNA序列至少有70％的同源性；(d)在低的严格性条件下与SEQ ID NO 1的1-1026位所示的DNA序列杂交的DNA序列；(e)一种DNA序列，由于遗传密码的简并性，其不能和(b)或(d)序列杂交，但是其编码与由这些DNA序列之任一编码的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽；或(f)一种DNA序列，其是(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中限定的DNA序列的等位形式或片段。
目前认为克隆到DSM 10355的质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分和编码半乳聚糖酶的SEQ IDNO 1中的部分DNA序列具有同一性。
因此，可以相互代替使用术语“克隆到DSM 10355的质粒pYES 2.0中的编码半乳聚糖酶的部分序列”和“SEQ ID NO 1的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分”。
所说的DNA序列可以是基团组、cDNA或者合成的序列或它们的任意组合。
本发明也包括编码具有半乳聚糖酶活性的酶的克隆DNA序列，所说的DNA序列编码具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的成熟成分(即19-342位)，由于遗传密码的简并性，这种DNA序列和SEQ ID NO 1不同。
可以从微生物(例如细菌、酵母或丝状真菌)中得到SEQ ID NO 1所示的DNA序列和/或本发明的DNA序列的类似物。优选地从丝状真菌中得到，在“微生物源”部分(参见下文)给出了这样合适的例子。
另外，以SEQ ID NO 1的半乳聚糖酶编码部分所示的DNA序列(即它们的亚序列)为基础，和/或通过引入核苷酸取代来构建类似物序列(所说的核苷酸取代不会产生由所说的DNA序列编码的半乳聚糖酶的另外氨基酸序列，但是所说的取代与用于产生酶的宿主微生物的密码子选择相对应)，或者通过引入可以产生不同的氨基酸序列的核苷酸取代也可以构建类似物序列。
当进行核苷酸取代时，氨基酸的改变优选的是不重要的属性(也就是不能显著地影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸的取代和大约不超过1-30个氨基酸的小的缺失)；氨基酸的改变也可以是氨基或羧基末端小的延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基、至多大约20-25个残基的小接头肽、便于纯化的小的延伸(例如多聚组氨基酸序列、抗原表位或结合区域。
保守取代的例子位于下列氨基酸组范围内碱性氨基酸(例如精氨酸，赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)、小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)。如果想得到核苷酸取代的一般信息，参见例如Ford等(1991)的“蛋白质的表达和纯化2，95-107”。
对本领域的技术人员来说，在分子功能关键区之外进行这样的取代并且产生活性多肽是显而易见的。可以按照本领域熟知的方法来确定对本发明的DNA构建体编码的多肽的活性有重要作用的氨基酸(优选的是不取代它们)，例如这些方法包括定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如参见Cuningham和Wells,(1989)，科学244,1081-1085)。在分子的每一个残基中引入了后者技术突变，并检验了所得的突变分子的生物(即半乳聚糖酶)活性以确定与分子活性相关的氨基酸残基。通过由核磁共振分析方法、晶体学或者光亲和性标记等技术的分析来确定晶体结构也可以确定底物-酶相互作用位点(例如参见de Vos等，(1992)，科学255,306-312；Smith等，(1992)，分子生物学杂志224,899-904；Wlodaver等，(1992),FEBS通讯309,59-64)。
测定了在上面(c)中所说的DNA序列的同源性，其作为两个序列间的同一性程度，结果表明第一个序列是由第二个序列衍生的。可以通过本领域熟知的计算机程序(例如GCG程序包提供的GAP，威斯康星程序包程序手册，第8版，1994年8月，遗传学计算机组，575 Science Drive,Madison，威斯康星，美国，53711)测定同源性(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志，48,443-453)。使用具有下列设置的GAP进行DNA序列比较5.0 GAP产生罚分，0.3 GAP延长罚分，上述的类似物DNA序列的编码区与SEQ ID NO 1所示的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分相比，优选地显示出至少70％(更优选地至少80％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，更优选地至少97％)的同一性。
下面详细地描述了上面所说的用于限定类似物DNA序列(此类似物DNA序列在上文(d)中限定)的杂交条件，所说的DNA序列与SEQ ID NO1所示的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分(即核苷酸1-1026)在至少低严格性条件下，但优选的是在中等或高的严格性条件下进行杂交。
确定核酸探针和同源DNA或RNA序列间在低、中等或高的严格性条件下杂交的合适的实验条件包括将含有DNA片段或RNA的滤膜预浸在5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等，1989)中，杂交10分钟；将滤膜在5×SSC溶液、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的超声波处理的鲑精DNA(Sambrook等，1989)中预杂交；接下来在大约45℃下在含有浓度为10ng/ml的随机引发的(Feinberg,A.P.和Vogelstein,B.(1983)生物化学年鉴132:6-13)，32P-dCTP标记的(比活＞1×109cpm/μg)探针的同一溶液中杂交12小时。然后，在至少55℃(低严格性)、更优选的在至少60℃(中等严格性)、更优选的在至少65℃(中/高严格性)、甚至更优选的在至少70℃(高严格性)和甚至更优选的在至少75℃(非常高的严格性)下，在2×SSC、0.5％SDS中将滤膜洗涤两次，历时30分钟。
使用X射线胶片检测在这些条件下和寡核苷酸探针杂交的分子。
本发明多肽的同源性(指本发明多肽的上述性质(c))是指两个序列的相同程度，它表明第一条序列来源于第二条序列。可以通过本领域公知的计算机程序方法确定同源性，如GCG程序包中提供的GAP(威斯康星程序包程序手册，第8版，1994年8月，遗传学计算机组，575 ScienceDrive,Madison，威斯康星，美国，53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志，48,443453)。使用具有下列用于多肽序列比较的配置的GAP:3.0 GAP产生罚分和0.1 GAP延伸罚分，由本发明类似的DNA序列编码的多肽的成熟部分与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的成熟部分(即SEQ ID NO:2的19-342位)相比，优选地显示出至少70％的等同性、更优选地显示出至少80％的等同性、更优选地显示出至少90％的等同性、更优选地显示出至少95％的等同性、尤其是至少97％的等同性。
