热稳定酶组合物的制作方法

专利名称：热稳定酶组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括至少两种热稳定酶的组合物，所述的热稳定酶选自下列酶组成的组内切葡聚糖酶(endoglucanase)、木聚糖酶(xylanase)、肌醇六磷酸酶(phytase)、蛋白酶、半乳聚糖酶(galactanase)、甘露聚糖酶(mannanase)、葡聚糖酶(dextranase)和α-半乳糖苷酶；本发明还涉及该组合物的制备方法及其应用，特别涉及动物饲料。
背景技术：
来源于细毛噬热霉的热稳定木聚糖酶(SEQ ID NO14)公开在WO96/23062中。将来源于橙色热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO 9748的内切-β-1，4-葡聚糖酶的氨基酸序列于2001年9月10日提供给NCBI EntrezProtein Database(保藏号GenPept AAL 16412.1)。热稳定肌醇六磷酸酶的实例是WO99/48380的30页中所列的下面粗体撰写的各种共有肌醇六磷酸酶。
发明概述本发明涉及包括至少两种热稳定酶的组合物，所述的热稳定酶选自下列酶组成的组内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶。本发明还涉及这类组合物的制备方法、它们在动物饲料中的应用、它们在处理植物蛋白中的应用及含有它们的动物饲料组合物。
发明详述尽管固体形式的酶在某种程度上可以使用保护涂层(protective coatings)等而防止受到加热破坏，但是仍需要具有高内在热稳定性的液体酶(本身是热稳定酶)，特别是为了动物饲料目的。
许多动物饲料酶制品是通过对各种微生物进行深层发酵而获得的多成分酶制品。不过，也可以得到通过重组DNA技术制备的大量单一成分饲料酶。单一成分饲料酶可以比传统多成分酶制品具有一定优势。
本发明提供了改进的酶组合物，特别涉及动物饲料领域。
在本文的上下文中，表达方式“酶”和“具有酶活性的多肽”可以互换使用。
热稳定酶就本发明的目的而言，术语热稳定指的是多肽具有使用示差扫描量热法(DSC)在5.0-7.0区间的一个pH下测定的至少70℃的解链温度Tm。在具体的实施方案中，Tm至少为71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、77.5℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或至少为100℃。在可选的实施方案中，Tm至少为64℃、65℃、66℃、67℃、68℃或至少为69℃。
为了测定Tm，可以使用具有如通过SDS-PAGE测定的至少90％(或91、92、93、94、95、96、97或98％)纯度的酶样品。进一步说，这种酶样品可以具有如根据280nm处的吸收度测定且基于根据所述酶氨基酸序列计算的消光系数的0.5-2.5mg/ml蛋白质(或0.6-2.4或0.7-2.2或0.8-2.0mg/ml蛋白质)的浓度。
可以在pH5.0-7.0区间的任意pH值、例如pH7.0(例如在10mM磷酸盐、50mM NaCl的缓冲液中)下或在pH6.5、6.0、5.5或5.0下并使用例如1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9和10℃/分钟的恒定加热速率进行DSC。当使用本文实施例6中所述的设备时，优选的加热速率的实例为1.0、1.5或2.0℃/分钟。对使用小样体积的其它类型设备而言，可以使用例如3、4、5、6、7、8、9或10℃/分钟的加热速率或20、30、40、50乃至达60℃/分钟的加热速率估计Tm。
酶组合物本发明的组合物包括至少两种酶，它们选自热稳定内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶。
在具体的实施方案中，该组合物包括属于这些类型酶中的两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种的热稳定酶。可以包括每种类型中一种以上的酶，例如一种、两种、三种、四种等。
本发明的具体组合物包括至少两种热稳定酶，它们选自内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶组成的组。这类组合物的实例为内切葡聚糖酶和木聚糖酶；内切葡聚糖酶和肌醇六磷酸酶；内切葡聚糖酶和半乳聚糖酶；木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；木聚糖酶和半乳聚糖酶；肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶和半乳聚糖酶；内切葡聚糖酶、肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶；木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶。在优选的实施方案中，将这些组合物与至少一种蛋白酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶合并。
本发明其它具体的组合物包括至少两种热稳定酶，它们选自内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶和半乳聚糖酶组成的组。
本发明其它具体的组合物包括至少两种热稳定酶，它们选自内切葡聚糖酶、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶组成的组。这类组合物的实例为内切葡聚糖酶和木聚糖酶；内切葡聚糖酶和肌醇六磷酸酶；木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶。在优选的实施方案中，将这些组合物与至少一种半乳聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶合并。
进一步说，本发明其它具体的组合物包括下列热稳定酶内切葡聚糖酶和木聚糖酶；内切葡聚糖酶和蛋白酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶和蛋白酶；内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和蛋白酶；木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；木聚糖酶和蛋白酶；肌醇六磷酸酶和蛋白酶；肌醇六磷酸酶、蛋白酶和半乳聚糖酶；木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和蛋白酶；木聚糖酶、蛋白酶和半乳聚糖酶；肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶；半乳聚糖酶和蛋白酶；肌醇六磷酸酶、半乳聚糖酶和α-半乳糖苷酶；肌醇六磷酸酶和α-半乳糖苷酶；蛋白酶和α-半乳糖苷酶；半乳聚糖酶和α-半乳糖苷酶；半乳聚糖酶、蛋白酶和α-半乳糖苷酶。
在这些组合物中，下面是特别有用的膳食的饲料添加剂(a)基于玉米和大豆的膳食肌醇六磷酸酶和蛋白酶；肌醇六磷酸酶、蛋白酶和半乳聚糖酶；(b)基于小麦和大豆的膳食木聚糖酶和蛋白酶；半乳聚糖酶、蛋白酶和木聚糖酶；(c)基于小麦-大麦和大豆的膳食木聚糖酶、β葡聚糖酶和蛋白酶；木聚糖酶、β葡聚糖酶和肌醇六磷酸酶；基于大麦和大豆的膳食β-葡聚糖酶和蛋白酶。
酶的EC类型-Bernard Henrissat糖苷水解酶(glycolside hydrolase)族可以基于来自NC-IUBMB，1992)的酶命名法手册对酶进行分类，另外参见国际互联网上的ENZYME网站http//www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是有关酶命名法的信息库。它主要基于国际生物化学和分子生物学联合会(IUB-MB)的推荐且它记载了已经提供EC(酶委员会)号的每种类型的特征化酶(Bairoch A.The ENZYME数据库，2000，Nucleic Acids Res 28304-305)。这种IUB-MB酶命名法基于其底物特异性，而有时基于其分子机理；这类分类并不反映这些酶的结构特征。
几年以前已经提出了基于氨基酸序列相似性的家族中的某些糖苷水解酶、诸如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶的另一种分类法。它们目前属于90个不同的族参见CAZy(ModO)互联网站(Coutinho，P.M.& Henrissat，B.(1999)URL上的糖活性酶服务器http//afmb.cnrs-mrs.fr/～cazv/CAZY/index.html(相应的网页Coutinho，P.M.& Henrissat，B.(1999)“糖-活性酶整合的数据库手段”-″Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering″，H.J.Gilbert，G.Davies，B.Henrissat和B.Svensson eds.，The Royal Society of Chemistry，Cambridge，pp.3-12；Coutinho，P.M.& Henrissat，B.(1999)“纤维素酶与其它糖-活性酶的模块结构整合数据库手段”-“Genetics，Biochemistry and Ecology of CelluloseDegradation”.，K.Ohmiya，K.Hayashi，K.Sakka，Y.Kobayashi，S.Karita和T.Kimura eds.，Uni Publishers Co.，Tokyo，pp.15-23)。
具有木聚糖酶活性的多肽类就本发明的目的而言，木聚糖酶是分类为EC 3.2.1.8的酶(参见上述涉及的ENZYME网站)。官方名称为1，4-β-内切木聚糖酶。分类名为1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶(xylanohydrolase)。可以使用其它名称，诸如内切-(1-4)-β-木聚糖酶；(1-4)-β-木聚糖4-木聚糖水解酶(xylanohydrolase)；内切-1，4-木聚糖酶；木聚糖酶；β-1，4-木聚糖酶；内切-1，4-木聚糖酶；内切-β-1，4-木聚糖酶；内切-1，4-β-D-木聚糖酶；1，4-β-木聚糖木聚糖水解酶(xylanohydrolase)；β-木聚糖酶；β-1，4-木聚糖木聚糖水解酶(xylanohydrolase)；内切-1，4-β-木聚糖酶；β-D-木聚糖酶。催化的该反应是木聚糖类上的1，4-β-D-木糖苷键的内切水解反应。
根据上述涉及的CAZy(ModO)网站所述，目前将木聚糖酶分类为下面的糖苷水解酶族之一10、11、43、5或8。
第11族糖苷水解酶可以具有如下特征CAZy族第11族糖苷水解酶已知活性木聚糖酶(EC 3.2.1.8)机理保留(retaining)催化亲核体/碱基Glu(实验)催化质子供体Glu(实验)3D结构状态可获得(参见PDB)折叠β-凝胶(jelly)卷(roll)异种集团(Clan)GH-C在具体的实施方案中，本发明组合物中的热稳定木聚糖酶是i)第0、11、43、5或8族糖苷水解酶中的木聚糖酶；ii)i)中除橙色热子囊菌木聚糖酶外的木聚糖酶；iii)i)中除命名为xyna_theau且由Natesh等描述在J.Mol.Biol.(1999)288，999-1012中的木聚糖酶外的木聚糖酶；iv)第11、43、4或8族糖苷水解酶中的木聚糖酶；或v)第11族糖苷水解酶中的木聚糖酶。表达方式″第NN族糖苷水解酶中的″指的是所述木聚糖酶是或可以分类在″NN″族(例如第10、11、43、5或8族)中。
在另一个具体的实施方案中，所述的热稳定木聚糖酶来源于细菌木聚糖酶，例如芽孢杆菌属木聚糖酶，例如来自Bacillus halodurans、短小芽孢杆菌、Bacillus agaradhaerens、环状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、芽孢杆菌属的种类、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株的木聚糖酶，这些木聚糖酶包括进入上述涉及的CAZy(ModO)网站的芽孢杆菌属木聚糖酶序列中的每一种。
在另一个具体的实施方案中，第11族糖苷水解酶是真菌木聚糖酶。真菌木聚糖酶包括如上述所定义的酵母和丝状真菌多肽类，条件是这些多肽类具有木聚糖酶活性。
第11族糖苷水解酶中真菌木聚糖酶的实例是可以来源于下列真菌属的那些真菌木聚糖酶曲霉属、短柄霉属、翘孢霉属、镰孢属、顶囊壳属、腐质霉属、Lentinula、Magnaporthe、Neocallimastix、拟诺卡氏菌属、Orpinomyces、拟青霉属、青霉属、毕赤氏酵母属、裂褶菌属、踝节菌属、噬热霉属、木霉属。
在下面的一般多肽部分中列举了这些属中的种类的实例。
已经将来源于许多这些生物体的木聚糖酶多肽类的序列提供给了数据库GenBank/GenPept且显然可以从CAZy(ModO)网站得到SwissProt保藏号。
第11族糖苷水解酶中优选的真菌木聚糖酶是如下来源的木聚糖酶(i)曲霉属，诸如SwissProt P48824、SwissProt P33557、SwissProt P55329、SwissProt P55330、SwissProt Q12557、SwissProt Q12550、SwissProt Q12549、SwissProt P55328、SwissProt Q12534、SwissProt P87037、SwissProt P55331、SwissProt Q12568、GenPept BAB20794.1、GenPept CAB69366.1；(ii)木霉属，诸如SwissProt P48793、SwissProt P36218、SwissProtP36217、GenPeptAAG01167.1、GenPept CAB60757.1；(iii)噬热霉属或腐质霉属，诸如SwissProt Q43097；或(iv)与(i)-(iii)中任意一种木聚糖酶的(成熟)氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列的木聚糖酶；或(v)由在低严格条件下与相当于(i)-(iii)中任意一种木聚糖酶基因的成熟木聚糖酶编码部分杂交的核酸序列编码的木聚糖酶；(vi)包括一种或多种氨基酸取代、缺失和/或插入的(i)-(iii)木聚糖酶中任意一种的变体；(vii)(i)-(iv)的等位变体；(viii)具有木聚糖酶活性的(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(vi)的片段；或(ix)基于(i)-(iii)设计并具有木聚糖酶活性的合成多肽。
显然可以从本文一般多肽部分中得出形成本发明组合物组成部分的这些优选真菌木聚糖酶的定义、具体条件、参数和具体实施方案(只用″木聚糖酶″取代″多肽″)。例如，这是计算同一性百分比和选择杂交条件的方案。
优选的木聚糖酶是SwissProt Q43097的噬热霉木聚糖酶(其中成熟肽相当于SEQ ID NO14的第31-225位氨基酸)或其如上述(iv)-(ix)中定义的类似物。这种木聚糖酶还描述在WO96/23062中且它在pH7.0下具有的Tm为75.0℃(参见实施例6)。
各种曲霉属木聚糖酶还描述在EP 695349、EP 600865、EP 628080和EP 532533中。EP 579672中描述了腐质霉属木聚糖酶。
可以应用任意使用包括木聚糖上的1，4-β-D-木糖苷内切-键的底物的试验测定木聚糖酶活性。试验-pH和试验-温度应适合于所述木聚糖酶。试验-pH-值的实例为pH4、5、6、7、8、9、10或11。试验-温度的实例为30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。
利用不同类型的底物测定木聚糖酶活性，例如Xylazyme交联的阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)片(来自MegaZyme)或偶氮染色的阿拉伯木聚糖的不溶性粉末分散体和溶液。
为了检测饲料、预混合物等样品中的木聚糖酶，在50℃-70℃的温度下(所用的温度越高，则酶的热稳定性越强)和一般由磷酸盐缓冲液(0.1M且pH调节至使所述酶的最佳pH)组成的提取介质中将酶提取30-60分钟的时间期限。优选的木聚糖酶试验公开在实施例7中。
全部测定均基于在约590-600nm处的分光光度法测定原理。将所述酶或适用的提取的酶与已知用量的底物一起保温并根据通过向不含酶的类似对照膳食中添加已知量的酶标准品而获得的标准曲线确定颜色的释放。当没有获得对照饲料时，向样品中加入已知量的酶(掺加)并根据掺加与不掺加样品之间的反应差异计算添加的酶量。
