一种提取侧柏叶中黄酮类物质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种黄酮类物质的提取方法，具体涉及一种从侧柏叶中提取黄酮类物 质的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于自由基生命科学的进展，使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的 黄酮类物质受到空前的重视。其抗氧化作用比VE强50倍，比VC强20倍，而且能通过血脑 屏障到达脑部，防治中枢神经系统的疾病，尤其对皮肤的保养、年轻化及血管抗炎作用特别 显著。目前，从银杏叶、紫苏叶、龙柏叶、槐花、香椿嫩叶中提取黄酮类化合物报道较多。但 是从侧柏叶中提取黄酮类物质并不多见。
[0003] 侧柏叶是侧柏的干燥嫩枝梢及叶，含有类黄酮、鞣质、精油等多种天然活性成分， 具有凉血止血、化痰止咳、祛风降湿、生发乌发、消肿散毒的功效，侧柏叶中黄酮类物质是其 最重要的成分之一。因而，侧柏叶中黄酮类化合物的提取对于食品科学和医学的发展有很 重要的影响。
[0004] 目前应用于侧柏叶黄酮类物质的提取方法主要有：有机溶剂萃取法、酶提取法、超 声提取法、微波提取法。其中，有机溶剂提取法是国内外采用的最为广泛的方法，但这种方 法周期长、步骤多、产率低，且产品中会有有机溶剂的残留，对提取后产品质量有影响；酶提 取法必须要保持最佳温度、最佳pH值，对整个反应的条件控制要求比较高；超声波提取技 术大大的提高了提取效率、缩短了提取时间、节约溶剂，并且免去了高温对提取成分的破 坏，但大量提取时效率低；微波提取法，具有快速、溶剂用量少、提取率高、成本低和质量好 等许多优点，但其成品的组成不是非常稳定；显而易见，无论是何种提取技术都有自身的不 足和局限性，而本项发明采用冻融与超声波技术联合提取，冻融技术的特点是：细胞可在形 成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎，使黄酮类物质得以充分释放，并且 还保持活性。该技术是一种高效、环保的提取方法。目前还未见应用冻融技术提取侧柏叶 黄酮类物质的报道。实验证明采用冻融与超声波技术联合提取高效且环保。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对上述黄酮类物质的提取方法的不足之处，本发明提供了一种高效、 环保的提取方法。
[0006] 技术方案：本方法按以下步骤进行：
[0007] ⑴将侧柏叶洗净、烘干、粉碎，过40目筛，得到侧柏叶粉，然后加入水，均匀混合； 所加入的水与侧柏叶的质量比约为5 :1。
[0008] (2)将步骤（1)得到的混合液在-40?-20°c的温度下冰冻10?24小时，室温下 放置直至其融化；重复冰冻-融化步骤2?3次；如此，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液 盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。使黄酮类物质得以充分释放，并且还保持活性。
[0009] (3)向步骤（2)所得混合液中加入乙醇充分混匀，乙醇与混合液的体积比约为1 : 1，浸泡1?3h后，进行超声波提取，超声功率为60?100W;超声温度为40?80°C;超声时 间为20?60min;超声的空化作用对细胞膜的破坏有助于黄酮类化合物的释放与溶出，超 声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散。因此，超声波法大大缩短了提取时间，提高了有 效成分的提出率，原料的利用率。超声结束后进行离心分离，取上清液，冻干，得到粗品。