本发明也涉及半乳聚糖酶的变体，所说的变体具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的成熟部分相比，它们的差异不超过三个氨基酸，优选地不超过两个氨基酸，更优选地不超过一个氨基酸。
使用Sambrook等(1989)描述的标准的方法(分子克隆实验室手册，冷泉港实验室；冷泉港，NY)可以从大肠杆菌DSM 10355中分离本发明的编码半乳聚糖酶的DNA序列。
分离编码本发明的具有半乳聚糖酶活性的酶的DNA序列可以通过任何常规的方法。这些方法包括-在合适的载体上，从任何期望能够产生兴趣半乳聚糖酶的生物中克隆cDNA文库；-用所说载体转化合适的酵母宿主细胞；-在合适的条件下培养酵母细胞，以便表达cDNA文库的克隆所编码的兴趣酶；-通过测定由所说的克隆产生的酶的任何一种半乳聚糖酶活性来筛选阳性克隆；和-从所说的克隆中分离编码该酶的DNA。
在WO 93/11249或WO 94/14953中公开了普通的分离方法，其内容本文一并参考。下文的实施例1给出了筛选方法的更详细的描述。
另外，按照公知的方法使用合成的寡核苷酸探针(在本文公开的DNA序列的基础上制备的)可以方便地从合适的来源(例如下面提到的任何生物)中分离本发明的编码半乳聚糖酶的DNA。例如，可以在SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列的半乳聚糖酶编码部分，或者它们的任何合适的序列的基础上，或者在SEQ ID NO 2的氨基酸序例的基础上制备合适的寡核苷酸探针。微生物源在优选的实施方案中，编码半乳聚糖酶的DNA序列来源于属于多孔菌科的菌株，根据entrez browser NCBI分类学版本3.3(最新的为12.13.95)，此科属于非褶菌目(Aphyllophorales)，此目属于担子菌门(Basidiomycota)之下的层菌纲(Hymenomycetes)。
目前认为，编码与本发明的酶同源的酶的DNA序列(即类似DNA序列)可以从其它微生物获得。例如，可以通过类似的方式筛选另一种微生物的cDNA文库来获得所说的DNA序列，特别是真菌，如曲霉属的种的菌株(特别是棘孢曲霉、黑曲霉的菌株)；疫霉属的种的菌株(特别是致病疫霉、P.megasperma、恶疫霉的菌株)；Talaromyces的种的菌株(特别是T.byssochlamydoides、T.emersonii的菌株)；嗜热子囊菌属的种的菌株(特别是嗜热子囊菌的菌株)；孢子丝菌属的种的菌株(特别是Sporotrichumcelluphilum的菌株)；青霉属的种的菌株(特别是桔青霉、沙门柏干酪青霉、娄地青霉的菌株)。
从中可以获得本发明半乳聚糖酶的菌株Meripilus giganteus的分离物已经由发明人按照国际公认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约在Centraalbureau voor Schimmel-cultures,P.O.Box 273,3740 AGBaarn，荷兰(CBS)保藏。保藏日期04.07.95保藏号NN006040CBS名称Meripilus giganteus CBS No.521.95。
此外，已经将含有编码本发明的半乳聚糖酶的全长DNA序列的表达质粒pYES 2.0转化到大肠杆菌的菌株中，此菌株由发明人按照国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约在Deutshe Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH.,Masheroder Weg Ib,D-38124 Raunschweig，联邦德国(DSM)保藏。
保藏日期06.12.95保藏号NN049142DSM名称大肠杆菌DSM 10355。表达载体在另一方面，本发明提供了含有本发明DNA构建体的重组表达载体。
本发明的表达载体可以是任何可以很方便地以重组DNA方法操作的表达载体，载体的选择经常是根据此载体引入的宿主细胞而定。因此，载体可以是自我复制载体，也就是说以染色体外的实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。另外，所说的载体也可以是这样一种载体，当将其引入到宿主细胞中时，它能整合到宿主细胞的基因组上，并且能与其整合的基因组一起复制。
在表达载体中，将编码半乳聚糖酶的DNA序列可操作地与合适的启动子及终止子序列连接。所说的启动子可以是任何在选择的宿主细胞中显示出转录活性的DNA序列，其可以来源于编码与宿主细胞同源或者异源的蛋白质的基因。用于分别连接编码半乳聚糖酶的DNA序列、启动子和终止子以及将它们插入到合适的载体的方法是本领域技术人员公知的(例如参见Sambrook等，(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港，纽约)。
用于丝状真菌宿主细胞的合适的启动子的例子，例如，ADH3启动子(McKnight等，EMBO J.4(1985),2093-2099)或者tpiA启动子。其它有用的启动子的例子来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉的酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或者泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或者构巢由霉乙酰胺酶的基因。宿主细胞在另一个方面，本发明提供了含有本发明DNA构建体和/或本发明重组表达载体的宿主细胞。
优选地，本发明的宿主细胞是真核细胞，特别是真菌细胞(如酵母或者丝状真菌细胞)。具体地说，这些细胞可以属于木霉属(Trichoderma)(优选的是Trichoderma harzianum或者Trichoderma reesei)或者曲霉属(最优选的是米曲霉或者黑曲霉)、或者镰孢属(最优选的是镰孢属的种，其具有镰孢属ATCC 20334的鉴定特征，PCT/US/95对其进行了进一步的描述。
可以通过本身已知的方法转化真菌细胞，这种方法包括原生质体的形成和原生质体的转化，之后是细胞壁的再生。EP 238 023(Novo NordiskA/S)中描述了曲霉属作为宿主微生物的用途，其全部内容本文一并参考。所说的宿主细胞也可以是酵母细胞，例如酵母属的菌株，特别是酿酒酵母、克鲁弗酵母、或者葡萄汁酵母、裂殖酵母属的种的菌株(如粟酒裂殖酵母-1)、汉逊酵母属的种的菌株、毕赤酵母属的种、Yarrowia的种(如Yarrowia lipolytica)或者克鲁维酵母属的种(如乳酸克鲁维酵母)。产生半乳聚糖酶的方法本发明提供了产生按照本发明的分离的酶的方法，其中将用编码此酶的DNA序列转化的合适的宿主细胞在允许产生此酶的条件下培养，并从培养物中回收所得的酶。
当将包含编码此酶的DNA序列的表达载体转化到异源宿主细胞时，产生本发明酶的异源重组体是可能的。
因此产生高度纯化的半乳聚糖酶组合物是可能的，其特征在于不含同种杂质。
在本发明中，同源的宿主细胞例如可以是Meripilus giganteus的菌株。
用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适合于所讨论的宿主细胞生长的常规培养基。所表达的半乳聚糖酶可以方便地分泌到培养基中，并且可以通过公知的方法从培养基中回收，所说的公知的方法包括从培养基中通过离心或者过滤分离细胞，通过盐法(如硫酸铵)沉淀培养基的蛋白质组分，其后进行层析(如离子交换层析、亲和层析等等)。酶组合物在另一方面，本发明涉及对降解植物细胞壁组分有用的酶组合物，所说的组合物富含上文所述的具有半乳聚糖酶活性的酶。以这一方式，使所说的酶组合物降解细胞壁的能力得到加强。
富含本发明酶的酶组合物可以是，例如，含有多种酶促活性的酶组合物，特别是含有多种降解植物细胞壁酶(Biofeed+、Energex、Viscozym、Pectinex、Pectinex Ultra SP、Celluclast或Celluzyme，所有这些酶都可从Novo Nordisk A/S买到)的酶组合物。