具有内切葡聚糖酶活性的多肽类就本发明的目的而言，术语内切葡聚糖酶命名的是分类为或可以分类为EC 3.2.1.4、EC 3.2.1.6、EC 3.2.1.73或EC 3.2.1.39的任意酶(参见如下的1，3(4)-β内切葡聚糖酶中所述)。
按照上述涉及的ENZYME网站所述，将内切葡聚糖酶分类为EC 3.2.1.4。官方名称为纤维素酶。可以使用其它名称，诸如内切葡聚糖酶、1，4-β-内切葡聚糖酶和羧甲基纤维素酶。催化的反应为纤维素上的1，4-β-D-葡萄苷键的内切水解反应。此外，用这类酶水解还含有1，3-键的β-D-葡聚糖上的1，4-键。
按照上述涉及的CAZy(ModO)网站所述，目前将内切葡聚糖酶分类入下列各糖苷水解酶族第10、12、26、44、45、5、51、6、61、7、74、89族或不归入族。
在具体的实施方案中，本发明组合物中的热稳定内切葡聚糖酶是i)分类为EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6的酶；ii)分类为EC 3.2.1.4的酶；iii)第10、12、26、44、45、5、51、6、61、7、74或89族糖苷水解酶中的内切葡聚糖酶；或iv)第5族糖苷水解酶中的内切葡聚糖酶。表达方式″NN族糖苷水解酶中的″指的是所述木聚糖酶为或可以分类入″NN″族(例如第10、12、26、44、45、5、51、6、61、7、74或89族)。
第5族糖苷水解酶可以具有如下特征CAZy族第5族糖苷水解酶已知活性内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)；β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)；外-1，3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.58)；1，6-内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.75)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；内源糖基神经酰胺(endoglycoceramidase)(EC 3.2.1.123)机理保留催化亲核体/碱基Glu(实验)催化质子供体Glu(实验)3D结构状态可获得(参见PDB)折叠(β/α)8异种集团GH-A从CAZy(ModO)网站显然可以得知具有内切葡聚糖酶活性的第5族糖苷水解酶的实例。例如，包括来源于橙色热子囊菌IFO 9748的内切葡聚糖酶(GenPept AAL 16412.1)。
从本文的一般多肽部分显然可以得知形成本发明组合物组成部分的内切葡聚糖酶定义、具体条件、参数和具体实施方案(只用“内切葡聚糖酶”取代“多肽”)。例如，这是计算同一性百分比和选择杂交条件的方案。
在具体的实施方案中，所述多肽是来源于Ascomycota、优选Eurotiomycetidae、更优选曲霉菌目、甚至更优选发菌科的丝状真菌的多肽。
在另一个实施方案中，所述多肽来源于热子囊菌属的真菌、例如橙色热子囊菌种类、诸如热子囊菌菌株CGMCC No.0670的多肽，例如含有SEQID NO2的第1-335或第31-335位氨基酸序列的多肽。这种内切葡聚糖酶(也具有内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性)具有如本文实验部分中公开的热稳定性(Tm为77.5℃)。
可以使用本领域中已知的任意内切葡聚糖酶试验测定内切葡聚糖酶活性。例如，可以在适合于评价酶的条件下施用含各种纤维素-或β-葡聚糖的底物(pH接近最佳pH且温度接近最佳温度)。优选试验的pH在2-10、优选3-9的范围、更优选pH3或4或5或6或7或8、例如pH3或pH7。优选的试验温度在20-80℃、优选30-80℃、更优选40-75℃、甚至更优选40-60℃的范围、优选40℃或45℃或50℃。通过参比适宜的盲试验、例如缓冲盲试验确定酶活性。这些试验条件一般适合于本文所述的任意酶。
使用AZCL-大麦β-葡聚糖(AZO-大麦β-葡聚糖)作为底物的优选内切葡聚糖酶试验的实例分别描述在实施例3和7中。可以修改该试验而使用AZCL-HE纤维素作为底物。在两种情况中，在底物降解后在约OD595处进行分光光度测定(参见内切-水解酶试验的AZCL-多糖类的Megazyme法(http//www.meaazvme.com/booklets/AZCLPOL.pdf)。就本发明的目的而言，还可以按照实施例1中所述的步骤测定内切葡聚糖酶活性，其中该酶在使用实际酶具有活性的温度和pH的条件下催化Azo-CM-纤维素底物降解。
具有内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性的多肽类按照上述涉及的ENZYME网站所述，通常将内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶分类为EC 3.2.1.6。官方名称为内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶。可以使用其它名称，诸如内切-1，4-β-葡聚糖酶、内切-1，3-β-葡聚糖酶或昆布多糖酶。当水解的键上含有还原基团的葡萄糖残基自身在C-3位上被取代时，催化的反应为β-D-葡聚糖上的1，3-或1，4-键的内切水解反应。用于这种类型酶的底物包括昆布多糖、地衣淀粉和谷类D-葡聚糖。
就本发明的目的而言，术语″内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶″包括下列两种酶类型EC 3.2.1.73类的官方名称为licheninase。其它名称为地衣酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，3-1，4葡聚糖酶、1，3-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(glucanohydrolase)或混合键的β-葡聚糖酶。催化的反应为含有1，3-和1，4-键的β-D葡聚糖上的1，4-β-D-苷键的水解反应。这种类型的酶对地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖起作用，而不对仅含1，3-和1，4-键的β-D葡聚糖起作用。
EC 3.2.1.39类的官方名称为葡聚糖内切-1，3-β-D-葡糖苷酶。其它名称为内切-(1-3)-β-葡聚糖水解酶、内切-1，3-β-葡聚糖酶或昆布多糖酶。催化的反应为1，3-β-D-葡聚糖上的1，3-β-D-苷键的水解反应。它对混合键(1，3-1，4)-β-D-葡聚糖具有极为有限的作用，而水解昆布多糖、副淀粉和茯苓多糖。
按照上述涉及的CAZy(ModO)网站所述，目前将内切-1，3(4)-β-葡聚糖分类入第16族糖苷水解酶。
第16族糖苷水解酶可以具有如下特征CAZy族第16族糖苷水解酶已知活性地衣酶(EC 3.2.1.73)；木糖葡聚糖木糖基转移酶(EC 2.4.1.207)；琼脂糖酶(EC 3.2.1.81)；κ-carrageenase(EC 3.2.1.83)；内切-β-1，3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)；内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)；内切-β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.103)机理保留催化亲核体/碱基Glu(实验)催化质子供体Glu(实验)3D结构状态可获得(参见PDB)折叠(β/α)8异种集团GH-B显然可以从CAZy(ModO)网站得到内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶的实例。
可以如本文一般多肽部分中所述衍生内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(只用″内切葡聚糖酶″取代″多肽″)。
可以使用本领域中公知的任意内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶试验测定内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性。例如，可以在适合于评价酶的条件下施用上述任意底物(例如pH接近所述酶的最佳pH且温度接近所述酶的最佳温度)。
用于内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性测定的优选底物为交联的偶氮染色的β-葡聚糖大麦底物。所有测定均基于分光光度测定原理。对饲料或预混合物中的酶样品而言，按照与木聚糖酶测定类似的一般步骤在60℃温度下的1/30M Sorensen缓冲液(溶于4500ml去离子水的0,24g磷酸氢二钠-二水合物(Merck 6580)和22,47g磷酸二氢钾(Merck 4873)；用HCl将pH调节至5.00并稀释至50000ml终体积)中提取该酶，但必须始终将对照饲料用于从大麦中消除内源性内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶背景。
两种方法均可以用于预混合物，但条件是将所分析的预混合物与合适的对照饲料混合(如有关实施例1中试验中所述)。
就本发明的目的而言，优选按照实施例1中所述的步骤测定内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性。
就本发明的目的而言，具有内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性的多肽可以与具有内切葡聚糖酶活性的多肽相同或与之不同。
具有蛋白酶活性的多肽类本文所用的术语蛋白酶是水解肽键的酶(具有蛋白酶活性)。蛋白酶例如也称作肽酶、蛋白酶、肽水解酶或蛋白水解酶。
用于本发明的优选蛋白酶为对多肽链内部起作用的内切型(内肽酶)。内肽酶表现出对与所述蛋白酶特异性相关的N-和C-末端打断的肽底物表现出活性。
上述定义蛋白酶包括属于EC 3.4酶组的任意酶(包括其13个亚-亚类)。
基于蛋白酶的催化机理将其分类入下组，其中每一组为本发明组合物中包括的蛋白酶的具体实施方案丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)和未知的蛋白酶或尚未分类的蛋白酶(U)，参见特别在一般介绍部分中的Handbook of Proteolytic Enzymes，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(eds)，Academic Press(1998)。
可以使用应用包括与所述蛋白酶特异性相关的肽键的底物的任意试验测定蛋白酶活性。试验-pH和试验温度应适合于所述蛋白酶。试验-pH-值的实例为pH 3、4、5、6、7、8、9、10或11。试验温度的实例为25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。
蛋白酶底物的实例为酪蛋白和pNA-底物、诸如Suc-AAPF-pNA(例如购自Sigma S-7388)。在这种pNA-底物中的大写字母指的是一个字母的氨基酸代码。另一个实例为Protazyme AK(由Megazyme T-PRAK制成片的天青蛋白染色的交联酪蛋白)。
WO 01/58276中的实施例2描述了适宜的蛋白酶试验。优选的试验为实施例2D的Protazyme试验(应如上述一般所述使pH和温度适合于所述蛋白酶)。为了检测饲料或预混合物中的蛋白酶，可以使用如上文所述的提取方法，例如实施例1对内切葡聚糖酶和木聚糖酶试验所述的方法。
在具体的实施方案中，所述的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、如WO 01/58275中所定义的枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶。
优选的蛋白酶实例为下述蛋白酶WO 95/02044(棘孢曲霉蛋白酶I或蛋白酶II)；JP 407 5586(黑色曲霉酸性蛋白酶(蛋白酶A))；Berka等在Gene 86153-162，1993中所列(米曲霉aspergillopepsinO)；EP 704167在第8页第51行-第9页第9行中所列；WO 01/58276在第4页第25行-第5页第18行中所列；WO 01/58275在第5页第17行-第6页第5行中所列；待审专利申请PCT/DK02/00824“发明概述”标题部分中所述(要求Novozymes A/S于2001年12月7日提交的DK PA 2001 01821的优先权)；或如本文一般多肽部分中所述的上述任意蛋白酶的类似物、片段、变体、突变体。
优选的热稳定蛋白酶变体与WO 01/58276在第4页第25行-第5页第18行中所列或WO 01/58275在第5页第17行-第6页第5行中所列的任意一种蛋白酶具有至少75％的同一性程度。
从本文的一般多肽部分显然可以得知形成本发明组合物组成部分的这些优选蛋白酶的定义、具体条件、参数和具体实施方案(只用″蛋白酶″取代″多肽″)。例如，这是计算同一性百分比和选择杂交条件的方案。
具有肌醇六磷酸酶活性的多肽类在本发明的上下文中，肌醇六磷酸酶是催化肌醇六磷酸(phytate)水解成(1)肌醇和/或(2)其一-、二-、三-、四-和/或五-磷酸和(3)无机磷酸的酶。
按照上述涉及的ENZYME网站所述，已知两种不同类型的肌醇六磷酸酶所谓的3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶EC 3.1.3.8)和所谓的6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶EC 3.1.3.26)。就本发明的目的而言，两种类型均包括在肌醇六磷酸酶的定义中。
就本发明的目的而言，可以(优选)用FYT单位在下列条件下测定肌醇六磷酸酶活性，其中一个FYT单位是每分钟释放1毫摩尔无机正磷酸的酶用量pH5.5；温度37℃；底物浓度为0.0050mol/l的肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)。合适的肌醇六磷酸酶试验如WO 00/20569的实施例1中所述。FTU用于测定饲料和预混合物中的肌醇六磷酸酶活性。另一方面，可以将与实施例1中所述、例如对内切葡聚糖酶和木聚糖酶测定所述相同的提取原理用于测定饲料和预混合物中的肌醇六磷酸酶活性。
热稳定肌醇六磷酸酶的实例公开在WO 99/49022(肌醇六磷酸酶变体)、WO 99/48380(热稳定肌醇六磷酸酶，参见其中具体的实施例3)、WO00/43503(共有肌醇六磷酸酶)、EP 0897010(修饰的肌醇六磷酸酶)、EP0897985(共有肌醇六磷酸酶)中。
热稳定肌醇六磷酸酶还可以获自下列菌，例如下面的肌醇六磷酸酶(i)子囊菌、诸如公开在EP 684313或US 6139902中的那些；泡盛曲霉PHYA(SWISSPROT P34753，Gene 13355-62(1993))；黑色曲霉(无花果曲霉)PHYA(SWISSPROT P34752，Gene 12787-94(1993)；EP 420358)；泡盛曲霉PHYB(SWISSPROT P34755，Gene 13355-62(1993))；黑色曲霉PHYB(SWISSPROT P34754，Biochem.Biophys.Res.Commun.19553-57(1993))；Emericella nidulans PHYB(SWISSPROT 000093，Biochim.Biophys.Acta 1353217-223(1997))；(ii)噬热霉属或腐质霉属、诸如公开在WO 97/35017中的细毛噬热霉肌醇六磷酸酶；(ii)担子菌纲、诸如隔孢伏革菌属(WO 98/28408和WO 98/28409)；(iii)其它真菌肌醇六磷酸酶，诸如公开在JP 11000164中的那些(青霉属肌醇六磷酸酶)或WO 98/13480(亚克红曲霉肌醇六磷酸酶)；(iv)芽孢杆菌属、诸如枯草芽孢杆菌PHYC(SWISSPROT 031097，Appl.Environ.Microbiol.642079-2085(1998))；芽孢杆菌属的种类PHYT(SWISSPROT 066037，FEMS Microbiol.Lett.162185-191(1998)；枯草芽孢杆菌PHYT_(SWISSPROT P42094，J.Bacteriol.1776263-6275(1995))；公开在AU 724094或WO 97/33976中的肌醇六磷酸酶；(v)大肠埃希氏杆菌(US 6110719)；(vi)西方许旺氏酵母(US 5830732)；(vii)具有与(i)-(vi)肌醇六磷酸酶的(成熟)氨基酸序列至少75％同一性的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶；或(viii)由在低严格条件下与相当于(i)-(vi)肌醇六磷酸酶基因的成熟肌醇六磷酸酶编码部分杂交的核酸序列编码的肌醇六磷酸酶；