[0010] ⑷将粗品配制成浓度为1?3mg/mL的溶液，滴加到大孔树脂柱中进行饱和吸附， 吸附后用水洗脱除去杂质，再用60?80%乙醇作为洗脱剂，对洗脱剂进行回收溶剂和浓缩 处理，最后进行冻干，即得到黄酮类物质。所述的大孔树脂为D-101、AB-8或DM-130。所述 溶液的滴加量为柱体积的1. 5倍；水及乙醇的用量为柱体积的5倍。
[0011] 更进一步的，我们发现，如果在步骤（2)结束后，将所得混合液再次冰冻，然后置 于超声环境下融解，超声功率为60?100W;超声时间为60?90min，由于超声波的热效应 使水温增高，对原料有水浴作用，温度自然升高至35?40°C，不仅使得混合液快速融化，而 且可以促进黄酮类化合物的释放与溶出。在超声环境下融解后，在进行步骤（3)、（4)，此方 法所得到的产物提取率大大提高，测定侧柏叶黄酮类物质提取率最高达到18. 2%。
[0012] 有益效果：本发明具有以下特点：整体工艺设计简单合理，创造性的结合了多种 技术，弥补了单一技术的不足，大大提高了黄酮类物质的提取率；由于侧柏叶的特殊性，本 发明提取过程中，保持了相对较低的温度，很好的保持了侧柏叶黄酮类物质的活性，使得产 品非常稳定；本发明溶剂用量小且易于回收，节约成本；提取过程中仅使用了水和乙醇两 种溶剂，并没有引入氯仿、乙酸乙酯等其它溶剂，对环境无污染；这些特点都极大程度上符 合了工业化生产的要求。
【具体实施方式】：
[0013] 以下通过具体的实施例对本发明进一步说明：
[0014] 实施例1
[0015] 取新鲜的侧柏叶，称重、洗净，自然阴干后于烘箱中60°C烘干作为原料；粉碎至40 目，得到侧柏叶粉；准确称量20g侧柏叶粉，加入100mL水，制成侧柏叶混合液；将侧柏叶混 合液在-20°C下进行冰冻，24h后取出室温融化，如此反复三次；加入无水乙醇100mL，充分 混匀，浸泡2h后，进行超声波提取：超声功率60W;超声时间20min;超声温度40°C;离心分 离，取上清液。将上清液放置于冻干机中进行冻干处理，得到粗品；将粗品准确配制浓度为 lmg/mL的溶液，滴加到AB-8大孔树脂柱中进行饱和吸附，最大上样量为1. 5倍柱体积，先用 5倍柱体积的水洗脱除去杂质，再用5倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液、浓缩、冻干， 得侧柏叶黄酮类物质样品2. 42g。
[0016]测定：采用紫外分光光度法，以芦丁作为标准对照品，绘制芦丁标准曲线，测定侧 柏叶黄酮类物质的含量。
[0017] (1)标准曲线的绘制
[0018] 准确称取芦丁标准品1.Omg，用浓度为50%的乙醇定容至25.OmL。
[0019] 准确吸取芦丁标准品（48yg/mL)0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5.OmL于 6 支比色管中， 分别用50 %的乙醇至5.OmL，0. 1M三氯化铝溶液3.OmL和1M醋酸钾溶液5.OmL，摇匀，同法 制成空白对照；放置40min，待反应完全，于415nm波长处测定吸光度值。以芦丁标准品浓 度（C)为横坐标，吸光度（A)为纵坐标绘制标准曲线。
[0020] (2)侦啪叶黄酮类物质提取率的测定
[0021] 提取率Y%=m/n^XlOO%
[0022] 式中：得到侧柏叶黄酮类物质样品的质量（g);
[0023] 1112为使用侧柏叶粉的质量（g)。
[0024] (3)侧柏叶提取物中黄酮类物质含量的测定
[0025] 称取5mg提取物置于25mL容量瓶中，按上述芦丁标准曲线绘制方法配制溶液，并 测其吸光度。通过标准曲线计算提取物中的黄酮类物质含量。
[0026]含量P%=CVDXl(r3/mX100%
[0027] 式中：C为由标准曲线计算得出的待测试液的黄酮类物质浓度（mg/mL);
[0028] V为待测样品溶液总体积（mL);
[0029] D为待测试液的稀释倍数；
[0030] m为称取的提取物质量（mg