在本文中，术语“富含”旨在于表明酶组合物的半乳聚糖酶活性增加，例如富集系数为1.1，可以通过加入用上述方法制备的本发明的酶而很方便地得到。
除了本发明的半乳聚糖酶外，本发明的酶组合物可以含有一种或多种其它酶，例如那些具有溶木聚糖或者溶果胶活性的酶，如α-阿拉伯糖苷酶、α-葡糖醛酸苷酶、植酸酶、木聚糖乙酰基酯酶、阿拉伯聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果胶乙酰酯酶、半乳聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酸酯裂解酶、葡聚糖酶、果胶甲基酯酶、漆酶、或者氧化还原酶。其它的酶可以经属于曲霉属(优选的是黑曲霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉或米曲霉)、Trichoderma或者Humicola insolens的微生物来产生。
另外，富含具有半乳聚糖酶活性的酶的酶组合物可以以本发明的酶作为主要的酶促组分，例如单组分的酶组合物。
可以按照本领域公知的方法制备所说的酶组合物，并且这种酶组合物可以以液体或者干燥组合物的形式存在。例如，酶组合物可以以粒状或者微粒状存在。可以将包含在此组合物中的酶按照本领域公知的方法稳定。
下文给出了优选使用的本发明的酶组合物的例子。可以基于本领域公知的方法确定本发明酶组合物的剂量和使用此组合物的其它条件。
按照本发明的酶组合物至少可以用于下列目的之一。植物材料的降解或者改良由于本发明的半乳聚糖酶降解高等植物细胞壁的活性，按照本发明的酶组合物优选用作降解或改良植物细胞壁或者任何起源于植物细胞壁的含有半乳聚糖物质的试剂。
本发明的半乳聚糖酶能够水解半乳聚糖的β-1,4键。半乳聚糖是具有由β-1,4键连接的半乳糖组成的骨架的多糖。此骨架可以具有侧链，如阿拉伯糖。侧链的组成和数目取决于半乳聚糖的来源。(Stephen,A.M.,1983，多糖，ch.2,Vol 2,Ed.Aspinall,G.O.)。
全部或部分地除去侧链有利于半乳聚糖酶对半乳聚糖的降解。可以通过温和的酸处理或者α-阿拉伯糖苷酶处理除去阿拉伯糖侧链基团。由上文提到的半乳聚糖酶或者组合在一起的半乳聚糖酶与侧链水解酶释放的寡聚体可以由β-半乳糖苷酶进一步降解成游离的半乳糖。
可以在没有其它溶果胶或者溶半纤维素的酶存在的情况下，或者在存在其它溶果胶或者溶半纤维素的酶的限定活性的情况下，使用本发明的半乳聚糖酶降解半乳聚糖降以便产生寡聚糖。这些寡聚糖可以用作大量试剂，如大豆细胞壁物质释放的阿拉伯半乳聚糖寡聚糖或者或多或少纯化的植物材料的阿拉伯半乳聚糖的寡聚糖。
本发明的半乳聚糖酶可以与其它溶果胶或者溶半纤维素的酶结合使用，以便将半乳聚糖降解成半乳糖及其它的单糖。
可以单独使用本发明的半乳聚糖酶，也可以将其与其它酶(如葡聚糖酶、果胶酶和/或者半纤维素酶)一起使用，以便改进富含油的植物材料中油的提取，象大豆的豆油、橄榄的橄榄油或油菜种子的油菜籽油、向日葵的向日葵油。
本发明的半乳聚糖酶可以用于分离植物细胞物质的组分。特别令人感兴趣的是从富含糖或者淀粉的植物材料中将具有可观的商业价值的组分(如从甜菜中分离蔗糖，从马铃薯中分离淀粉)与价值较低的组分(如果肉或外壳部分)分开。另外，特别令人感兴趣的是将富含蛋白质或富含油的作物分成有价值的蛋白质及油和无价值的外皮组分，可以使用本领域公知的方法完成分离过程。
本发明的半乳聚糖酶也可以用于制备水果或者蔬菜汁以便增加产量，也可以用于各种来源于植物细胞壁的物质或者废物(如来源于酒或者果汁生产)、农业残留物(如蔬菜壳、大豆壳、甜菜果肉、橄榄果肉、土豆果肉等)的酶促水解。
可以降解植物材料，以便改进各种不同的加工过程、有利于其它非半乳聚糖的组分的纯化或者提取(象从柑橘类植物中纯化果胶)、提高饲料的价值，降低水的结合能力、改进废水厂的降解能力、促进植物材料转变成青贮饲料，等等。
借助于本发明的酶制备，调节所处理的水果或者蔬菜的坚松度和外观是可能。已经证明坚松度和外观是用于加工的酶实际结合的产物，即本发明的半乳聚糖酶与其它酶结合的特异性。例如例子包括从苹果、梨或者草莓生产澄清的果汁；例如从苹果、梨、草莓、柑橘类植物或者番茄生产稳定的悬液果汁；和例如从胡萝卜和番茄生产菜泥。
本发明的半乳聚糖酶可以用于改进由植物细胞壁衍生的材料的粘度。例如，半乳聚糖酶可以用来减少含有半乳聚糖的饲料的粘度，并且改进包含胶粘半乳聚糖的材料的加工。在适合于全部或部分降解含有半乳聚糖的材料的条件下，使用本发明的酶制剂处理含有半乳聚糖的植物材料可以降低粘度。
例如，所说的半乳聚糖酶可以与其它的酶结合使用以便从植物纤维中除去果胶物质。例如，在生产纺织纤维或者其它纤维素材料时，除去果胶物质是十分重要的。为此，在适合于全部或部分降解与植物纤维材料结合的果胶物质的条件下，使用适量的本发明的半乳聚糖酶处理植物纤维材料。动物饲料添加剂本发明的半乳聚糖酶可以用于改进动物饲料，并且可以在体外(通过改变饲料的组分)或者在体内发挥作用。这种半乳糖聚酶特别适合于加入到阿拉伯半乳聚糖或者半乳聚糖含量很高的动物饲料组合物中，如含有来源于大豆、油菜籽和羽扇豆属植物的植物材料的饲料。当将半乳聚糖酶加入到饲料中可以明显地改进植物细胞壁材料的体内降解，因此可以使动物更好地利用植物中的养分。因此，改善了动物的生长速率和/或者饲料的转化率(即摄取的饲料的重量与增加的体重的比)。不能消化的半乳聚糖经半乳聚糖酶(例如与β-半乳糖苷酶结合使用)降解成动物可以消化的半乳糖或者半乳糖低聚物，因此可以提高这些饲料可利用的能量。另外，通过半乳聚糖的降解，半乳聚糖酶可以提高非碳水化合物饲料组分(如蛋白质、脂肪和矿物质)的可消化性和吸收性。
进一步的描述参照PCT/DK 96/00443和本文的工作实施例。酒和果汁的加工本发明的酶制剂在生产蔬菜汁或者果汁(特别是苹果汁或者梨汁)时可以用于果胶的降解和粘度的降低。使用本发明的酶制剂以能够降解包含在果汁或蔬菜汁中的含有果胶的物质的有效量处理果汁或蔬菜汁可以达到此目的。
所说的酶制剂可以用于处理水果和蔬菜的糊状物，以便改进糊状物的可提取性或可降解性。例如，所说的酶制剂在果汁的生产过程中可以用于处理苹果和梨的糊状物，及在酒的生产过程可以处理葡萄的糊状物。单组分半乳聚糖酶的优点从上文的描述可知，很明显可以以单组分酶制剂的形式生产本发明的半乳聚糖酶，其本质上不含其它酶活性(如通常发现在市售的含有半乳聚糖酶的溶果胶、溶半纤维素或者溶纤维素的酶制剂中存在的果胶甲基酯酶和其它溶果胶酶)。
为此，本发明的半乳聚糖酶的用途在不需要所说的其它酶活性时是特别有利的。使用它的例子包括稳定悬液果汁的生产和果酱的生产。在这些生产中，例如果胶甲基酯酶(在常规的溶果胶酶制剂中通常发挥的是辅助活性)的存在，可以降低稳定悬液果汁悬液的稳定性，或者使果酱脱水收缩。
此夕卜，由于本发明的半乳聚糖酶的实际纯度，其可以用来改良果胶，这样含有半乳聚糖的果胶只有一部分降解。如果存在常规的溶果胶活性，将增加果胶的降解程度，结果将降低果胶的胶粘(viscosifying)或者胶凝能力。
最后，可以使用实质上纯化的半乳聚糖酶有选择地从用于饲料的植物材料中释放半乳糖和半乳糖低聚物。动物可以很容易地消化半乳糖。具有半乳聚糖酶活性的常规溶果胶或者溶半纤维素酶的制剂除了半乳聚糖酶外，还含有胞内酶和胞外酶，这些酶在饲料中产生不受欢迎的木糖和半乳糖醛酸。
通过下列实施例进一步详细描述本发明，这些实施例无意于以任何方式限制权利要求所限定的本发明的范围。材料和方法保藏的生物含有本发明的编码半乳聚糖酶的DNA序列的Meripilus giganteusCBS 521.95。
含有所说质粒的大肠杆菌DSM 10355，该质粒含有穿梭载体pYES2.0的全长DNA序列，此序列编码本发明的半乳聚糖酶。其它菌株酵母菌株所用的酿酒酵母菌株是W3124(MATa；ura 3-52；leu 2-3,112；his 3-D200；pep 4-1137；prc1::HIS3；prb1::LEU2；cir+)。