(ix)包括一种或多种氨基酸取代、缺失和/或插入的(i)-(vi)肌醇六磷酸酶的变体；(vii)(i)-(vi)的等位变体；(viii)具有肌醇六磷酸酶活性的(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(vi)的片段；或(x)基于(i)-(vi)设计并具有肌醇六磷酸酶活性的合成多肽。
用于本发明的优选热稳定肌醇六磷酸酶是Peniophora lycii肌醇六磷酸酶的各种热稳定变体(相当于SEQ ID NO15第31-225位氨基酸的成熟肽)。这些热稳定变体分别公开在2002年2月8日提交的DK专利申请号200200193和2002年9月3日提交的DK专利申请号2002 01449中。这些热稳定变体与SEQ ID NO15第31-225位氨基酸具有至少75％程度的同一性。
从本文的一般多肽部分显然可以得知形成本发明组合物组成部分的这些优选肌醇六磷酸酶的定义、具体条件、参数和具体实施方案(只用″肌醇六磷酸酶″取代″多肽″)。例如，这是计算同一性百分比和选择杂交条件的方案。
具有半乳聚糖酶活性的多肽类本文所用的术语半乳聚糖酶是催化阿拉伯半乳聚糖上的1，4-β-D-半乳糖苷键的内切水解反应的酶。IUBMB酶命名法为EC 3.2.1.89。官方名称为阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷酶。可选的名称为内切-1，4-β-半乳聚糖酶、半乳聚糖酶和阿拉伯半乳聚糖酶(arabinogalactanase)。
在具体的实施方案中，本发明组合物中的半乳聚糖酶i)是或可以分类为EC 3.2.1.89和/或ii)是或可以分类为糖苷水解酶的第53族半乳聚糖酶。
GH第53族的特征如下已知活性内切-1，4-β-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)机制保留催化亲核体/碱基Glu(实验)催化质子供体Glu(实验)可得到的3D结构状态(参见PDB)折叠(β/α)8异种集团GH-A这些是半乳聚糖酶的实例
其它实例是来源于Meripilus giganteus(WO 97/32013)、荧光假单胞菌、Baccillus agaradhaerens(WO 00/47711)和地衣形芽孢杆菌(WO 00/47711)的半乳聚糖酶。
例如，半乳聚糖酶可以来源于上述任意菌株。第53族糖苷水解酶中的半乳聚糖酶变体公开在2002年12月20日提交的专利申请DK 2002 01968中。在具体的实施方案中，这些变体来源于Myceliophthora thermophila、Humicola insolens、棘孢曲霉或地衣形芽孢杆菌。优选的半乳聚糖酶变体来源于Myceliophthora thermophila(相当于SEQID NO16的第1-332位氨基酸的成熟肽)。在具体的实施方案中，这些变体与SEQID NO16的第1-332位氨基酸具有至少75％程度的同一性。
从本文的一般多肽部分显然可以得知形成本发明组合物组成部分的这些优选半乳聚糖酶的定义、具体条件、参数和具体实施方案(只用″半乳聚糖酶″取代″多肽″)。例如，这是计算同一性百分比和选择杂交条件的方案。
具有甘露聚糖酶活性的多肽类本文所用的术语甘露聚糖酶指的是催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖上的1，4-β-D-甘露糖苷键随机水解的酶。官方名称为甘露聚糖内切-1，4-β-甘露糖苷酶。可选的名称为β-甘露聚糖酶和内切-1，4-甘露聚糖酶。按照IUBMB酶命名法的EC号为EC 3.2.1.78。
在具体的实施方案中，本发明组合物中的甘露聚糖酶i)是或可以分类为EC 3.2.1.78和/或ii)是或可以分类为第26、44或5族的糖苷水解酶半乳聚糖酶。
例如，甘露聚糖酶可以来源于曲霉属的菌株(例如棘孢曲霉，参见WO94/25576和US 5,795,764)、芽孢杆菌属的菌株(WO 91/18974、WO 99/6573、WO 99/64619)、木霉属的菌株(WO 93/24622)、菌株CBS 480.95(WO 95/35362)或作为第26、44或5族糖苷水解酶成员公开在http//afmb.cnrs-mrs.fr/-cazv/CAZY/index.Html上的甘露聚糖酶序列，诸如例如SWISS-PROTP55296，MANA_PIRSP；P49424，MANA_PSEFL；P49425，MANARHOMR；P51529，MANA_STRLI；P16699，MANS_BACS；P55278，MANB_BACSU；P22533，MANB_CALSA；P55297，MANB_PIRSP；P55298，MANC_PIRSP。
在具体的实施方案中，所述的热稳定甘露聚糖酶变体来源于上述涉及的任意序列。优选的变体来源于棘孢曲霉甘露聚糖酶(WO 94/25576和US5,795,764)、芽孢杆菌属的菌株(WO 91/18974、WO 99/6573、WO 99/64619)、木霉属的菌株(WO 93/24622)或菌株CBS 480.95(WO 95/35362)。在具体的实施方案中，这些变体与它所来源的亲代甘露聚糖酶具有至少75％程度的同一性。
从本文的一般多肽部分显然可以得知形成本发明组合物组成部分的这些优选甘露聚糖酶的定义、具体条件、参数和具体实施方案(只用″甘露聚糖酶″取代″多肽″)。例如，这是计算同一性百分比和选择杂交条件的方案。
具有葡聚糖酶活性的多肽类本文所用的术语葡聚糖酶指的是催化葡聚糖上的1，6-α-D-苷键的内切水解的酶。官方名称为葡聚糖酶。可选的名称为α-1，6-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶。按照IUBMB酶命名法的号为3.2.1.11。
在具体的实施方案中，本发明组合物中的葡聚糖酶i)是或可以分类为EC 3.2.1.11和/或ii)是或可以分类为第49或66族糖苷水解酶。
例如，葡聚糖酶可以来源于Paecilomyces lilacinus(US 6,156,553)或作为第49或66族糖苷水解酶的成员公开在http//afmb.cnrs-mrs.fr/-cazv/CAZY/index.Htmi上的葡聚糖酶序列，诸如例如SWISS-PROTP70744，DEXT_ARTGO；P39652，DEXT_ARTSP；P48845，DEXT_PENMI；P39653，DEXT_STRDO；Q54443，DEXT_STRMU；Q59979，DEXTSTRSL。
在具体的实施方案中，所述的热稳定葡聚糖酶变体来源于上述涉及的任意序列。优选的变体来源于Paecilomyces lilacinus(US 6,156,553)葡聚糖酶。在具体的实施方案中，这些变体与该葡聚糖酶具有至少75％程度的同一性。
从本文的一般多肽部分显然可以得知形成本发明组合物组成部分的这些优选葡聚糖酶的定义、具体条件、参数和具体实施方案(只用″葡聚糖酶″取代″多肽″)。例如，这是计算同一性百分比和选择杂交条件的方案。
具有α-半乳糖苷酶活性的多肽类α-半乳糖苷酶是催化如下反应的酶蜜二糖+H(2)O<＝>半乳糖+葡萄糖。官方名称为α-半乳糖苷酶。可选的名称为蜜二糖酶。它还水解α-D-盐藻糖苷。按照IUBMB酶命名法的号为3.2.1.22。
在具体的实施方案中，本发明组合物中的α-半乳糖苷酶i)是或可以分类为EC 3.2.1.22和/或ii)是或可以分类为第27、36、4或57族糖苷水解酶。
例如，葡聚糖酶可以来源于曲霉属的菌株(例如黑色曲霉，例如参见美国专利US 6,197,455)或作为第27、36、4或57族糖苷水解酶的成员公开在http//afmb.cnrs-mrs.fr/-cazy/CAZY/index.html上的α-半乳糖苷酶序列，诸如例如SWISS-PROT P43467，AGA1_PEDPE；P43469，AGA2_PEDPE；P28351，AGAL_ASPNG；O34645，AGAL_BACSU；Q42656，AGAL_COFAR；P14749，AGAL_CYATE；P06720，AGAL_ECOLI；Q9X4Y0，AGAL_RHIME；P30877，AGAL_SALTY；P27756，AGAL_STRMU；Q9UUZ4，AGLCASPNG；P04824，MEL1_YEAST；P41945，MEL2_YEAST；P41946，MET5YEAST；P41947，MEL6_YEAST；P16551，RAFA_ECOLI。
在具体的实施方案中，所述的热稳定α-半乳糖苷酶变体来源于上述涉及的任意序列。优选的变体来源于黑色曲霉(US 6,197,455)α-半乳糖苷酶。在具体的实施方案中，这些变体与该α-半乳糖苷酶具有至少75％程度的同一性。
从本文的一般多肽部分显然可以得知形成本发明组合物组成部分的这些优选α-半乳糖苷酶的定义、具体条件、参数和具体实施方案(只用″α-半乳糖苷酶″取代″多肽″)。例如，这是计算同一性百分比和选择杂交条件的方案。
同源多肽类本发明涉及含有与特定氨基酸序列具有一定程度同一性的氨基酸序列并具有诸如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶或α-半乳糖苷酶活性这样的酶活性的多肽类(下文的″同源多肽类″)。
就本发明的目的而言，通过属于Needleman-Wunsch序列对比的程序性″序列对比″(即总体序列对比)测定两种氨基酸序列之间的同一性程度和两种核苷酸序列之间的同一性程度。将这种程序用于对多肽和核苷酸序列进行序列对比。默认值标记矩阵(default scoring matrix)BLOSUM50用于多肽序列对比，而默认值同一性(identity)矩阵用于核苷酸序列对比。对多肽类而言，对缺口的第一个残基的补偿为-12，而对核苷酸而言为-16。对多肽类而言，对缺口的其它残基的补偿为-2，而对核苷酸而言为-4。
“序列对比”是FASTA包v20u6版的部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″生物序列分析用改进工具″-PNAS 852444-2448；和W.R.Pearson(1990)″使用FASTP和FASTA进行的快速和灵敏性序列对比-″Methods in Enzymology 18363-98)。FASTA蛋白质序列对比使用对缺口大小没有限制的Smith-Waterman算法(参见″Smith-Waterman算法″，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147195-197)。
在具体的实施方案中，所述的具有相关的酶活性并与特定氨基酸序列(成熟多肽)具有至少约65％或至少约70％或至少约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％或至少约97％程度的同一性。
在另一个具体的实施方案中，这些同源多肽类含有5个、4个、3个、2个或仅1个氨基酸与特定氨基酸序列不同的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，形成本发明组合物组成部分的至少一种酶在37℃温度下具有3-7范围的最佳pH。
等位变体和片段本文涉及的多肽类可以包括特定的氨基酸序列或它们可以是其具有相关酶活性的等位变体或其片段。在一个实施方案中，这些多肽类包括特定的氨基酸序列或其具有相关酶活性的等位变体或其片段。在另一个实施方案中，这些多肽类由特定的氨基酸序列或其具有相关酶活性的等位变体或其片段组成。
特定氨基酸序列片段是含有从该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施方案中，片段含有至少60个氨基酸残基或至少68个氨基酸残基或至少70个氨基酸残基或至少75个氨基酸残基或至少100个氨基酸残基或至少150个氨基酸残基或至少160个氨基酸残基或至少170个氨基酸残基或至少180个氨基酸残基或至少190个氨基酸残基或至少200个氨基酸残基或至少210个氨基酸残基或至少220个氨基酸残基或至少240个氨基酸残基或至少260个氨基酸残基或至少280个氨基酸残基或至少300个氨基酸残基或至少310个氨基酸残基或至少320个氨基酸残基或至少330个氨基酸残基或至少334个氨基酸残基或至少350个氨基酸残基或至少375个氨基酸残基或至少400个氨基酸残基或至少425个氨基酸残基或至少430个氨基酸残基。
等位变体指的是含有相同染色体基因座的基因的任意两种或多种可选形式。等位变化通过突变自然发生或可以在群体中产生多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽没有改变)或可以编码含有改变的氨基酸序列的多肽类。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
成熟多肽或成熟氨基酸序列指的是可能的信号肽部分被裂解掉后保留的氨基酸部分。而类似的情况是基因的成熟多肽编码部分指的是相当于成熟多肽的基因部分。
杂交本发明还涉及基因特定酶活性且由在极低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选中-高严格条件、甚至更优选高严格条件且最优选极高严格条件下与核酸探针杂交的核酸序列编码的多肽类，其中所述的核酸探针在相同条件下与特定的核苷酸序列或其亚序列或其互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York)。在一个具体的实施方案中，所述的核酸探针选自特定的核酸序列。
亚序列可以至少为100个核苷酸；或在另一个实施方案中，亚序列至少为200个核苷酸。此外，该亚序列可以编码具有相关酶活性的多肽。
对至少为100个核苷酸长度的长探针而言，将极低-极高的严格条件定义为按照标准DNA印迹步骤在42℃下的5X SSPE、0.3％SDS、200ug/ml剪切和变性的鲑精DNA和25％甲酰胺(极低和低严格性)、35％甲酰胺(中等和中-高严格性)或50％甲酰胺(高和极高严格性)中进行预杂交和杂交。
对至少为100个核苷酸长度的长探针而言，使用2x SSC、0.2％SDS、优选至少在45℃(极低严格性)、更优选至少在50℃(低严格性)、更优选至少在55℃(中等严格性)、更优选至少在60℃(中-高严格性)、甚至更优选至少在65℃(高严格性)且最优选至少在70℃(极高严格性)下最终将载体物质洗涤3次，每次15分钟。
对约15个核苷酸-约70个核苷酸长度的短探针而言，将严格条件定义为按照标准DNA印迹步骤、使用Bolton和McCarthy发计算法在低于计算的Tm 5℃-10℃下和0.9M NaCl、0.09M Tris-HCI pH7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X Denhardt′s溶液、1mM焦磷酸钠、1mM一代磷酸钠、0.1mMATP和0.2mg酵母RNA/ml中进行预杂交、杂交和杂交后洗涤(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 481390)。
对约15个核苷酸-约70个核苷酸长度的短探针而言，在低于计算的Tm 5℃-10℃下用6X SCC+0.1％SDS将载体物质洗涤一次，时间为15分钟，且用6X SSC洗涤两次，每次15分钟。
酶变体此外，本文涉及的多肽类可以是包括一种或多种氨基酸取代、缺失和/或插入的特定多肽类的变体。在具体的实施方案中，这些多肽类是特定多肽类的热稳定变体。
变体多肽类的氨基酸序列可以与特定氨基酸序列的区别在于插入或缺失一个或多个氨基酸残基和/或一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。优选氨基酸的改变使性质的改变最小，即保守氨基酸取代不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性；小缺失、一般为1-约30个氨基酸；氨基-或羧基-末端小的伸展，诸如氨基末端的甲硫氨酸残基；至多约20-25个残基的小接头；或通过改变静电荷或另一种功能、诸如多组氨酸段、抗原表位或结合结构域而有利于纯化的小的伸展。
保守取代的实例属于碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的范围内。一般不改变特异性活性的氨基酸取代在本领域中是公知的且例如由H.Neurath和R.L.Hill描述在The Proteins，Academic Press，New York中。通常最可能发生的交换为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、AlaNal、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、LeuNal、Ala/Glu和Asp/Gly且它们的位置可以互换。
微生物来源本文涉及的多肽类可以由来源于天然出现的微生物的核苷酸序列编码或它们可以是基于设计的(遗传改造的)与一种或多种野生型多肽相比改进的类似物、片段、变体、突变体或合成多肽。可以如本领域中一般已知的方法、例如通过位点定向诱变、通过PCR(使用含有所需突变的PCR片段作为PCR反应中的引物之一)或通过随机诱变来制备合成或遗传改造多肽类，包括改组酶和共有酶。共有蛋白质的制备例如描述在EP897985中。
本文涉及的多肽类可以在原始野生型微生物菌株、例如在橙色热子囊菌菌株或另一种微生物菌株、在植物中或在动物中产生或表达-正如本领域中一般公知的。例如，可以在一种和相同表达宿主中共表达木聚糖酶和内切葡聚糖酶。此外，如果可能，可以共表达其它酶。
因此，本文涉及的多肽类可以是野生型或天然出现的多肽类或它们可以是遗传改造的或合成的多肽类。可以在原始野生型菌株中或通过重组基因技术在任意其它宿主细胞中表达它们。
细菌多肽的实例是革兰氏阳性菌多肽、诸如芽孢杆菌属多肽或链霉菌属多肽或革兰氏阴性菌多肽、例如大肠杆菌或假单胞菌属的多肽。
芽孢杆菌属多肽的实例是Bacillus agaradhaeren、环状芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的多肽。
链霉菌属多肽的实例是天蓝色链霉菌、变青链霉菌、拟橄榄绿链霉菌、热蓝紫链霉菌、嗜热紫链霉菌或绿孢链霉菌的多肽。
真菌多肽的实例是酵母多肽，诸如假丝酵母属、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属、糖酵母属、裂殖糖酵母属或Yarrowia的多肽，例如具柄毕赤氏酵母多肽；或丝状真菌多肽，诸如支顶孢属、曲霉属、短柄霉属、隐球酵母属、翘孢霉属、Filibasidium、镰孢属、Gaeumannomyces、腐质霉属、Lentinula、Magnaporthe、毛霉属、毁丝霉属、Neocallimastix、链孢霉属、拟诺卡氏菌属、拟青霉属、青霉属、Piromyces、裂褶菌属、踝节菌属、热子囊菌属、噬热霉属、草根酶属、Tolypocladium或木霉属的多肽。
在一个实施方案中，所述多肽是棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、川地曲霉、构巢曲霉属、黑色曲霉、米曲霉、塔宾曲霉、Emericellanidulans、杆孢状镰孢、Fusarium cereals、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、番茄尖孢镰孢、多枝镰孢、玫瑰色镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Gaeumannomyces graminis、Humicola grisea var.thermldea、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、Lentinula edodes、Magnaporthe grisea、米赫毛霉、Myceliophthora thermophila、Neocallimastix frontalis、Neocallimastixpatriciarum、粗糙链孢霉、达松维尔拟诺卡氏菌、宛氏拟青霉、Penicilliumfuniculosum、产紫青霉、群交裂褶菌、Talaromyces emersonli、橙色热子囊菌、细毛噬热霉、Trichoderma harzinum、康宁氏木霉、Trichodermalongibrachiatum、Trichoderma reesei、Trichoderma terrestris或绿色木霉的多肽。
可以理解的是上述种类的定义既包括完整和不完整的情况、又包括其它分类学上的等同情况、例如无性型，与它们所称作的种类名称无关。本领域技术人员易于识别适宜等同情况的特性。
公众可以在许多培养物保藏所接触到这些种类的菌株，诸如美国模式培养物保藏所(ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikrooranismen undZelllkulturen GmbH(DSMZ)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)和Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern RegionalResearch Center(NRRL)。
此外，可以使用上述探针鉴定并从其它来源、包括从自然中(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物获得这类多肽。从天然栖息地中分离微生物的技术在本领域中是众所周知的。然后可以通过对另一种微生物的基因组或CDNA文库进行类似筛选而衍生所述的核酸序列。一旦用所述探针检测到了编码多肽的核酸序列，则可以通过使用本领域技术人员所公知的技术分离或克隆该序列(例如，参见Sambrook等，1989，文献同上)。
酶的纯度在本发明组合物的具体实施方案中，分离多肽类成分中的至少一种，即基本上不含具有酶活性的其它多肽，例如，正如SDS-PAGE所测定的，纯度至少约为20％、优选纯度至少约为40％、更优选纯度至少约为60％、甚至更优选纯度至少约为80％、最优选纯度至少约为90％且甚至最优选纯度至少约为95％。正如本领域技术人员一般了解的，为了检测目的，可以通过考马斯蓝或银染色给SDS-凝胶染色。例如，应通过经在凝胶上的不同泳道内施加不同浓度检查线性而确保不发生过载。
在另一个实施方案中，多肽类成分中的至少一种得到充分确定。术语充分确定的指的是如通过大小排阻层析法测定的至少50％纯度的所述多肽制品。在其它具体实施方案中，正如通过这种方法测定的，该制品至少具有60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％的纯度或至少具有95％的纯度。正如本领域中一般了解的，在进行大小排阻层析后，可以通过测定214和/或280nm处的吸收度来检测多肽类。
在另一个实施方案中，多肽类成分中至少一种是纯的，术语纯的表示多肽制品在适宜大小排阻柱上的分级分离显示仅有一种具有所述酶活性的主要多肽成分。
本领域技术人员了解如何选择适宜的大小排阻层析柱。可以从通过使所述制品在来自Amersham Pharmacia Biotech的HiLoad26/60 Superdex75pg柱上进行分级分离开始。如果峰没有得到清楚地分离，那么会尝试使用不同的柱(例如使用改进的柱颗粒大小和/或柱长)和/或他会改变样品体积。通过简单而常用的试错法可以使柱达到足够的分辨率(清楚分离的峰)，可以基于此进行纯度计算。
在具体的实施方案中，本发明组合物中的至少一种多肽得到分离和/或大豆充分确定和/或是纯的。在另一个实施方案中，该组合物中的至少两种多肽得到分离和/或大豆充分确定和/或是纯的。在最优选的实施方案中，该组合物多肽类成分中的每一种均得到分离和/或充分确定和/或是纯的。
本发明组合物中应用分离和/或充分确定和/或纯的多肽是有利的。例如，它远比正确地计量动物饲料中基本上无干扰或污染的其它酶的酶更为容易。术语正确地计量特别指的是获得一致和恒定的动物饲喂效果的目的和基于所需作用使剂量最优化的能力。
本发明的组合物可以用于许多目的，例如用于动物饲料。为了这类目的，可以将其(a)直接加入到动物饲料中(或直接用于处理植物蛋白过程)；或(b)可以将其用于生产诸如饲料添加剂或预混合物这样的一种或多种中间体组合物，随后加入到饲料中(用于处理过程)。上述与术语分离、充分确定和纯相关的纯度表示指的是多肽类成分的纯度，即此后将它们混合而形成本发明的组合物而与按照上述(a)或(b)的哪一种方法使用该组合物无关。
特别使用重组生产技术获得具有这种等级纯度的多肽制品，而它们并不易于得到且当通过传统发酵方法生产该多肽时，还会遇到更显著的逐批质量差异。
还优选纯化本发明组合物中包括的多肽类。术语纯化指的是富集蛋白质的制品，其中已经除去了来源于发酵的主要量的低分子量成分、一般的残余的营养物和无机物。例如，可以通过常规的层析法、诸如离子交换层析法、疏水作用层析法和大小排阻层析法进行这类纯化(例如，参见ProteinPurification，Principles，High Resolution Methods，and Applications.EditorsJan-Christer Janson，LarsRyd n，VCH Publishers，1989).
微生物分类学微生物分类学查阅分类学数据库解决，诸如可以在如下互联网网址上获得的NCBI Taxonomy Browserhttp//www.ncbi.nim.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/。就与真菌分类学相关的问题而言，优选参见Kirk，P.M.，P.F.Cannon，J.C.David & J.A.Stalpers编辑的Dictionary ofthe Fungi，9thedition，CAB Publishing，2001。
组合物和应用动物饲料和动物饲料添加剂除上述酶外，本发明的组合物还可以包括其它酶、维生素、矿物质和/或其它组分，其实例如下所列。
可以按照本领域中公知的方法、例如通过根据需要将各种酶成分以分离、纯、成分确定和/或纯化的酶形式混合、优选随后进行配制步骤来制备该组合物。配制的组合物可以是液体或干品，例如颗粒或微粒形式。可以按照本领域中公知的方法使酶稳定。可以将至少一种选自稳定剂、填充剂、pH-调节剂、防腐剂、粘度改进物质、香味化合物和/或类似组分的化合物加入到酶中并与之混合。该过程由此特别是针对液体酶组合物而言。
本发明组合物的优选应用在动物饲料领域内。
就本发明的目的而言，术语动物包括所有动物，包括人。在具体的实施方案中，本发明的组合物用作非人的动物的饲料添加剂。动物的实例为非反刍动物和反刍动物，诸如牛、绵羊和马。在具体的实施方案中，所述的动物为非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如小猪或猪(包括、但不限于小猪、生长的猪和母猪)；家禽，诸如火鸡和小鸡(包括、但不限于小鸡、产卵鸡)；小牛；和鱼(包括、但不限于鲑鱼)。
术语动物饲料、动物饲料组合物、饲料或饲料组合物指的是适合于或用于动物摄取的任意化合物、制品、混合物或组合物。可以在膳食前、后或与膳食一起对动物饲喂本发明的组合物。优选后者。
当用于添加到动物饲料中时，将本发明的组合物命名为动物饲料添加剂。这类添加剂可以是相对简单的至少两种酶的混合物，优选上文涉及的稳定液体或干组合物形式。在另一种类型的动物饲料添加剂中，将两种酶与动物饲料中的其它成分或组分混合。所谓的动物饲料预混合物是这类动物饲料添加剂的实例。预混合物可以含有所述的酶以及至少一种维生素和/或至少一种矿物质。
因此，在具体的实施方案中，除多肽类成分外，本发明的组合物还可以包括至少一种脂溶性维生素和/或至少一种水溶性维生素和/或至少一种微量矿物质。该组合物还可以包括至少一种常量元素。
脂溶性维生素的实例为维生素A、维生素D3维生素E和维生素K、例如维生素K3。
水溶性维生素的实例为维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸(panthothenate)、例如Ca-D-泛酸盐。
微量矿物质的实例为锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。
常量元素的实例为钙、磷和钠。
此外，可选的饲料添加剂组分为抗菌肽类、着色剂、香味化合物和稳定剂。
抗菌肽类(AMP′s)的实例为CAP18、Leucocin A、Tritrpticin，内源性抗微生物多肽-1(Protegrin-1)、Thanatin、防御素和Ovispirin、诸如Novispirin(Robert Lehrer，2000)、Plectasins和抑制素、包括公开在PCT/DK02/00781和PCT/DK02/00812中的化合物和多肽类以及保留抗菌活性的上述肽的变体或片段。
真菌多肽类(AFP′s)的实例为公开在WO 94/01459和WO 02/090384中的巨大曲霉属和黑色曲霉肽类及其保留抗真菌活性的变体和片段。
在具体的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂以0.0010-12.0％或0.0050-11.0％或0.0100-10.0％、具体地说是0.05-5.0％或0.2-1.0％的浓度包括(或规定必需包括)在动物膳食或饲料中(％指的是g添加剂/100g饲料)。这种情况尤其是针对预混合物而言。
因此，可以通过将相同成分在最终饲料中的浓度分别乘以10-10000、20-2000或100-500(指的是上述三种内含物百分比区间)而找到动物饲料添加剂、例如预混合物中各成分的浓度。
重要饲料成分在饲料中的终浓度可以反映出动物的营养需求，它们一般是营养学家所公知的且列在诸如下列公开出版物中NRC，Nutrientrequirements in swine，第9版，1988，国家研究委员会农业部猪的营养委员会小组、动物营养委员会(subcommittee on swine nutrition，committee onanimal nutrition，board of agriculture，national research council.)NationalAcademy Press，Washington，D.C，1988；和NRC，Nutrient requirements ofpoultry，第9版，1994，国家研究委员会农业部猪的营养委员会小组、动物营养委员会(subcommittee on swine nutrition，committee on animal nutrition，board of agriculture，national research council.)National Academy Press，Washington，D.C.1994。
形成本发明组合物组成部分的多肽类当然应以有效量、即足以改善饲料营养价值的用量用于动物饲料中。目前关注的是按照下列剂量范围给予每种酶0.01-200；或0.01-100；或0.05-100；或0.05-50；或0.10-10-所有这些范围均以mg酶蛋白质/kg饲料(ppm)计。
为了测定mg酶蛋白质/kg饲料，从饲料组合物中纯化酶并使用如上所述的相关试验测定纯化酶的特异性活性。还使用相同试验并基于这两次测定结果确定饲料组合物中酶的活性，计算按mg酶蛋白质/kg饲料计的剂量。相同原理用于测定饲料添加剂中的mg酶蛋白质。
当然，如果可用的样品用于制备饲料添加剂或饲料，那么根据该样品测定特异性活性(不需要从饲料组合物或添加剂纯化酶)。
动物饲料组合物或膳食具有相对高含量的蛋白质。本发明的动物饲料组合物具有的粗蛋白含量为50-800或75-700或100-600或110-500或120-490g/kg且进一步包括本发明的组合物。
此外或可选的(对上述粗对比含量而言)，本发明的动物饲料组合物具有的代谢能含量为10-30或11-28或11-26或12-25MJ/kg和/或钙含量为0.1-200或0.5-150或1-100或4-50g/kg和/或可利用的磷含量为0.1-200或0.5-150或1-100或1-50或1-25g/kg和/和甲硫氨酸含量为0.1-100或0.5-75或1-50或1-30g/kg和/或甲硫氨酸+半胱氨酸含量为0.1-150或0.5-125或1-80g/kg和/或赖氨酸含量为0.5-50或0.5-40或1-30g/kg。
将粗蛋白计算为氮(N)乘以因数6.25，即如Animal Nutrition第4版第13章(Eds.P.McDonald，R.A.Edwards和J.F.D.Greenhalgh，LongmanScientific和Technical，1988，ISBN 0-582-40903-9)中所述粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。可以通过Kjeldahl方法测定氮含量(A.O.A.C.，1984，OfficialMethods of Analysis第14版，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)。还可以使用其它方法，诸如所谓的Dumas法，其中将样品在氧气中燃烧并分析形成的氮气量并重新计算为氮。
可以基于NRC出版物Nutrient Requirements of Swine(1988)pp.2-6和European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs，家禽研究和扩展Spelderholt中心，7361 DA Beekbergen，The Netherlands计算代谢能。GrafischbedrijfPonsen & looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5。
在具体的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有至少一种植物蛋白或蛋白质源。植物蛋白或蛋白质源为大豆和诸如大麦、玉米、燕麦、稻、黑麦、高梁和小麦这样的谷类。优选的谷类是小麦、大麦、燕麦和黑麦。
在其它具体的实施方案中，部分的动物饲料组合物含有0-80％玉米和/或0-80％高梁和/或0-70％小麦和/或0-70％大麦和/或0-30％燕麦和/或0-40％大豆粗粉和/或0-10％鱼粉和/或0-20％乳清。