大肠杆菌菌株DH5α(生命技术A/S,Roskilde，丹麦)质粒曲霉属表达载体pHD414是质粒p775的衍生物(如EP 238 023所述)。WO 93/11249进一步描述了pHD414的构建。
pYES 2.0(Invitrogen)
pA2G55(参见实施例1)一般的分子生物学方法除非特别说明，使用分子生物学的标准方法(Sambrook等(1989)分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel,F.M.等(编辑)的“当代分子生物学方法”，John Wiley和Sons,1995；Harwood,C.R.，和Cutting,S.M.(编辑)“芽孢杆菌属的分子生物学方法”，John Wiley和Sons,1990)进行DNA操作和转化。
按照厂商的说明使用用于DNA操作的酶。用于DNA操作的酶除非特别说明，所有用于DNA操作的酶(例如限制性核酸内切酶、连接酶等等)都从新英格兰生物实验室公司购买。用于mRNA分离的Meripilus giganteus CBS 521.95的发酵方法将Meripilus giganteus CBS 521.95从菌丝体过量生长的平板接种到含有100 ml培养基PD液体肉汤(24g土豆葡聚糖肉汤、Difco 0549、加去离子水至1000ml；高压灭菌(121℃,15-20分钟))的摇瓶中，所说的培养基含有纤维素。
将培养物在26℃下发酵5天。所得的培养物肉汤经纱布过滤，将菌丝体在液氮中冷冻。
如H.Dalboege等(分子基因遗传学(1994)243:253-260；WO93/11249；WO 94/14953)的描述从此培养物的菌丝体中分离mRNA。
总RNA提取使用硫氰酸胍，然后经5.7M CsCl垫层超速离心来进行，同时使用WO 94/14953中描述的方法通过寡(dT)-纤维素亲和层析分离聚(A)+RNA。
cDNA合成通过RNase H方法(Gubler和Hoffman(1983)基因25263-269,Sambrook等(1989)分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)由5mg聚(A)+RNA合成双链cDNA。将聚(A)+RNA(在5mlDEPC处理的水中含5mg)在70℃下于预先硅烷化的无RNase的Eppendorph管中加热8分钟，在冰上冷却，用含有1 mM dATP、dGTP和dTTP和0.5 mM 5-甲基-dCTP(Pharmacia)、40单位的人胎盘核糖核酸酶抑制剂(RNasin,Promega)、1.45 mg寡(dT)18-NotⅠ引物(Pharmacia)和1000单位的SuperScriptⅡ RNase H反转录酶(Bethesda研究实验室)的反转录酶缓冲液(50 mM Tris-Cl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10 mM DTT(Bethesda研究实验室))加至最终体积为50ml。通过将反应混合物在45℃温育1小时来合成首链cDNA。合成后，按照厂商的说明将mRNA:cDNA杂交混合物经MicroSpin S-400HR(Pharmacia)旋转柱进行凝胶过滤。
在凝胶过滤后，将杂交体在含有200mM各种dNTP、60单位大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(Pharmacia)、5.25单位RNase H(Promega)和15单位大肠杆菌DNA连接酶(Boehringer曼海姆)的250 ml第二条链缓冲液(20mM Tris-Cl,pH7.4、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、0.16mM bNAD+)中稀释。通过将反应管在16℃温育2小时，然后在25℃温育15分钟来合成第二条链cDNA。加入EDTA，使之终浓度为20mM以便终止反应，之后进行酚和氯仿抽提。
绿豆核酸酶处理通过加入2倍体积的96％EtOH、0.2倍体积的NH4Ac在-20℃将双链cDNA沉淀12小时，经离心回收，在70％EtOH中洗涤，干燥并悬浮在30ml含有25单位绿豆核酸酶(Pharmacia)的绿豆核酸酶缓冲液(30mM NaAc,pH4.6、300mM NaCl、1mM ZnSO4、0.35mM DTT、2％甘油)中。通过将反应物在30℃温育30分钟来修剪(clip)单链发夹DNA，之后加入70ml 10mM Tris-Cl(pH7.5)、1mMEDTA，酚抽提，使用2倍体积的96％EtOH和0.1倍体积的3MNaAc(pH5.2)在冰上沉淀30分钟。
使用T4 DNA聚合酶补平末端通过离心回收双链cDNAs，在含有0.5mM各种dNTP和5单位的T4 DNA聚合酶(新英格兰生物实验室)的30ml T4 DNA聚合酶缓冲液(20mM Tris-醋酸盐(pH7.9)、10mMMgAc、50mM KAc、1mM DTT)中，于16℃下将反应混合物温育1小时来补平末端。加入EDTA，使之终浓度为20mM以便终止反应，之后进行酚和氯仿抽提，通过加入2倍体积的96％EtOH和0.1倍体积的3M NaAc(pH5.2)在-20℃下沉淀12小时。衔接头连接，NotⅠ消化和大小选择在补平反应后，通过离心回收所说的cDNAs，在70％EtOH中洗涤，并且干燥。将cDNA沉淀悬浮在含有2.5 mg非回文BstⅪ衔接头(Invitrogen)和30单位T4连接酶(Promega)的25ml连接缓冲液(30mMTris-Cl(pH 7.8)、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP)中，并在16℃下温育12小时。在65℃下加热20分钟终止反应，然后在冰上冷却5分钟。加入20ml水、5ml 10x NotⅠ限制酶缓冲液(新英格兰生物实验室)和50单位NotⅠ(新英格兰生物实验室)，这样NotⅠ限制酶消化连接(adapted)的cDNA，之后在37℃下温育2.5小时。在65℃下加热10分钟终止此反应。在0.8％SeaPlaque GTG低熔点琼脂糖凝胶(FMC)上于1×TBE中通过凝胶电泳对cDNAs按大小进行分级分离，以便将未连接的衔接头与小的cDNA分开。使用0.7kb的截断按大小对所说的cDNA进行选择，使用b-琼脂糖酶(新英格兰生物实验室)按照厂商的说明从凝胶中拯救所说的cDNA，通过加入2倍体积的96％EtOH和0.1倍体积的3MNaAc(pH5.2)将cDNA在-20℃下沉淀12小时。
文库的构建通过离心回收定向的，按大小选择的cDNA，在70％的EtOH中洗涤，干燥，并悬浮在30ml 10mM Tris-Cl(pH7.5)、1mMEDTA中。按照厂商的说明通过经MicroSpin S-300 HR(Pharmacia)旋转柱的凝胶过滤使所说的cDNAs脱盐。在10ml含有5ml双链cDNA(反应管1和2)、15单位T4连接酶(Promega)和30ng(管1)、40ng(管2)和40ng(管3，载体背景对照)BstⅪ-NotⅠ切割的pYES2.0载体的连接缓冲液(30mM Tris-Cl(pH7.8)、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP)中进行3次试验连接。连接反应如下进行16℃下温育12小时，70℃下加热20分钟，向每个管中加入10ml水。如Sambrook等((1989)分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)的描述将1ml连接混合物电穿孔到40ml电感受态大肠杆菌DH10B细胞(Bethesda研究实验室)中。使用最佳条件在由各个集合体组成的大肠杆菌中构建文库。将转化的大肠杆菌涂布在LB+氨苄青霉素的琼脂平板上来产生每个集合体，37℃下培养24小时后，每个平板产生15.000-30.000个菌落。将20ml LB+氨苄青霉素加入到所说的平板中，并将所说的细胞悬浮在其中。37℃下将细胞悬液在50ml的管中振荡1小时。按照厂商的说明使用QIAGEN质粒试剂盒从这些细胞中分离质粒DNA，并将其贮存在-20℃。