例如，可以将动物膳食制成醪液饲料(非粒状)或粒状饲料。一般来说，按照本说明书对所述种类所述混合磨碎的食物并加入足量的必需维生素和矿物质，参见本文的实施例7。
可以加入固体或液体酶制品形式或饲料添加剂、诸如预混合物形式的本发明组合物。一般在混合步骤前或过程中添加固体组合物且一般在沉淀步骤后加入液体组合物。然而，在实施例7的方法中，在沉淀步骤前添加热稳定液体酶组合物。
当加入到动物饲料中时，本发明的组合物产生了改善的饲料营养价值，例如生长率和/或重量增加和/或动物的饲料转化率(即相对于重量增加摄取的饲料重量)得到改善。这些结果可以依次因下列作用中的一个或多个而产生存在于动物肠中的物质粘度下降；例如细胞壁上俘获的谷类营养物释放；动物和肠微生物菌群的内源性酶活性得到补充和改善(尤其是对幼小动物而言)。
在体外实验中，单胃中的人工胃和小肠已经表现出如实验部分中所述来源于橙色热子囊菌的内切葡聚糖酶能够降低腔内含物的粘度(富集β-葡聚糖的大麦磨碎部分)，由此促进营养物吸收。
在具体的实施方案中，重量增加至少为对照组(不添加酶)的101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％或至少为其110％。
在其它具体的实施方案中，与对照组(不添加酶)相比，饲料转化率至多为(或不超过)99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或至多为90％。
例如，本发明的组合物还可以在体外用于处理植物蛋白。本文所用的术语植物蛋白指的是任意化合物、包括至少一种来源于植物的蛋白质、包括修饰蛋白质和蛋白质衍生物组合物、制品或的混合物。在具体的实施方案中，植物蛋白的蛋白质含量至少为10％、20％、30％、40％、50％或60％(w/w)。
植物蛋白或蛋白质源的实例为谷类，诸如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻和高梁。其它实例为来自豆科和芸苔科的大豆粉、豌豆和菜子粉。
一般使植物蛋白或蛋白质源悬浮于溶剂、例如含水溶剂、诸如水中并调节pH和温度值以适合于所述酶的特征。持续进行酶反应至获得所需结果，此后可以通过使酶失活、例如通过加热处理步骤终止或不终止该反应。
在本发明另一个具体的处理方法实施方案中，使酶的作用持续发生，也就是说，例如将酶加入稻植物蛋白或蛋白质源中，而可以这么说，一旦适宜的反应条件建立或一旦任何酶抑制剂失活或无论是否已经将其它方式用于延缓酶作用发生，则其活性仍然可以持续至稍后需要时。
这些是本发明其它的具体实施方案组合物，包括i)至少一种具有木聚糖酶活性的多肽，该多肽为第11族糖苷水解酶；和ii)至少一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽，该多肽包括(a)与SEQ ID NO2的第1-335位或第31-335位氨基酸具有至少75％的同一性的氨基酸序列；和/或其中该多肽(b)由核酸序列编码，其中所述的核酸序列在低严格条件下与下列成分杂交(i)大肠埃希氏杆菌DSM 14541中含有的质粒的成熟内切葡聚糖酶编码部分、(ii)SEQ ID NO1的第1-1008或90-1008位核苷酸、(iii)(i)或(ii)至少100个核苷酸的亚序列或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链；(c)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的包括一种或多种氨基酸取代、缺失和/或插入的多肽变体；(d)(a)或(b)的等位变体；或(e)具有内切葡聚糖酶活性的(a)、(b)或(d)的片段；任意上述的组合物，其中i)具有内切葡聚糖酶活性的多肽为第5族糖苷水解酶；ii)具有内切葡聚糖酶或木聚糖酶活性的多肽类中的至少一种为热稳定的；iii)具有木聚糖酶活性的多肽来源于曲霉属、腐质霉属、噬热霉属或木霉属的菌株；iv)其中该组合物进一步包括至少一种具有内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性的多肽和/或至少一种具有蛋白酶活性的多肽和/或至少一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽；v)其中其它多肽类中的至少一种为热稳定的；vi)其中该组合物进一步包括(a)至少一种脂溶性维生素和/或(b)至少一种水溶性维生素和/或(c)至少一种微量矿物质和/或(d)至少一种常量元素；vii)其中该组合物为动物饲料添加剂；任意上述的组合物，进一步包括至少一种具有内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性的多肽和/或至少一种具有蛋白酶活性的多肽和/或至少一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽；所述的内切葡聚糖酶和/或所述的木聚糖酶和/或所述的内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶和/或所述的肌醇六磷酸酶和/或所述的蛋白酶优选为热稳定的或所述的木聚糖酶以及所述的内切葡聚糖酶和/或所述的内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶为热稳定的或所述的木聚糖酶、所述的肌醇六磷酸酶和所述的内切葡聚糖酶和/或所述的内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶为热稳定的。
组合物，包括(i)至少一种具有木聚糖酶活性的多肽和(ii)至少一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽，其中多肽类中的至少一种为热稳定的；和这类组合物的制备方法、它们在动物饲料中的应用、它们在处理植物蛋白中的应用和具有其内含物的动物饲料组合物。在具体的实施方案中，两种多肽均为热稳定的。在另一个优选的实施方案中，如果可能，该组合物中的其它多肽中的至少一种也为热稳定的(例如内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶、蛋白酶或肌醇六磷酸酶)。
任意上述组合物的制备方法，该方法包括混合具有内切葡聚糖酶和木聚糖酶活性的多肽类的步骤。
任意上述组合物在动物饲料中的应用、在制备动物饲料中的应用。
改善动物饲料营养价值的方法，其中向饲料中添加任意上述组合物。
具有50-800g/kg粗蛋白含量并包括任意上述组合物的动物饲料组合物，该饲料组合物优选包括小麦、大麦、燕麦或黑麦中的至少一种。
植物蛋白的处理方法，该方法包括向至少一种植物蛋白或蛋白质源中添加任意上述组合物的步骤，所述的植物蛋白源优选包括小麦、大麦、燕麦和/或黑麦。
实施例实施例1酶活性试验内切葡聚糖酶本试验主要用于检测醪液饲料或颗粒形式的动物饲料或粉末形式酶预混合物中的内切葡聚糖酶活性。为了检测作为预混合物的既未混合饲料成分、也未混合维生素和矿物质等的酶样品中的内切葡聚糖酶活性，适宜从标题″保温和沉淀″后开始。
试剂和溶液Azo-CM-纤维素溶液将0.4gAzo-CM-纤维素(Megazyme)悬浮于16ml软化水中并在沸腾水浴上剧烈搅拌5分钟，直到完全溶解。在冷却至室温后，加入1ml pH4.5的2M乙酸钠缓冲液，pH4.5(Megazyme)。用水将体积调节至20ml。将该溶液保持在5℃下。
提取缓冲液将5.44g乙酸钠-三水合物和6.24g正磷酸二氢钠溶于900ml蒸馏水并用1N HCl将pH调节至4.2。加入蒸馏水至1000ml。
沉淀溶液将40g乙酸钠三-水合物和4g乙酸锌溶于150ml软化水并用5N HCl将pH调节至5.0。加入软化水至200ml。将该溶液加入到800ml乙醇(95％v/v)中、混合并储存在室温下的密封瓶内。
试验步骤预混合物的预处理将10g预混合物加入到90g玉米粉中并充分混合。将10g该混合物加入到90g玉米粉中并充分混合。
样品制备和稀释将50.0g饲料(或如上所述进行预处理的预混合物)称入500ml锥形瓶并加入500ml提取缓冲液。搅拌45分钟。取出50ml样品以2000xg离心10分钟。将上清液用于下面的酶反应，根据需要用提取缓冲液稀释。
保温和沉淀保温温度为50℃。用移液管将0.1ml底物吸量入各小瓶并预保温5分钟，此后加入来自上述的0.1ml上清液。60分钟后，向各小瓶中加入0.6ml沉淀溶液并将小瓶内容物在涡旋混合器上剧烈混合。使样品在室温下稳定15分钟且然后再次混合并以3500rpm离心10分钟。
OD测定和活性计算立即用移液管将300微升来自上述的上清液吸量入微量滴定板并测定600nm处的吸收度。通过参照合适的标准曲线计算样品中内切葡聚糖酶的浓度。
木聚糖酶本试验主要用于检测醪液饲料或颗粒形式的动物饲料或粉末形式酶预混合物中的木聚糖酶活性。为了检测作为预混合物的既未混合饲料成分、也未混合维生素和矿物质等的酶样品中的木聚糖酶活性，适宜从标题″保温和沉淀″后开始。
试剂和溶液Azo-木聚糖将0.4g Azo-木聚糖(桦木(Birchwood)，Megazyme)悬浮于16ml软化水中并在沸腾水浴上剧烈搅拌5分钟，直到完全溶解。在冷却至室温后，加入1ml pH4.5的2M乙酸钠缓冲液(Megazyme)。加入软化水至20ml。储存在5℃下。
提取缓冲液将5.44g乙酸钠-三水合物和6.24g正磷酸二氢钠溶于900ml蒸馏水并用1N HCl将pH调节至4.2。加入蒸馏水至1000ml。
沉淀溶液将95％(v/v)实验级乙醇用作沉淀溶液。
试验步骤预混合物的预处理将10g预混合物加入到90g玉米粉中并充分混合。将10g该混合物加入到90g玉米粉中并充分混合。
样品制备和稀释将50.0g饲料(或如上所述进行预处理的预混合物)称入500ml锥形瓶并加入500ml提取缓冲液。搅拌45分钟。取出50ml样品以2000xg离心10分钟。将上清液用于下面的酶反应，根据需要用提取缓冲液稀释。
保温和沉淀保温温度为50℃。用移液管将0.125ml底物吸量入各小瓶并预保温5分钟，此后加入来自上述的0.1ml上清液。150分钟后，向各小瓶中加入0.64ml沉淀溶液并将小瓶内容物在涡旋混合器上剧烈混合。使样品在室温下稳定15分钟且然后再次混合并以3500rpm离心10分钟。
OD测定和活性计算立即用移液管将300微升来自上述的上清液吸量入微量滴定板并测定600nm处的吸收度。通过参照合适的标准曲线计算样品中木聚糖酶的浓度。
内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶本试验主要用于检测醪液饲料或颗粒形式的动物饲料或粉末形式酶预混合物中的内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶活性。为了检测作为预混合物的既未混合饲料成分、也未混合维生素和矿物质等的酶样品中的内切葡聚糖酶活性，适宜从标题″保温和沉淀″后开始。
试剂和溶液Azo-大麦β-葡聚糖溶液将1％Azo-大麦β-葡聚糖溶液(Megazyme)用作底物。
提取缓冲液将5.44g乙酸钠-三水合物和6.24g正磷酸二氢钠溶于900ml蒸馏水并用1N HCl将pH调节至4.2。加入蒸馏水至1000ml。
沉淀溶液将40g乙酸钠三-水合物和4g乙酸锌溶于150ml蒸馏水并用浓盐酸调节至pH5.0。加入软化水至200ml。将该溶液加入到800ml甲基溶纤剂(2-甲氧基乙醇)中、混合并储存在室温下。
试验步骤预混合物的预处理将10g预混合物加入到90g玉米粉中并充分混合。将10g该混合物加入到90g玉米粉中并充分混合。
样品制备和稀释将50.0g饲料(或如上所述进行预处理的预混合物)称入500ml锥形瓶并加入500ml提取缓冲液。搅拌45分钟。取出50ml样品以2000xg离心10分钟。将上清液用于下面的酶反应，根据需要用提取缓冲液稀释。
保温和沉淀保温温度为50℃。用移液管将0.1ml底物吸量入各小瓶并预保温5分钟，此后加入来自上述的0.1ml上清液。90分钟后，向各小瓶中加入0.5ml沉淀溶液并将小瓶内容物在涡旋混合器上剧烈混合。使样品在室温下稳定15分钟且然后再次混合并以3500rpm离心10分钟。
OD测定和活性计算立即用移液管将300微升来自上述的上清液吸量入微量滴定板并测定600nm处的吸收度。通过参照合适的标准曲线计算样品中内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶的浓度。
酶比活性为了测定酶比活性，如下计算酶蛋白质的浓度a)通过测定280nm处合并与分子量理论值和摩尔消光系数理论值的吸收度(两值均根据氨基酸序列测定)；或b)根据氨基酸分析。两种方法要求具有完整活性的酶样品高度纯化。
实施例2-5试剂、介质和设备试剂除非另有说明，所用的化学品均为至少为试剂级的商购产品。
来自Megazyme的AZCL-底物将天青蛋白交联的底物作为细粉提供，它不溶于缓冲溶液、但快速水合成易于和快速被相关酶水解的凝胶颗粒，从而释放可溶性染料标记的片段。
来自Megazyme的AZCL-大麦-β-葡聚糖AZCL-燕麦-德国小麦(Spelt)-木聚糖、AZCL-HE-纤维素、AZCL-马铃薯-半乳聚糖、AZCL-半乳甘露聚糖(carob)、AZCL-罗望子-木糖葡聚糖(Xyloglucan)、AZCL-脱支-阿拉伯聚糖IPTG(Promega，Cat.No.V3951)X-gal(Promega，Cat.No.V3941)LMP琼脂糖(Promega，Cat.No.V2111)介质缓冲系统(pH3-pH11)100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mMCHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％TritonX-100，用HCl或NaOH调节至pH-值2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或11.0(本文缩写为“琥珀酸缓冲系统”)。
WB(麸皮培养基)每一500ml摇瓶中有30g麸皮、45ml下列溶液4g酵母提取物1gKH2PO40.5g MgSO4·7H2O15g葡萄糖1000ml自来水在121℃下高压灭菌20分钟；高压灭菌后的pH为5.4。
CBH1培养基Avicel 25g (NH4)2SO41.4gKH2PO42g脲 0.3gCaCl2·2H2O0.3g MgSO4·7H2O 0.3gFeSO4·7H2O5mg MnSO4·H2O 1.6mg胨1g酵母提取物 10gTWEEN80 1ml 葡萄糖5gH2O 1000ml500ml锥形瓶中80ml，121℃下高压灭菌20分钟。
LB液体培养基向950ml去离子水中加入10g细菌胰胨、5g细菌-酵母提取物、10gNaCl。振摇至溶质溶解。用5N NaOH(～0.2ml)调节pH至7.0。用去离子水将该溶液的体积调节至1升。通过在15lb/sq.下的液体循环中高压灭菌20分钟进行灭菌。
含有氨苄西林/IPTG/X-Gal的LB平板将15g琼脂加入到1升LB培养基中。加入氨苄西林至终浓度为100μg/ml，然后用0.5mM IPTG和80ug/mlX-gal补充并倾倒平板。
1％LMP琼脂糖凝胶将1g LMP琼脂糖加入到100ml 1×TAE缓冲液中。
IPTG储备溶液(0.1M)将蒸馏水加入到1.2g IPTG中至终体积为50ml、无菌过滤并储存在4℃下。
设备、包括各种试剂盒Resource Q柱(Amersham Pharmacia，阴离子交换)Superdex75柱(Amersham Pharmacia 17-1047-01)IEF-凝胶(Amersham Pharmacia 80-1124-80)热混合器有效温度(Thermomixer comfort)(Eppendorf)Rneasy小试剂盒(QIAGEN，Cat.No.74904)包括衔接引物和AUAP的3′RACE试剂盒(GIBCO，Cat.No.18373-019)dNTP混合物(100mM，Promega，Cat.No.U1330)包括PCR缓冲液(200mM Tris-HCl(pH8.4)，500mMKCl)的TaqDNA聚合酶系统(Promega，Cat.No.M1661)PCR Preps DNA纯化系统(Promega，Cat.No.A7170)包括T4 DNA连接酶2X缓冲液的pGEM-T载体系统(Promega，Cat.No.A3600)JM109高效感受态细胞(Promega，Cat.No.L1001)小量制备DNA纯化系统(Promega，Cat.No.A7100)
BigDye终止子循环测序准备反应试剂盒(PE Applied Biosystems，Cat.No.4303149)ABI Prism 377 DNA测序仪(PE)包括截短的锚定引物的5′RACE系统(GIBCO，CAT.NO.18374-058)实施例2橙色热子囊菌CGMCC No.0670的培养在45℃下使橙色热子囊菌CGMCC No.0670在WB培养基(30g/500ml瓶)上生长4天。通过将约150ml无菌水加入到各摇瓶中并维持在4℃下至少4小时来进行酶提取。通过以7000rpm离心20分钟收集上清液。