将1ml从各个集合体中得到的纯化的质粒DNA(100ng/ml)的等份试样通过电穿孔法转化到酿酒酵母W3124中(Becker和Guarante(1991)酶学方法194:182-187)，将转化体接种在含有2％葡萄糖的的SC琼脂上，并在30℃下培养。
阳性克隆的鉴定将转化体接种在含有0.1％AZCL半乳聚糖(Megazyme，澳大利亚)和2％半乳糖的SC琼脂上，并在30℃下培养3-5天。
有蓝晕围绕的菌落被鉴定为半乳聚糖酶阳性菌落。
用于在米曲霉中表达的cDNA基因的分离将产生半乳聚糖酶的酵母菌落接种在50ml玻璃试管中的20mlYPD肉汤中。30℃下将所说的试管振荡2天。在3000rpm下离心10分钟来收获细胞。
按照WO 94/14953分离DNA，并将其溶解在50ml的水中。通过标准的方法将所说的DNA转化到大肠杆菌中。使用标准的方法从大肠杆菌中分离质粒DNA，并通过限制酶进行分析。使用合适的限制酶切割cDNA插入物，并将其连接到米曲霉表达载体中。米曲霉或者黑曲霉的转化如WO 95/02043(16页21行-17页12，本文一并参考)的描述制备原生质体。
将100μl原生质体悬液与5-25μg适当DNA的10μl STC(1.2M山梨醇、10mM Tris-HCl(pH=7.5)、10mM CaCl2)溶液混合。将原生质体与米曲霉兴趣载体混合。混合物在室温下放置25分钟。加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH 29576)、10mM CaCl2和10mM Tris-HCl(pH7.5)，认真混合(两次)，最后再加入0.85ml同样的溶液，认真混合。将混合物在室温下放置25分钟，在2500g下涡旋15分钟，将沉淀悬浮在2ml 1.2M山梨醇中。再次沉淀后，将原生质体涂布在含有1.0M蔗糖(pH7.0)、10mM乙酰胺作为氮源和抑制背景生长的20mM CsCl的基本平板(Cove，生物化学和生物物理学报113(1966)51-56)上。37℃下培养4-7天后，挑取孢子，并将其涂布成单菌落。重复此过程，在第二次分离后，将单菌落的孢子作为限定的转化体贮存。米曲霉转化体的检验将每种转化体接种在10ml YPM(参见下文)中，进行繁殖。30℃下培养2-5天后，除去上清液。通过将10μl上清液加入到在含有0.2％AZCL半乳聚糖(Megazyme，澳大利亚)的琼脂平板中打出的直径为4毫米的孔中来鉴定半乳聚糖酶活性。然后通过蓝晕鉴定半乳聚糖酶活性。分批进料(fed batch)发酵在含有麦芽糖糊精(碳源)、脲(氮源)和酵母提取物的培养基中进行分批进料发酵。通过在含有3.5％碳源和0.5％氮源的培养基中培养所讨论的米曲霉宿主细胞的摇瓶培养物来进行分批进料发酵。在pH7.0和34℃下培养24小时之后，开始连续供给另外的碳和氮源。碳源一直是限制因子，它保证氧的过量存在。分批进料培养持续4天。SEQ ID NO.1所示的DNA序列的分离可以通过本领域公知的方法(Sambrook等，(1989)分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)经质粒DNA的提取从保藏的生物大肠杆菌DSM 10355中获得如SEQ ID No.1所示的编码本发明的半乳聚糖酶的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分。培养基YPD:10g酵母提取物，20g蛋白胨，加H2O至900毫升。高压灭菌，再加入100ml 20％葡萄糖(无菌过滤)。
YPM:10g酵母提取物，20g蛋白胨，加H2O至900毫升。高压灭菌，再加入100ml 20％麦芽糖糊精(无菌过滤)。
10X基本盐75g酵母氮碱，113g琥珀酸，68gNaOH，加H2O至1000毫升，无菌过滤。
SC-URA:100ml 10X基本盐，28ml没有维生素的20％酪蛋白氨基酸，10ml 1％色氨酸，加H2O至900毫升，高压灭菌，加入3.6ml 5％苏氨酸和100ml 20％葡萄糖或者20％半乳糖。
SC-琼脂SC-URA，加入20g/l琼脂。
SC-不同的琼脂20g琼脂，20ml 10X基本盐，加H2O至900毫升，高压灭菌。
AZCL半乳聚糖(Megazyme，澳大利亚)PEG 4000(聚乙二醇，分子量=4,000)，(BDH，英国)实施例实施例1从Meripilus giganteus CBS 521.95中克隆并表达半乳聚糖酶从Meripilus giganteus CBS 521.95中分离mRNA，所说的菌株生长在含有纤维素的发酵培养基中，同时在培养过程中不断搅动以确保通气充分。生长3-5天后，收获菌丝体，立即在液氮中冷冻，并贮存在-80℃。如上所述使用1％载体背景在大肠杆菌中构建含有大约9×105个克隆的Meripilus giganteus CBS 521.95文库。将一部分集合体的质粒DNA转化到酵母中，从每一个集合体获得含有250-400个酵母菌落的50-100个平板。
鉴定半乳聚糖酶阳性菌落，并使用AZCL半乳聚糖测定方法在SC-琼脂平板上分离。从所说的酵母菌落直接扩增cDNA插入物，并如上文材料和方法部分的描述进行定性。编码半乳聚糖酶的cDNA的DNA序列如SEQ ID No.1所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
可以从DSM 10355的质粒中获得cDNA。
从酵母菌落分离总DNA，并如上所述通过转化大肠杆菌拯救质粒DNA。为了在米曲霉中表述半乳聚糖酶，使用适当的限制酶消化DNA，在凝胶上按大小进行分级分离，纯化对应于半乳聚糖酶基因的片段。然后将此基因连接到用适当的限制酶消化的pHD414中，得到质粒pA2G55。
在大肠杆菌进行DNA扩增后，如上所述将质粒转化到米曲霉中。米曲霉转化体的检验如上所述，检验每种转化体的酶活性。一些转化体具有明显大于米曲霉背景的半乳聚糖酶活性。这表明半乳聚糖酶已经有效地在米曲霉中表达。
实施例2将本发明的半乳聚糖酶对核苷酸和蛋白质数据库进行同源性检索。同源性检索表明最相关的半乳聚糖酶是棘孢曲霉的β-1,4-半乳聚糖酶。
按照“本发明详细描述”的方法使用计算机程序GAP确定本发明的半乳聚糖酶与大多数现有的半乳聚糖酶相比的DNA同源性。本发明的半乳聚糖酶与棘孢曲霉的β-1,4-半乳聚糖酶(WO 92/13945)仅具有56％的DNA同源性。这表明本发明的半乳聚糖酶实际上不同于任何已知的半乳聚糖酶。
实施例3从Meripilus giganteus中纯化重组半乳聚糖酶将表达重组酶的米曲霉发酵培养物的上清液离心，并经0.2μm的滤膜过滤以除去菌丝体，并将其在带有3kDa膜的Filtron盒(Minisette)中超滤，同时将缓冲液改变成50mM H3BO3,5mM DMG,1mM CaC12,pH7.0。将所得的样品装载在用50mM H3BO3,5mM DMG,1mM CaCl2,pH7.0平衡的50ml Pharmacia Q琼脂糖凝胶HP阴离子交换柱上。加入样品后，用50mM H3BO3,5mM DMG,1mM CaCl2,pH7.0洗涤此柱，并用溶解在50mM H3BO3,5mM DMG,1mM CaCl2,pH7.0中的不断增加的线性NaCl梯度溶液(0-0.5M)洗脱结合的蛋白质。在AZCL-半乳聚糖中检验组分的半乳聚糖酶活性，合并具有活性的组分。所有的半乳聚糖酶活性都在洗涤的组分中。
用乙酸将Q-琼脂糖凝胶柱的洗涤组分的pH调节到pH4.5，并加入到用10mM CH3COOH/NaOH(pH4.5)平衡的50ml Pharmacia S琼脂糖凝胶HP柱上。洗涤此柱后，用溶解在10mM CH3COOH/NaOH(pH4.5)中的浓度不断增加的线性NaCl梯度溶液(0-250mM)洗脱结合的蛋白质。所有的半乳聚糖酶活性都以单峰的形式存在，以电泳纯的形式洗脱活性组分。
使用“Bio-Rad蛋白质测定”按照制造商(Bio-Rad实验室GmbH)的建议测定蛋白质的浓度。
实施例4Meripilus giganteus的重组半乳聚糖酶的定性如WO 94/21785的描述确定此酶的分子量与等电点。
通过羽扇豆属植物半乳聚糖(MegaZyme，澳大利亚)释放的还原糖或者通过AZCL-马铃薯-半乳聚糖(MegaZyme，澳大利亚)释放的蓝色来测定此酶的活性。
将0.5ml 0.4％AZCL-马铃薯-半乳聚糖与0.5ml最适pH的0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液混合，然后加入10μl适当稀释的酶溶液。30℃下(如果没有特别说明)在Eppendorf Thermomixers中温育15分钟，然后95℃下热灭活此酶20分钟。设3个酶温育重复，加入酶立即灭活的为空白。离心后，在微量滴定板中于620nm下测量上清液的吸光度，并减去空白值。
在0.1M最适pH(如果没有特殊说明)的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液中配制羽扇豆属植物半乳聚糖的O.5％溶液，将10μl适当稀释的酶溶液加入到1ml的底物中，30℃下温育15分钟，之后在95℃下热灭活20分钟。在微量滴定板中通过与PHBAH试剂反应测定还原糖，所说的PHBAH试剂含有0.15g对羟基苯甲酸酰肼(Sigma H-9882)、0.50g酒石酸钾钠(Merck 8087)、2％NaOH溶液(将体积定容为10.0ml)。减去空白的结果。半乳糖用作标准品。
在AZCL-半乳聚糖上测量最适pH和温度。使用0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液的pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)确定最适pH。为了确定最适温度，使用最适pH的0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液在不同的温度下反应15分钟。
Km和比活的研究如下在各种(0.025-1.0％)羽扇豆属植物半乳聚糖浓度(S)下温育，测量产生的还原糖，然后计算反应速率(v)，以S为函数作出S/v图，进行线性回归分析，得到斜率(=1/Vmax)和截距(Km/Vmax)，计算Km和比活(=Vmax/E)，其中的E是加入的酶量。酶 Meripilus giganteusMw35kDapI 5.9最适pH 5.5最适温度 40℃Km(％半乳聚糖) 0.4-0.8比活(μmol/分钟/毫克)5000-7000氨基末端序列使用带有应用生物系统设备(ABI 473A蛋白质测序仪，应用生物系统，美国)的Edman降解，按照厂商的说明进行氨基末端分析。
N端序列对于具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的本发明的半乳聚糖酶，其N端序列是N端Leu-Thr-Tyr-Lys-Gly-Ala-N端氨基酸Leu位于SEQ ID NO:2的19位上。这表明本发明的成熟半乳聚糖酶从SEQ ID NO:2的19位开始。
因此，成熟的序列为SEQ ID NO:2的19-342。
实施例5表现可代谢的能量使用经典的表观可代谢能量(AME)测定方法评价了本发明的半乳聚糖酶(如实施例3的描述而获得)对基本日常饮食的营养价值的影响，以便评价禽类可以利用的饮食中能量的数量。使用含有高粱(64％)和大豆粉(30％)的实验基本日常饮食进行AME研究。
将商用肉鸡(InghamTMIM98)在控温的鸡舍的平地(floor)栅栏中从出生一直饲养到24日龄。使用商业引子饲料喂养21天，然后使用商业终止饲料。将小鸡分成5组，称重，并转移到位于同一鸡舍另一房间的48个代谢笼子中。使用实验饮食喂养7天(1-7天)。起初的3天(1-3天)使小鸡适应笼子和饲料。在此期间测量饲料的吸收情况。在接下来的4天(4-7)中，测量饲料的吸收情况，收集所有分泌物并将其干燥。在第5天，通过于90℃下过夜干燥，测量收集的分泌物的含水量。
通过在105℃下过夜干燥，测量高粱、颗粒饲料和碾磨的饲料样品的干物质(DM)含量。使用Parr恒温环境弹式量热计测量分泌物和碾磨饲料中的总能量(GE)值。通过Kjeltec消化方法、蒸馏和滴定测量饲料和分泌物样品中的氮含量。
在此实验中，饲料中的半乳聚糖酶的含量为6.7ml/kg，饲料中的乳糖酶(SumilactTM，产品号40303-01，可以从Shinihon，日本买到)的含量为3.3ml/kg。
表明提供的饲料和无效分泌物能量差异的结果如下表2所示。
表2表观可代谢能量(AMEn)处理 剂量(ml/kg饲料)动物数(N)AMEn(MJ/kgDM)/改进基本日常饮食(B)-12512.17bcB+乳糖酶 3.3125 12.06c/-0.9％B+半乳聚糖酶 6.7125 12.37abc/+1.5％B+乳糖酶+半乳聚3.3+6.7125 12.68a/+3.9％糖酶带有不同上标的值是明显差异(p＜0.05)。这表明本发明的半乳聚糖酶在动物饲料工业上是有用的。
序列表SEQ ID No.1显示出包含在转化到保藏的大肠杆菌DSM 10355中的DNA构建体中的半乳聚糖酶编码序列的DNA序列。序列表(2)SEQ ID No:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1026个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅵ)原始来源(A)有机体Meripilus giganteus(B)菌株CBS 521.95(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..1026(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No:1:ATG ATG TTC GTG CTC CCC TTC CTG CTG CTC TCA TTC TCC TGG CTG GCG 48Met Met Phe Val Leu Pro Phe Leu Leu Leu Ser Phe Ser Trp Leu Ala1 51015AGC GCC CTG ACG TAC AAG GGC GCA GAC ATC TCC TCG GTC CCT CTG GTA 96Ser Ala Leu Thr Tyr Lys Gly Ala Asp Ile Ser Ser Val Pro Leu Val202530GAG CAG GCA GGC ATC AAG TAC ACG GAC GGC GGC AAA GTC ACG CCC TTC 144Glu Gln Ala Gly Ile Lys Tyr Thr Asp Gly Gly Lys Val Thr Pro Phe354045GAG AAC ATC ATC CAC AAC CAC GGC GCG AAC ACC GTG CGC ATC CGC ATT 192Glu Asn Ile Ile His Asn His Gly Ala Asn Thr Val Arg Ile Arg Ile505560TGG ACC GCG GGC GAC TAC AAC CTG CAG TAT GGG CTG GCG CTC GCG AAG 240Trp Thr Ala Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Tyr Gly Leu Ala Leu Ala Lys6570 75 80CGG GTG AAG GCG GCC GGC CTG ACG CTG GTG GTC GAC CTC CAT TAC AGC288Arg Val Lys Ala Ala Gly Leu Thr Leu Val Val Asp Leu His Tyr Ser859095GAT ACA TGG GCG GAC