实施例3橙色热子囊菌CGMCC No.670的内切葡聚糖酶的纯化用硫酸铵(80％饱和)沉淀来自实施例2的1500ml上清液并重新溶于100ml缓冲液、超滤且然后通过0.45m滤膜过滤。终体积为30ml。使该溶液上用25mM pH7.4的Tris-HCl缓冲液平衡的6ml Resource Q柱并用线性NaCl梯度(0-0.5M)洗脱蛋白质。使用如下试验在pH7.0和45℃下分析从柱上洗脱下的级分中的内切葡聚糖酶活性。收集具有内切葡聚糖酶活性的级分。然后对收集的溶液进行超滤并使浓缩溶液上用25mM pH7.4的Tris-HCl平衡的Superdex75柱。用相同缓冲液洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE分析含有内切葡聚糖酶的级分并收集纯级分。
内切葡聚糖酶试验底物AZCL-β-葡聚糖(大麦)温度根据需要，例如40℃、45℃或50℃pH根据需要，例如pH3或pH7试验缓冲液(除非另有说明)200mM琥珀酸缓冲液(pH3)200mM Tris-HCl缓冲液(pH7)将0.4％AZCL-β-葡聚糖悬浮于添加了0.01％Triton X-100的缓冲液中，同时缓慢搅拌。然后将限量的该混悬液和酶样品在微量滴定板或Eppendorf管中混合并置于冰上，此后进行反应(就底物和酶的用量而言，参见下面的结果部分)。通过将微量滴定板/Eppendorf管转入设定在试验温度的Eppendorf热混合器而启动试验。将所述平板/管在Eppendorf热混合器上保温15-30分钟，其振摇速率对微量滴定板而言为700rpm，而对Eppendorf管而言为1400rpm。通过将所述平板/管转回冰浴而终止保温。然后将所述管在冰预冷的离心机上离心几分钟并将100/200ml上清液转入微量滴定板。读取OD595作为内切葡聚糖酶活性测定值。将全部反应按一式三份进行且本试验中包括缓冲液空白(buffer blind)(不含酶)。
实施例4橙色热子囊菌CGMCC No.0670的内切葡聚糖酶CeI5A的表征从生长在WB培养基上的橙色热子囊菌CGMCC No.0670的培养物肉汤中纯化具有不同分布(pH、温度、分子量、底物特异性)的三种内切葡聚糖酶。
选择在相对宽范围的pH和温度内表现出内切葡聚糖酶活性的一种酶用于进一步研究。
将纯化的酶印迹在PVDF膜上并对N-末端进行测序。获得下列序列N-？LVFTSFGSNESGAEFGSQN。
同源性检索显示它是第5族糖苷水解酶。因此，命名为橙色热子囊菌的内切葡聚糖酶CeI5A。
内切葡聚糖酶CeI5A的分子量和pI测定通过SDS-PAGE和IEF凝胶验证纯化内切葡聚糖酶的纯度。该酶的分子量约为32KDa。用IEF凝胶对β-葡聚糖进行覆盖显示样品中仅存在一种pI约为3.5的β-葡聚糖酶活性。
45℃下内切葡聚糖酶CeI5A的pH-分布使溶于pH值在pH2.0-pH11.0的琥珀酸缓冲系统(参见上文的介质部分)的20ml酶样品和200ml 0.2％AZCL-β-葡聚糖在微量滴定板中混合并置于冰上，此后进行反应。通过将微量滴定板转入设定在45℃的试验温度的Eppendorf热混合器而启动试验。将所述平板在Eppendorf热混合器上以700rpm的振摇速率保温20分钟。通过将所述管转回冰浴而终止保温。然后将所述平板在冰预冷的离心机上离心几分钟并将100ml上清液转入微量滴定板。读取OD595作为β-葡聚糖酶活性测定值。将全部反应按一式三份进行且本试验中包括缓冲液空白(不含酶)。结果如下面的表1中所示。在pH2-7的pH范围内，该酶保留了至少50％的其最大活性。最佳pH约为pH2。
表1pH活性分布pH 活性 相对活性2 1,198 1,0003 1,150 0,9604 0,987 0,8245 0,839 0,7006 0,810 0,6767 0,631 0,5278 0,218 0,1829 0,135 0,11210 0,101 0,08411 0,063 0,05340℃下内切葡聚糖酶CeI5A的pH3稳定性使150ml酶样品和0,2M pH3的琥珀酸缓冲液在Eppendorf管中混合并在40℃下保温2小时。然后将100ml样品转入含有900ml 0.4％AZCL-β-葡聚糖的0.2M pH7的Tris-HCl缓冲液的溶液与0.1％Triton X100的新Eppendorf管并将其置于冰上，此后进行反应。通过将Eppendorf管转入设定在40℃的试验温度的Eppendorf热混合器而启动试验。将所述管在Eppendorf热混合器上以最高振摇速率(1400rpm)保温30分钟。通过将所述管转回冰浴而终止保温。然后将所述管在冰预冷的离心机上离心几分钟并将200ml上清液转入微量滴定板。读取OD595作为内切葡聚糖酶活性测定值。将全部反应按一式三份进行且本试验中包括缓冲液空白(不含酶)。对空白而言，将相同量的底物、缓冲液和酶混合，此后开始反应。结果如下面的表2中所示。看起来在40℃和pH 3下保温2小时后活性基本上没有丧失。
表2pH3稳定性处理活性 相对活性pH3保温 0,332 1,081无保温 0,307 1,000pH7下内切葡聚糖酶CeI5A的温度分布使溶于0.2M pH7的Tris-HCl缓冲液的200ml 0.4％AZCL-β-葡聚糖和30ml酶样品在Eppendorf管中混合并置于冰上，此后进行反应。通过将Eppendorf管转入设定在15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的试验温度的Eppendorf热混合器而启动试验。将所述管在Eppendorf热混合器上以最高振摇速率(1400rpm)保温30分钟。通过将所述管转回冰浴而终止保温。然后将所述管在冰预冷的离心机上离心几分钟并将200ml上清液转入微量滴定板。读取OD595作为内切葡聚糖酶活性测定值。将全部反应按一式三份进行且本试验中包括缓冲液空白(不含酶)。对空白而言，将相同量的底物、缓冲液和酶混合，此后开始反应。结果如下面的表3中所示，从其中看到在20-80℃的整个温度范围内该酶均具有活性。最佳温度约为70℃。在40℃和80℃下的相对活性分别为58％和37％(相当于70℃下的活性而言)。
表3温度活性分布温度(℃) 活性 相对活性14 0,463 0,18820 0,499 0,20230 0,832 0,33840 1,428 0,58050 1,992 0,80860 2,202 0,89470 2,464 1,00080 0,915 0,37150℃、60℃、70℃、85℃和pH7.4下内切葡聚糖酶CeI5A的热稳定性在50℃、60℃、70℃下将100ml酶样品(pH7.4)在Eppendorf热混合器上的Eppendorf管中经300rpm振摇保温10和20分钟。对在85℃下的稳定性而言，使用相同方法，但取样时间为0、2、5和10分钟。通过将所述管转回冰浴而终止保温。将未保温的样品用作对照品。将30ml上述保温的样品转入新微量滴定板并加入溶于0.2M pH7的Tris-HCl缓冲液的200ml0.4％AZCL-β-葡聚糖。通过将微量滴定板转入设定在40℃的试验温度的Eppendorf热混合器而启动试验。将所述平板在Eppendorf热混合器上以700rpm的振摇速率保温30分钟。通过将所述管转回冰浴而终止保温。然后将所述管在冰预冷的离心机上离心几分钟并将100ml上清液转入微量滴定板。读取OD595作为内切葡聚糖酶活性测定值。将全部反应按一式三份进行且本试验中包括缓冲液空白(不含酶)。结果如表4中(50-70℃)和表5(85℃)所示。看起来在50-70℃范围的温度下保温10-20分钟后，该酶完全保留了其活性。在85℃下保温10分钟后，看起来该酶也完全保留了其活性。
表450℃、60℃、70℃下的热稳定性
表585℃下的热稳定性
pH3和50℃下内切葡聚糖酶CeI5A对各种纤维素酶和半纤维素酶底物的底物特异性将溶于0.2M pH3的琥珀酸缓冲液的400ml 0.2％AZCL-底物(木聚糖、HE-纤维素、半乳聚糖、甘露聚糖、木糖葡聚糖、阿拉伯聚糖)与0.01％TritonX100和30ml酶样品(用0.2M琥珀酸缓冲液稀释5x)在Eppendorf管中混合并置于冰上，此后进行反应。通过将Eppendorf管转入设定在50℃的试验温度的Eppendorf热混合器而启动试验。将所述管在Eppendorf热混合器上以最高振摇速率(1400rpm)保温15分钟。通过将所述管转回冰浴而终止保温。然后将所述管在冰预冷的离心机上离心几分钟并将200ml上清液转入微量滴定板。读取OD595作为内切葡聚糖酶活性测定值。将全部反应按一式三份进行且本试验中包括缓冲液空白(不含酶)。从表6中所示的结果看出该酶可以降解β-葡聚糖和HE-纤维素，但它对木聚糖、阿拉伯聚糖、甘露聚糖、木糖葡聚糖没有或具有极低的活性。
表6底物特异性
实施例5编码橙色热子囊菌CGMCC No.0670的内切葡聚糖酶CeI5A的基因的克隆如下所述通过从橙色热子囊菌CGMCC 0670中进行RT-PCR克隆编码内切葡聚糖酶CeI5A的基因片段。
对cDNA克隆的序列分析显示该序列含有1005个核苷酸的编码区(SEQID NO1)。具有SEQ ID NO2的翻译产物为335个氨基酸长度。可以预计的是第1-30位氨基酸残基构建了信号肽部分，而第31-335位氨基酸残基构建了催化结构域。
菌丝体的培养和分离在45℃和165rpm下使橙色热子囊菌CGMCC 0670在CBH1培养基上生长3天。然后通过以7000rpm离心30分钟收集菌丝体。将收集的菌丝体储存在-80℃下，此后用于提取RNA。
总RNA的提取使用Rneasy小试剂盒从上述分离的100mg菌丝体中提取总RNA。
简并引物的设计基于测定的N-末端氨基酸序列N-？LVFTSFGSNESGAEFGSQN(SEQID NO3)设计简并引物。
15′AA(T/C)GA(A/G)TC(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAATT 3′(SEQ ID NO4)25′AA(T/C)GA(A/G)TC(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAGTT 3′(SEQ ID NO5)
35′AA(T/C)GA(A/G)AG(T/C)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAA TT3′(SEQ ID NO6)45′AA(T/C)GA(A/G)AG(T/C)GG(T/C/A/G)GC(T/C/A/G)GAG TT3′(SEQ ID NO7)内切葡聚糖酶3′末端的克隆将3′RACE试剂盒用于合成内切葡聚糖酶的cDNA。将约5mg的总RNA用作模板并将衔接引物(由3′RACE系统提供)用于合成cDNA的第一链。然后通过使用不同的简并引物扩增cDNA。PCR反应系统和条件如下10xPCR缓冲液 5μl25mM MgCl23μl10mM dNTP混合物 1μl3′引物(10μM)1μlAUAP(10μM，由3′RACE系统提供)1μlTaqDNA聚合酶(5u/μl，Promega) 0.5μlcDNA合成反应 2μl加入高压灭菌的蒸馏水至50μl条件94℃ 3分钟94℃ 40秒55℃ 40秒，30个循环72℃ 1分钟72℃ 10分钟使用引物2和引物3对PCR产物的凝胶分析得到约～1kb片段的特定带并从1％LMP琼脂糖凝胶上回收产物且通过在70℃下保温、随后使用PCR Preps DNA纯化系统进行纯化。通过用分光光度计测定A260和A280处的吸收度来确定纯化产物的浓度。然后使这些纯化片段与pGEM-T载体(Promega试剂盒，Cat.No.A3600)连接
T4 DNA连接酶2X缓冲液5μlpGEM-T载体(50ng) 1μlPCR产物50ngT4 DNA连接酶(3 Weiss单位/μl) 1μldH2O至终体积 10μl条件在4℃下将该反应体系保温过夜。
然后我们通过″热休克″法将转化的2-4μl连接产物转入50μl JM109高效感受态细胞中(J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniais(1989)Molecular Cloning1.74，1.84)。将转化培养物平板固定在含有氨苄西林/IPTG/X-Gal的LB平板上并将这些平板在37℃下保温过夜。通过指示平板上的颜色筛选和集落PCR筛选鉴定重组克隆。将阳性克隆接种入3ml LB液体培养基并在37℃和振摇(～250rpm)下保温过夜。通过以10,000xg离心5分钟使细胞沉降并通过使用Minipreps DNA纯化系统由细胞沉淀制备质粒样品。最终通过使用AB1377测序仪与BigDye终止子循环测序准备反应试剂盒对质粒进行测序。测序反应如下终止子制备反应混合物 8μl质粒DNA 1-1.5μl引物 3.2pmoldH2O至终体积 20μl测序结果显示使用引物2和引物3获得的PCR带相当于内切葡聚糖酶编码序列的3′末端。
内切葡聚糖酶5′末端的克隆我们基于3′-末端序列设计用于5′末端序列克隆的特异性引物。
5′-15′AAG ATG TAC TGG GAA GTG 3′(SEQ ID NO8)5′-25′TGG TTG AGA TTG AGG ACT AAG 3′(SEQ ID NO9)5′-35′GAT TAT AGA ATT GTA GTA TCT 3′(SEQ ID NO10)5′-45′AGA GCC GGT CAT TGA GTT G 3′(SEQ ID NO11)将5′RACE系统用于合成内切葡聚糖酶的5′末端片段。加入5mg总RNA和引物5′-1用于合成第一链。然后将其它引物用于第二链合成。dC-尾cDNA的PCR的系统和条件如下
10xPCR缓冲液(200mMTris-HCl(pH8.4)，500mMKCl)5μl25mM MgCl23μl10mM dNTP混合物 1μl5′引物(10μM) 2μl缩短的锚定引物(10μM，由3′RACE系统提供)2μlTaqDNA聚合酶(5u/μl)0.5μldC-尾cDNA 5μl加入高压灭菌的蒸馏水至 50μlPCR条件94℃ 2分钟94℃ 40秒53℃ 40秒，30个循环72℃ 1分钟72℃ 10分钟分别使用引物5′-2和5′-4、应用5′RACE系统得到相当于约700bp和400bp的两种特定带。纯化PCR-产物、连入pGEM-T-载体、转入JM109感受态细胞并测序。测序结果显示我们得到了BG025的5′末端片段。
全长内切葡聚糖酶基因的克隆按照上述3′和5′末端序列设计用于全长克隆的两种引物CDS-15′ATG AAG CTC GGC TCT CTC GT 3′(SEQ ID NO12)CDS-25′CTT GTC TCC TGT CTC GTT CAC 3′(SEQ ID NO13)将引物CDS-1和AUAP用于从cDNA扩增全长基因。使用下列PCR反应系统和条件10xPCR缓冲液 5μl25mM MgCl23μl10mM dNTP混合物1μl引物CDS-1(10μM) 1μlAUAP(10μM)1μlTaqDNA聚合酶(5u/μl) 0.5μlcDNA合成反应 2μl加入高压灭菌的蒸馏水至 50μl
条件95℃ 2分钟95℃ 40秒58℃ 40秒，30个循环72℃ 1.5分钟72℃ 10分钟由这种扩增得到具有约1.2kb大小的特定带并使用PCR Preps DNA纯化系统从凝胶上将其回收。然后将纯化的片段连入pGEM-T载体并转入感受态细胞(JM109)。通过集落PCR筛选阳性克隆并使用小量制备DNA纯化试剂盒从这些克隆中提取质粒。最终使用BigDye终止子循环测序准备反应试剂盒对质粒进行测序并获得全内切葡聚糖酶编码序列。
实施例6通过示差扫描量热法(DSC)对酶热稳定性的测定内切葡聚糖酶通过SDS-PAGE测定由实施例3得到的纯化内切葡聚糖酶的纯度为90％以上。将蛋白质浓度测定为1.9mg/ml(基于OD280和基于氨基酸序列计算的消光系数)。
为了测定内切葡聚糖酶的变性或解链温度(分别为Td或Tm)，将样品在4℃下对含有10mM磷酸钠、50mM氯化钠、pH7.0的缓冲液透析过夜。在20℃到95-100℃与1.5℃/分钟的温度梯度下的测微量热计(来自Microcal的VP-DSC)中对缓冲液测定透析的样品。将解链温度测定为所得热图上的峰顶值在约0.0011cal/deg下，Tm为77.5℃。
木聚糖酶使来源于细毛噬热霉(参见WO 96/23062的实施例1-3)的如通过SDS-PAGE测定的纯度在90％以上且蛋白质浓度为0.8mg/ml(基于OD280和基于氨基酸序列计算的消光系数)的木聚糖酶进行如上所述的步骤并将Tm测定为在约-0.0008cal/deg下，Tm为75.0℃。
实施例7酶组合物的制粒稳定性在本实施例中，将各种酶组合物加入到饲料中并在一般工业条件(75℃)和腐蚀性处理条件(85℃)下进行制粒实验。测定每种样品的回收率。温度(75℃、85℃)指的是在制粒机出口处的饲料样品温度。
饲料酶使形成酶组合物组成部分的下列酶进行制粒实验
制粒实验设备混合器TURBULA(实验室级，至多1-2kg)，FORBERG 60V(小规模混合器)；制粒机BUHLER DFPL，标称产量300kg/小时；干燥机带有多孔底的冷却箱；通风器。
饲料组成具有下列组成(％)的Broiler MaisF4玉米 57.30稻 3.10大豆50 28.60鱼粉 3.00大豆油 2.00淀粉 2.00磺化油 2.00矿物质预混合物BV 4245 2.00总计 100.00所用喷嘴大小，冲模mm75℃ 3×3085℃ 3×30
通过下列步骤制备添加剂预混合物在按照制造商的推荐提供与应用相关的酶剂量的稀释液中喷300g各液体酶样品，最多使用300g小麦中间产品(middlengs)作为载体并使用TURBULA混合器混合10分钟。然后标记添加剂预混合物并储存在冷却温度下至应用为止。
向FORBERG混合器中加入添加剂预混合物(600g)和饲料组分(29.4kg)并混合约2.5分钟。然后将醪液饲料(30kg)收集在纸袋(15kg×2)中、标记并储存在冷却温度下至应用为止。
将两种醪液饲料组合物中的每一种(15kg)加入到制粒机中以便在75℃或85℃下制粒。使其处于蒸汽环境(125-130℃，压力1.0-1.2巴)中约10秒且然后通过将其压紧的制粒室。随后将成粒的饲料转入通环境空气的干燥机中，直到达到环境温度(约6分钟)。使机器运转至生产水平约为35％，即约140kg/小时。通过改变达到在压力机出口测定的75℃或85℃的靶制粒温度的蒸汽添加量来控制条件和制粒温度。控制干燥步骤以便使所得水分低于13％。
混合后在混合器中取醪液饲料样品。就成粒的饲料而言，在产生全部批量饲料所需时间的约2/3后开始从产物中取样(在约5分钟内制成一批成粒饲料并在生产开始后约3分钟取约5kg样品)。将饲料倾倒在塑料衬垫上、分成四份并从板的中部取三份样品。将样品包装在纸袋中并标记。将样品在约4℃下避光储存至试验为止。
使用如下所述的试验测定醪液饲料和颗粒的酶活性。对每批样品而言，每次试验时间点取三份样品。将每份样品分析两次并分别计算6份所得醪液和成粒样品值的平均值。
酶活性的测定β-葡聚糖酶底物1％来自大麦的AZO-β-葡聚糖(Megazyme Cat.No.S-ABG 100)；保温温度50℃(β-葡聚糖酶B、C、D)或65℃(β-葡聚糖酶A)；pH5.00。提取/试验缓冲液用500ml缓冲液提取50g饲料样品，搅拌45分钟(含有0.02％Tween 20的150mM磷酸Na缓冲液，pH5.0)。试验0.2ml样品提取物，0.2ml 1％AZO-β-葡聚糖，混合并保温30-60分钟。通过添加1.2ml终止-试剂(40g乙酸Na、4g乙酸锌+150ml蒸馏水并用浓HCl将pH调节至pH5.0且将蒸馏水足量加至200ml。加入800ml 2-甲氧基乙醇)终止该反应。反应终止后，混合样品。在室温下15分钟后，将样品离心(3分钟15K rpm)并在590nm处测定。
木聚糖酶底物2％来自桦木(birchwood)的AZO-β-木聚糖(MegazymeCat.No.S-AXBP)；保温温度50℃(木聚糖酶B、C、D)或65℃(木聚糖酶A)；pH5.00。提取/试验缓冲液用500ml缓冲液提取50g饲料样品，搅拌45分钟(含有0.02％Tween 20的150mM磷酸Na缓冲液，pH5.0)。试验0.2ml样品提取物，0.2ml 1％AZO-木聚糖，混合并保温30-120分钟。通过添加1.2ml终止-试剂(95％乙醇)终止该反应。反应终止后，混合样品。在室温下15分钟后，将样品离心(3分钟15K rpm)并在590nm处测定。
半乳聚糖酶使用适合于每种酶的pH和温度将醪液和颗粒保温(8g/50ml)2小时(即对半乳聚糖酶A在55℃下用水提取，而对半乳聚糖酶B在40℃和pH4.4下用0.2M乙酸盐缓冲液提取)。将样品离心并使用商购试剂盒(Boehringer Mannheim乳糖/D-半乳糖试剂盒)测定释放的半乳糖的量。简单的说，在pH8.6和有β-半乳糖脱氢酶(Gal-DH)存在的情况下用烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+)将D-半乳糖氧化成D-半乳糖酸。经化学计算NADH的量与D-半乳糖的量成正比(1mol D-半乳糖产生1mol NADH)。根据340nm处的吸光度确定NADH的增加量。
肌醇六磷酸酶用FTU单位确定肌醇六磷酸酶活性，一个FTU单位为在下列条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸盐所需的酶量pH5.5；温度37℃；底物浓度为0.0050mol/l的肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)(FTU试验描述在WO 00/20569的实施例1中(饲料和预混合物中肌醇六磷酸酶活性的测定)。如WO 00/20569中所述提取饲料样品。
计算计算75℃和85℃下相对于醪液样品活性的成粒饲料中酶的回收％回收％＝100*饲料颗粒中的酶活性/醪液饲料中的酶活性结果结果如下面的表7中所示，得到了表示为平均值和标准偏差的颗粒中回收的活性单位(n＝3份取自每一制粒温度温度下的样品)和相对于醪液中活性单位的回收率(％)。
表775℃下制粒 85℃下制粒颗粒中 SD回收 颗粒中的 SD回收的活性*％**活性*％**β-葡聚糖酶活性β-葡聚糖酶A473 5 96 452 5 91β-葡聚糖酶B362 3 81 207 4 46β-葡聚糖酶C293 4 58 125 3 25β-葡聚糖酶D145 4 39 ～0 - 0木聚糖酶活性木聚糖酶A 475 12 92 441 21 85木聚糖酶B 248 33 75 224 14 68木聚糖酶C 259 4 59 663 15木聚糖酶D 231 4 86 804 30半乳聚糖酶活性半乳聚糖酶A 3.51 0.191 2.38 0.03 62半乳聚糖酶B 1.27 0.172 0.70 0.07 40肌醇六磷酸酶活性肌醇六磷酸酶A 1567 26 82 1479 33 77肌醇六磷酸酶B 1377 36 54 979 37 38*有关每种方法得到的活性单位数据**与相应醪液样品中的活性相比生物材料的保藏根据布达佩斯条约条款的规定将下列生物材料寄存在DSMZ(DSMZ-Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg1b，D-38124 Braunschweig，Germany)和CGMCC(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(the China General MicrobiologicalCulture Collection Center，Institute of Microbiology，)Chinese Academy ofSciences，Haidian，Beijing 100080，China)并给予如下保藏号
寄存物 保藏号 保藏日期大肠埃希氏杆菌 DSM 145412001-09-28橙色热子囊菌CGMCC No.06702001-12-27寄存物分别由Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880，Denmark和Novozymes(China)Investment Co.Ltd.，22 Xinxi Zhong Lu，Shangdi zone，Haidian District，Beijing 100080，P.R.China制备且寄存者许可申请人接触该材料并按照R.28 EPC的规定要求寄存者给予寄存的材料为公众可得到的毫无保留的和不能变更的许可。大肠埃希氏杆菌菌株含有包含橙色热子囊菌DSM14541的内切葡聚糖酶CeI5A的核酸序列(即编码SEQ ID NO2的SEQ ID NO1)的质粒。
在确保本专利申请在由给予名称为37 C.F.R.ξ1.14和35 U.S.C.ξ122的专利和商标局官员确定的待审期间可以接触所述培养物的条件下寄存这些菌株。这些寄存物代表基本上纯的寄存菌株培养物。如提交本申请副本或其后续专利申请的国家中外国专利法律需要可以得到这些寄存物。不过，应理解寄存物的可获得性并不构成可以废除由政府行为授予的专利权而实施本发明的许可。
于1998年7月21日在中国云南西双版纳的土壤样品中分离了橙色热子囊菌菌株CGMCC 0670。
本文所述和要求保护的本发明并不限于本文公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案用于解释本发明的几个方面。任何等同实施方案均属于本发明的范围。实际上，本领域技术人员显然可以从上述描述中得出包括本文所述和所述实施方案在内的对本发明的各种修改的实施方案。这类修改也属于待批权利要求的范围。如果出现相矛盾的情况，那么由本说明书、包括定义来解释。
本文引述了各种参考文献，将它们的全部内容引入作为参考。
序列表<110>诺维信公司(Novozymes A/S)<120>热稳定酶组合物<130>10254<160>16<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1008<212>DNA<213>橙色热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(90)<400>1atgaagctcg gctctctcgt gctcgctctc agcgcagcta ggcttacact gtcggcccct 60ctcgcagaca gaaagcagga gaccaagcgt gcgaaagtat tccaatggtt cggttcgaac120gagtccggtg ctgaattcgg aagccagaac cttccaggag tcgagggaaa ggattatata180tggcctgatc ccaacaccat tgacacattg atcagcaagg ggatgaacat ctttcgtgtc240ccctttatga tggagagatt ggttcccaac tcaatgaccg gctctccgga tccgaactac300ctggcagatc tcatagcgac tgtaaatgca atcacccaga aaggtgccta cgccgtcgtc360gatcctcata actacggcag atactacaat tctataatct cgagcccttc cgatttccag420accttctgga aaacggtcgc ctcacagttt gcttcgaatc cactggtcat cttcgacact480aataacgaat accacgatat ggaccagacc ttagtcctca atctcaacca ggccgctatc540gacggcatcc gttccgccgg agccacttcc cagtacatct ttgtcgaggg caattcgtgg600accggggcat ggacctggac gaacgtgaac gataacatga aaagcctgac cgacccatct660gacaagatca tatacgagat gcaccagtac ctggactctg acggatccgg gacatcagcg720acctgcgtat cttcgaccat cggtcaagag cgaatcacca gcgcaacgca gtggctcagg780gccaacggga agaagggcat catcggcgag tttgcgggcg gagccaacga cgtctgcgag840acggccatca cgggcatgct ggactacatg gcccagaaca cagacgtctg gactggcgcc900atctggtggg cggccgggcc gtggtgggga gactacatat tctccatgga gccggacaat960ggcatcgcgt atcagcagat acttcctatt ttgactccgt atctttga1008<210>2
<211>335<212>PRT<213>橙色热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(30)<400>2Met Lys Leu Gly Ser Leu Val Leu Ala Leu Ser Ala Ala Arg Leu Thr1 5 10 15Leu Ser Ala Pro Leu Ala Asp Arg Lys Gln Glu Thr Lys Arg Ala Lys20 25 30Val Phe Gln Trp Phe Gly Ser Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser35 40 45Gln Asn Leu Pro Gly Val Glu Gly Lys Asp Tyr Ile Trp Pro Asp Pro50 55 60Asn Thr Ile Asp Thr Leu Ile Ser Lys Gly Met Asn Ile Phe Arg Val65 70 75 80Pro Phe Met Met Glu Arg Leu Val Pro Asn Ser Met Thr Gly Ser Pro85 90 95Asp Pro Asn Tyr Leu Ala Asp Leu Ile Ala Thr Val Asn Ala Ile Thr100 105 110Gln Lys Gly Ala Tyr Ala Val Val Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr115 120 125Tyr Asn Ser Ile Ile Ser Ser Pro Ser Asp Phe Gln Thr Phe Trp Lys130 135 140Thr Val Ala Ser Gln Phe Ala Ser Asn Pro Leu Val Ile Phe Asp Thr145 150 155 160Asn Asn Glu Tyr His Asp Met Asp Gln Thr Leu Val Leu Asn Leu Asn165 170 175Gln Ala Ala Ile Asp Gly Ile Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr180 185 190Ile Phe Val Glu Gly Asn Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Asn195 200 205Val Asn Asp Asn Met Lys Ser Leu Thr Asp Pro Ser Asp Lys Ile Ile210 215 220Tyr Glu Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Ala225 230 235 240Thr Cys Val Ser Ser Thr Ile Gly Gln Glu Arg Ile Thr Ser Ala Thr245 250 255
Gln Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Lys Gly Ile Ile Gly Glu Phe Ala260 265 270Gly Gly Ala Asn Asp Val Cys Glu Thr Ala Ile Thr Gly Met Leu Asp275 280 285Tyr Met Ala Gln Asn Thr Asp Val Trp Thr Gly Ala Ile Trp Trp Ala290 295 300Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Ile Phe Ser Met Glu Pro Asp Asn305 310 315 320Gly Ile Ala Tyr Gln Gln Ile Leu Pro Ile Leu Thr Pro Tyr Leu325 330 335<210>3<211>21<212>PRT<213>橙色热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>N-末端肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>位点2的Xaa表示任何氨基酸<400>3Asn Xaa Leu Val Phe Thr Ser Phe Gly Ser Asn Glu Ser Gly Ala Glu1 5 10 15Phe Gly Ser Gln Asn20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<223>K表示T或CM表示A或GN表示T或C或A或G<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)
<223>n是a，c，g，或t<220>
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<213>人工的<220>
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<223>引物<400>10gattatagaa ttgtagtatc t 21<210>11<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