CCC GGA AAA CAG GCG ATT CCC TCG GCA TGG CCC336Asp Thr Trp Ala Asp Pro Gly Lys Gln Ala Ile Pro Ser Ala Trp Pro100 105 110AAG GAC TTG GAC GGA TTG AAC ACT CAG ATT TGG CAG TAC ACG AAG GAC384Lys Asp Leu Asp Gly Leu Asn Thr Gln Ile Trp Gln Tyr Thr Lys Asp115 120 125GTT GTG ACG AGC TTC GCA AAC CAA GGC ACC CCA ATT GAC ATC CTC CAG432Val Val Thr Ser Phe Ala Asn Gln Gly Thr Pro Ile Asp Ile Leu Gln130 135 140GTC GGC AAC GAG ATT AAC AAC GGA CTC CTG TGG CCT GTC GGA GAG ATC480Val Gly Asn Glu Ile Asn Asn Gly Leu Leu Trp Pro Val Gly Glu Ile145 150 155 160TCG TCC AAT GGC ATC AAC CCC GTC TCG CAG CTG CTC CAT TCC GCG ATA528Ser Ser Asn Gly Ile Asn Pro Val Ser Gln Leu Leu His Ser Ala Ile165 170175AAC GGC GCC AAA GCG GCA GGC AAC CCG AAG ATC CTC ATC CAC CTC GCG576Asn Gly Ala Lys Ala Ala Gly Asn Pro Lys Ile Leu Ile His Leu Ala180 185 190AAC GGC TGG GAC TGG TCC GGG CTC AAC TCG TTC TTT GGC AAG GTC TTC624Asn Gly Trp Asp Trp Ser Gly Leu Asn Ser Phe Phe Gly Lys Val Phe195 200 205ATC CCG GGC GCG CTC TCC GCC GAC GAG GTC GAC ATC ATC GGC GTA TCC672Ile Pro Gly Ala Leu Ser Ala Asp Glu Val Asp Ile Ile Gly Val Ser210 215 220TTC TAC CCG TTC TAT GAC GCC GGC GCG ACG CTT TCC GCG CTC AAG TCA720Phe Tyr Pro Phe Tyr Asp Ala Gly Ala Thr Leu Ser Ala Leu Lys Ser225 230 235 240TCG CTC GCT AAC CTC GCG AAC ACG TTC AAG AAG CCT ATC GTC GTC GCG 768Ser Leu Ala Asn Leu Ala Asn Thr Phe Lys Lys Pro Ile Val Val Ala245 250 255GAG ACG GAT TGG CCC GTG GCT TGC TCA GGC GTG AAG TTG ACC GAG CCG 816Glu Thr Asp Trp Pro Val Ala Cys Ser Gly Val Lys Leu Thr Glu Pro260 265 270AGC GTC CCC GTC TCG ACG AGT GGA CAG CAG ACA TGG ATC GGC GAC ATC 864Ser Val Pro val Ser Thr Ser Gly Gln Gln Thr Trp Ile Gly Asp Ile275 280 285AAG AAC GTG CTG CAG TCC CTC CCT AAC GGC CTC GGC CAA GGT ATT TTC 912Lys Asn Val Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Leu Gly Gln Gly Ile Phe290 295 300TAC TGG GAG CCT GGT TGG ATC GGC AAC GCG AAC CTC GGA TCG GGA TGT 960Tyr Trp Glu Pro Gly Trp Ile Gly Asn Ala Asn Leu Gly Ser Gly Cys305 310315320TCG GAC AAC CTC CTC GTT TCT TCC AAC GGA GCT ACT CGG GAC TCG ATC 1008Ser Asp Asn Leu Leu Val Ser Ser Asn Gly Ala Thr Arg Asp Ser Ile325 330 335AAC ATC TTC AAC CAG ATG 1026Asn Ile Phe Asn Gln Met340(2)SEQ ID No:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度342个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No:2:Met Met Phe Val Leu Pro Phe Leu Leu Leu Ser Phe Ser Trp Leu Ala1 51015Ser Ala Leu Thr Tyr Lys Gly Ala Asp Ile Ser Ser Val Pro Leu Val202530Glu Gln Ala Gly Ile Lys Tyr Thr Asp Gly Gly Lys Val Thr Pro Phe354045Glu Asn Ile Ile His Asn His Gly Ala Asn Thr Val Arg Ile Arg Ile505560Trp Thr Ala Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Tyr Gly Leu Ala Leu Ala Lys65707580Arg Val Lys Ala Ala Gly Leu Thr Leu Val Val Asp Leu His Tyr Ser859095Asp Thr Trp Ala Asp Pro Gly Lys Gln ALa Ile Pro Ser Ala Trp Pro100 105 110Lys Asp Leu Asp Gly Leu Asn Thr Gln Ile Trp Gln Tyr Thr Lys Asp115 120 125Val Val Thr Ser Phe Ala Asn Gln Gly Thr Pro Ile Asp Ile Leu Gln130 135 140Val Gly Asn Glu Ile Asn Asn Gly Leu Leu Trp Pro Val Gly Glu Ile145 150 155 160Ser Ser Asn Gly Ile Asn Pro Val Ser Gln Leu Leu His Ser Ala Ile165 170 175Asn Gly Ala Lys Ala Ala Gly Asn Pro Lys Ile Leu Ile His Leu Ala180 185 190Asn Gly Trp Asp Trp Ser Gly Leu Asn Ser Phe Phe Gly Lys Val Phe195 200 205Ile Pro Gly Ala Leu Ser Ala Asp Glu Val Asp Ile Ile Gly Val Ser210 215 220Phe Tyr Pro Phe Tyr Asp Ala Gly Ala Thr Leu Ser Ala Leu Lys Ser225 230 235 240Ser Leu Ala Asn Leu Ala Asn Thr Phe Lys Lys Pro Ile Val Val Ala245 250 255Glu Thr Asp Trp Pro Val Ala Cys Ser Gly Val Lys Leu Thr Glu Pro260 265270Ser Val Pro Val Ser Thr Ser Gly Gln Gln Thr Trp Ile Gly Asp Ile275 280 285Lys Asn Val Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Leu Gly Gln Gly Ile Phe290 295 300Tyr Trp Glu Pro Gly Trp Ile Gly Asn Ala Asn Leu Gly Ser Gly Cys305 310 315 320Ser Asp Asn Leu Leu Val Ser Ser Asn Gly Ala Thr Arg Asp Ser Ile325 330 335Asn Ile Phe Asn Gln Met340