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<210>13<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>13cttgtctcct gtctcgttca c 21<210>14<211>225<212>PRT<213>Thermomyces lanuginosus<220>
<221>mat_peptide<222>(31)..(225)<400>14Met Val Gly Phe Thr Pro Val Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Gly-30 -25 -20 -15Ala Leu Ala Phe Pro Ala Gly Asn Ala Thr Glu Leu Glu Lys Arg Gln-10 -5 -1 1Thr Thr Pro Asn Ser Glu Gly Trp His Asp Gly Tyr Tyr Tyr Ser Trp5 10 15Trp Ser Asp Gly Gly Ala Gln Ala Thr Tyr Thr Asn Leu Glu Gly Gly20 25 30Thr Tyr Glu Ile Ser Trp Gly Asp Gly Gly Asn Leu Val Gly Gly Lys35 40 45 50Gly Trp Asn Pro Gly Leu Asn Ala Arg Ala Ile His Phe Glu Gly Val55 60 65Tyr Gln Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Arg70 75 80Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr Asp85 90 95Pro Ser Ser Gly Ala Thr Asp Leu Gly Thr Val Glu Cys Asp Gly Ser100 105 110
Ile Tyr Arg Leu Gly Lys Thr Thr Arg Val Asn Ala Pro Ser Ile Asp115 120 125 130Gly Thr Gln Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Asp Lys Arg135 140 145Thr Ser Gly Thr Val Gln Thr Gly Cys His Phe Asp Ala Trp Ala Arg150 155 160Ala Gly Leu Asn Val Asn Gly Asp His Tyr Tyr Gln Ile Val Ala Thr165 170 175Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Tyr Ala Arg Ile Thr Val Ala Asp Val180 185 190Gly195<210>15<211>439<212>PRT<213>Peniophora lycii<220>
<221>mat_peptide<222>(31)..(439)<400>15Met Val Ser Ser Ala Pro Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu Met Ser-30 -25 -20 -15Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gly Pro Ser Pro Val Ala Ala Gly Leu Pro-10 -5 -1 1Ile Pro Ala Gly Ala Thr Ser Ala Thr Gly Pro Thr Ala Pro Pro Pro5 10 15Pro Val Gly Pro Thr Ala Ala Pro Pro Gly Gly Cys Thr Val Thr Gly20 25 30Val Ala Leu Ile Gly Ala His Gly Ala Ala Thr Pro Thr Ser Gly Ala35 40 45 50
Ala Ser Ala Gly Val Ala Ala Val Ala Leu Ile Gly Met Ala Ala Pro55 60 65Pro Thr Ala Pro Leu Thr Gly Pro Leu Ala Ala Pro Val Thr Leu Pro70 75 80Gly Val Ala Ala Leu Leu Pro Pro Gly Ala Ala Gly Ser His Gly Thr85 90 95Gly Thr Ala Met Thr Thr Ala Thr Ser Thr Leu Pro Gly Gly Gly Ala100 105 110Val Pro Pro Val Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Val Val Ala Ser Ser115 120 125 130Thr Ala Thr Thr Ala Gly Pro Gly Ala Ala Ser Gly Gly Thr Val Leu135 140 145Pro Thr Leu Gly Val Val Leu Gly Gly Gly Gly Ala Cys Thr Leu Cys150 155 160Ala Ala Met Cys Pro Ala Gly Val Ala Gly Ala Gly Ser Thr Thr Thr165 170 175Leu Gly Val Pro Ala Pro Ala Ile Thr Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala180 185 190Pro Ser Ala Ala Leu Ser Ala Ser Ala Ala Leu Thr Leu Met Ala Met195 200 205 210Cys Pro Pro Ala Thr Leu Ser Ser Gly Ala Ala Ser Pro Pro Cys Ala215 220 225Leu Pro Thr Ala Gly Gly Thr Val Ser Thr Gly Thr Thr Thr Ala Leu230 235 240Ala Leu Thr Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ala Leu Gly Pro Val Gly245 250 255Gly Val Gly Thr Val Ala Gly Leu Leu Ala Ala Leu Thr Gly Gly Ala260 265 270Val Ala Ala Gly Thr Gly Thr Ala Ala Thr Leu Ala Ser Ala Pro Ala275 280 285 290
Thr Pro Pro Leu Ala Ala Thr Pro Thr Ala Ala Pro Ser His Ala Ala295 300 305Thr Met Val Pro Ile Pro Ala Ala Leu Gly Leu Pro Ala Ala Thr Ala310 315 320Leu Ala Pro Leu Leu Pro Ala Gly Ala Ala Leu Thr Val Ala Ser Leu325 330 335Leu Val Pro Pro Ser Gly His Met Thr Val Gly Leu Leu Ala Cys Ser340 345 350Gly Leu Gly Ala Val Ala Val Leu Val Ala Ala Ala Val Gly Pro Leu355 360 365 370Gly Pro Cys Gly Gly Val Ala Gly Val Cys Gly Leu Ser Ala Pro Val375 380 385Gly Ser Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Pro Ala Leu390 395 400Cys Gly Pro Val Pro Ser Gly405<210>16<211>332<212>PRT<213>Myceliophthora thermophila<220>
<221>mat_peptide<222>(1)..()<400>16Ala Leu Thr Tyr Arg Gly Val Asp Trp Ser Ser Val Val Val Glu Glu1 5 10 15Arg Ala Gly Val Ser Tyr Lys Asn Thr Asn Gly Asn Ala Gln Pro Leu20 25 30Glu Asn Ile Leu Ala Ala Asn Gly Val Asn Thr Val Arg Gln Arg Val35 40 45
Trp Val Asn Pro Ala Asp Gly Asn Tyr Asn Leu Asp Tyr Asn Ile Ala50 55 60Ile Ala Lys Arg Ala Lys Ala Ala Gly Leu Gly Val Tyr Ile Asp Phe65 70 75 80His Tyr Ser Asp Thr Trp Ala Asp Pro Ala His Gln Thr Met Pro Ala85 90 95Gly Trp Pro Ser Asp Ile Asp Asn Leu Ser Trp Lys Leu Tyr Asn Tyr100 105 110Thr Leu Asp Ala Ala Asn Lys Leu Gln Asn Ala Gly Ile Gln Pro Thr115 120 125Ile Val Ser Ile Gly Asn Glu Ile Arg Ala Gly Leu Leu Trp Pro Thr130 135 140Gly Arg Thr Glu Asn Trp Ala Asn Ile Ala Arg Leu Leu His Ser Ala145 150 155 160Ala Trp Gly Ile Lys Asp Ser Ser Leu Ser Pro Lys Pro Lys Ile Met165 170 175Ile His Leu Asp Asn Gly Trp Asp Trp Gly Thr Gln Asn Trp Trp Tyr180 185 190Thr Asn Val Leu Lys Gln Gly Thr Leu Glu Leu Ser Asp Phe Asp Met195 200 205Met Gly Val Ser Phe Tyr Pro Phe Tyr Ser Ser Ser Ala Thr Leu Ser210 215 220Ala Leu Lys Ser Ser Leu Asp Asn Met Ala Lys Thr Trp Asn Lys Glu225 230 235 240Ile Ala Val Val Glu Thr Asn Trp Pro Ile Ser Cys Pro Asn Pro Arg245 250 255Tyr Ser Phe Pro Ser Asp Val Lys Asn Ile Pro Phe Ser Pro Glu Gly260 265 270Gln Thr Thr Phe Ile Thr Asn Val Ala Asn Ile Val Ser Ser Val Ser275 280 285
Arg Gly Val Gly Leu Phe Tyr Trp Glu Pro Ala Trp Ile His Asn Ala290 295 300Asn Leu Gly Ser Ser Cys Ala Asp Asn Thr Met Phe Ser Gln Ser Gly305 310 315 320Gln Ala Leu Ser Ser Leu Ser Val Phe Gln Arg Ile325 330
权利要求
1.组合物，包括至少两种选自内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶组成的组的热稳定酶，其中正如在5.0-7.0区间的pH下通过示差扫描量热法所测定的，所述热稳定酶中的每一种具有的解链温度Tm至少为70℃。
2.权利要求1所述的组合物，包括下列热稳定酶(i)内切葡聚糖酶和木聚糖酶；(ii)内切葡聚糖酶和蛋白酶；(iii)内切葡聚糖酶、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；(iv)内切葡聚糖酶、木聚糖酶和蛋白酶；(v)内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和蛋白酶；(vi)木聚糖酶和肌醇六磷酸酶；(vii)木聚糖酶和蛋白酶；(viii)肌醇六磷酸酶和蛋白酶；(ix)肌醇六磷酸酶、蛋白酶和半乳聚糖酶；(x)木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和蛋白酶；(xi)木聚糖酶、蛋白酶和半乳聚糖酶；(xii)肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶；(xiii)半乳聚糖酶和蛋白酶；(xiv)肌醇六磷酸酶、半乳聚糖酶和α-半乳糖苷酶；(xv)肌醇六磷酸酶和α-半乳糖苷酶；(xvi)蛋白酶和α-半乳糖苷酶；(xvii)半乳聚糖酶和α-半乳糖苷酶；(xviii)半乳聚糖酶、蛋白酶和α-半乳糖苷酶；或(xix)内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶和半乳聚糖酶中的至少两种。
3.权利要求1-2中任意一项所述的组合物，包括(i)至少一种具有木聚糖酶活性的多肽，该多肽属于第11族糖苷水解酶；和(ii)至少一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽，该多肽包括(a)与SEQ ID NO2的第1-335或第31-335位氨基酸具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或其中所述多肽是(b)由在低严格条件下与如下成分杂交的核酸序列编码(i)大肠埃希氏杆菌DSM 14541中含有的质粒的成熟内切葡聚糖酶的编码部分；(ii)SEQ ID NO1的第1-1008或第90-1008位核苷酸；(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的亚序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链；(c)具有包括一种或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽变体；(d)(a)或(b)的等位变体；或(e)具有内切葡聚糖酶活性的(a)、(b)或(d)的片段。
4.权利要求3所述的组合物，其中(i)所述的内切葡聚糖酶和所述的木聚糖酶是热稳定的；(ii)具有内切葡聚糖酶活性的多肽是第5族糖苷水解酶；和/或(iii)具有木聚糖酶活性的多肽来源于曲霉属、芽孢杆菌属、腐质霉属、噬热霉属或木霉属的菌株。
5.权利要求1-4中任意一项所述的组合物，进一步包括(a)至少一种脂溶性维生素；和/或(b)至少一种水溶性维生素；和/或(c)至少一种痕量矿物质。
6.权利要求1-5中任意一项所述的组合物，其为动物饲料添加剂。
7.权利要求1-6中任意一项的组合物的制备方法，该方法包括混合所述酶的步骤。
8.权利要求1-6中任意一项的组合物在动物饲料或在制备动物饲料中的应用。
9.改善动物饲料营养价值的方法，其中向饲料中添加权利要求1-6中任意一项所述的组合物。
10.动物饲料组合物，具有50-800g/kg的粗蛋白含量且包括权利要求1-6中任意一项所述的组合物。
11.权利要求10所述的动物饲料，包括大豆、小麦、大麦、燕麦或黑麦中的至少一种。
12.植物蛋白的处理方法，该方法包括向至少一种植物蛋白或蛋白源中添加权利要求1-6中任意一项所述的组合物的步骤。
13.权利要求12所述的方法，其中在至少一种植物蛋白源中包括大豆、小麦、大麦、燕麦和/或黑麦。
全文摘要
本发明涉及包括至少两种选自内切葡聚糖酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α－半乳糖苷酶组成的组的热稳定酶的组合物。这些热稳定酶具有的解链温度Tm至少为70℃。优选的组合物包括第11族糖苷水解酶家中的木聚糖酶和与来源于橙色热子囊菌的热稳定糖苷水解酶家第5族的内切葡聚糖酶同源的内切葡聚糖酶。优选的木聚糖酶来源于曲霉属、芽孢杆菌属、腐质霉属、噬热霉属和木霉属。该组合物特别用于动物饲料目的。可选的其它成分为维生素、矿物质和抗微生物肽类。
文档编号C12N9/42GK1622761SQ03802765
公开日2005年6月1日 申请日期2003年1月23日 优先权日2002年1月25日
发明者吴文平, 丹·彼得森, 克劳斯·C·富格尔桑 申请人:Dsm Ip资产公司