权利要求
1．一种包含DNA序列的DNA构建体，这种DNA序列编码具有半乳聚糖酶活性的酶，此DNA序列包括(a)克隆到质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分，所说的质粒存在于大肠杆菌DSM 10355中；(b)在SEQ ID NO 1的1-1026位或更优选的为55-1026位所示的DNA序列，或者它的互补链；(c)在(a)或(b)中限定的DNA序列的类似物，其和所说的DNA序列至少有70％的同源性；(d)在低的严格性条件下与SEQ ID NO 1的1-1026位所示的DNA序列杂交的DNA序列；(e)一种DNA序列，由于遗传密码的简并性，其不能和(b)或(d)序列杂交，但是其编码与由这些DNA序列之任一编码的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽；或(f)一种DNA序列，其是(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中限定的DNA序列的等位形式或片段。
2．按照权利要求1的DNA构建体，其中所说的编码具有半乳聚糖酶活性的酶的DNA序列是可以从微生物，优选的是丝状真菌、酵母或者细菌获得的。
3．按照权利要求2的DNA构建体，其中所说的DNA序列是可以从多孔菌科(Polyporaceae)的菌株获得的，所说的菌株如Meripilus、烟管菌属(Bjerkandera)或者绵皮孔菌属(Spongipellis)，特别是Meripilusgiganteus的菌株。
4．按照权利要求3的DNA构建体，其中所说的DNA序列是从Meripilus giganteus CBS 521.95菌株的DNA文库分离的或者以此为基础产生的。
5．按照权利要求2的DNA构建体，其中所说的DNA序列是可以从曲霉属的种(Aspergillus sp.)的菌株获得的，特别是可以从棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)或黑曲霉(A.niger)的菌株；疫霉属的种(Phytophthora sp.)的菌株，特别是致病疫霉(Phytophthora infestans)、大雄疫霉(Phytophthora megasperma)、恶疫霉(Phytophthora cactorum)；或者Talaromyces的种的菌株，特别是T.byssochlamydoides、T.emersonii的菌株；嗜热子囊菌属的种(Thermoascus sp.)的菌株，特别是嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)；孢子丝菌属(Sporotrichum)的菌株，特别是Sporotrichum celluphilum的菌株；或者青霉属的种(Penicillium sp.)的菌株，特别是桔青霉(Penicillium citrinum)、沙门柏干酪青霉(Penicilliumcamembertii)或娄地青霉(Penicillium roquefortii)的菌株获得的。
6．按照权利要求1的DNA构建体，其中所说的DNA序列是从大肠杆菌DSM 10355中分离的。
7．一种重组表达载体，这种载体包含按照权利要求1-6之任一的DNA构建体。
8．一种宿主细胞，这种细胞包含按照权利要求1-6之任一的DNA构建体或者按照权利要求7的重组表达载体。
9．按照权利要求8的宿主细胞，这种细胞是真核细胞，特别是真菌细胞，如酵母细胞或丝状真菌细胞。
10．按照权利要求9的宿主细胞，这种细胞是镰孢属(Fusarium)、或者曲霉属、或者Thichoderma的菌株，特别是具有镰孢属ATCC 20334鉴定特征的镰孢属的种、黑曲霉、米曲霉、Trichoderma harzianum、Trichoderma reesei的菌株。
11．按照权利要求9的宿主细胞，这些细胞是酵母属(Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。
12．根据权利要求9的宿主细胞，这些细胞是Meripilus的种的菌株，特别是Meripilus giganteus。
13．根据权利要求12的宿主细胞，其是菌株Meripilus giganteus CBS521.95。
14．一种产生具有半乳聚糖酶活性的酶的方法，这种方法包括在允许产生此酶的条件下培养权利要求8-13之任一的细胞，并且从培养物中回收所说的酶。
15．一种具有半乳聚糖酶活性的分离的酶，其特征在于(ⅰ)不含同种杂质和(ⅱ)所说的酶是由按照权利要求14的方法并用按照权利要求8-11之任一的宿主细胞产生的。
16．一种具有半乳聚糖酶活性的分离的酶，所说的酶选自下组(a)由克隆到质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分编码的多肽，所说的质粒存在于大肠杆菌DSM 10355中；(b)包含SEQ ID NO 2的19-342位所示的氨基酸序列的多肽；(c)(a)或(b)中限定的多肽的类似物，其和所说的多肽至少具有70％的同源性；(d)(a)、(b)或者(c)的等位形式或片段。
17．一种组合物，其包含按照权利要求15或16的酶。
18．一种酶组合物，这种酶组合物富含按照权利要求15或16的具有半乳聚糖酶活性的酶。
19．按照权利要求18的组合物，这种组合物还包含α-阿拉伯糖苷酶、木聚糖酶，β-半乳糖苷酶、α-葡糖醛酸苷酶、β-木糖苷酶、木聚糖乙酰基酯酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、鼠李糖半乳糖醛酸酶、果胶乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酸酯裂解酶、葡聚糖酶、果胶甲基酯酶、漆酶、或植酸酶。
20．按照权利要求15或16的酶或者按照权利要求17-19之任一的酶组合物在制备饲料或食品方面的用途。
21．按照权利要求15或16的酶或者按照权利要求17-19之任一的酶组合物在降低植物细胞壁来源的材料的粘度方面的用途。
22．按照权利要求15或16的酶或者按照权利要求17-19之任一的酶组合物在酒或果汁生产中的用途。
23．一种保藏的菌株大肠杆菌DSM 10355的分离的基本上纯的生物培养物。
全文摘要
本发明涉及一种具有半乳聚糖酶活性的酶、编码具有半乳聚糖酶活性的酶的DNA构建体、产生所说酶的方法、含有所说的具有半乳聚糖酶活性的酶的酶组合物、含有所说的半乳聚糖酶的去垢剂组合物、所说的酶和酶组合物在许多工业上的用途。
文档编号A23K1/165GK1212012SQ9719259
公开日1999年3月24日 申请日期1997年2月28日 优先权日1996年3月1日
发明者L·V·科弗德, M·S·科宾南, L·N·安德森, I·G·克劳森 申请人:诺沃挪第克公司