一种定量分析烟草花瓣中14种类黄酮物质的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析检测技术领域，具体设及一种定量分析烟草花瓣中14种类黄酬 物质的检测方法。
【背景技术】
[0002] 类黄酬物质（flavonoids)是指两个苯环通过中央=碳原子相互连接的一系列化 合物，它们广泛分布于植物界，是植物重要的次生代谢产物。类黄酬物质已在很多植物体 中被证明与植物的抗虫和抗病相关。同时，黄酬类化合物是一类生物活性很强的化合物，是 一种天然的抗氧化剂，在医药、食品等领域具有广泛的应用。例如，搬皮素-3-0-芸香糖巧 (芸香巧，维生素P)是临床上用于防治脑溢血、高血压、视网膜出血、紫癒和急性出血性肾炎 等疾病的重要药物。
[0003] 烟草花瓣中含有丰富的类黄酬物质，但目前人们对烟草花瓣中类黄酬物质的研究 和利用的报道较少。随着人们对烟草中类黄酬物质关注的增加，建立一种类黄酬物质全面 定量分析方法变得十分必要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种定量分析烟草花瓣中14种类黄酬物质的检测方法。
[0005] 本发明的目的是该样实现的，包括样品前处理、供试品溶液的制备、对照品溶液的 制备和测定步骤，具体包括： A、 样品前处理；将待检样品烟草花瓣研磨、冷冻干燥后置于1~4 °C保存备用； B、 供试品溶液的制备；准确称取10.Omg的前处理后的样品，加入1ml的甲醇-氯仿-水 提取溶液和200y1的内标溶液，内标溶液为黄豆巧元、染料木巧和澄皮巧的水溶液，浓度 为1. 0yg/mU经超声处理、离屯、后取上清液作为供试品溶液； C、 对照品溶液的制备；分别精密称定各标准化合物，即14个标准样品和3个内标物黄 豆巧元、染料木巧和澄皮巧，加甲醇制成每1ml含Img的溶液，得到Img/ml的类黄酬单标 溶液，分别移取100y1Img/ml的低浓度类黄酬单标溶液W及lOmg/ml的高浓度类黄酬单 标溶液于100ml容量瓶中，W样品提取溶液，即甲醇-氯仿-水提取溶液定容制备得到标 准混合溶液，W样品提取溶液逐级稀释标准混合溶液，制成低浓度类黄酬物质浓度为1000、 600、400、100、60、40、10、6、4、1ng/mU体积为1mL的标准溶液梯度；此梯度对应的高浓度 标准溶液梯度为100、60、40、10、6、4、1、0. 6、0. 4、0. 1yg/mL;在上述所有浓度梯度的溶液 中加入200y1的内标溶液得到对照品溶液，内标溶液为黄豆巧元、染料木巧和澄皮巧的水 溶液，浓度为1. 0yg/血； D、 测定；经色谱质谱分析，W待测14个类黄酬化合物的含量为横坐标，W其对应的色 谱峰面积与内标化合物的色谱峰面积的比值为纵坐标，建立工作曲线，对校正数据进行线 性回归，求得类黄酬物质的回归方程，试样中类黄酬物质的含量按下式进行计算：
【主权项】
1. 一种定量分析烟草花瓣中14种类黄酮物质的检测方法，其特征在于包括样品前处 理、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和测定步骤，具体包括： A、 样品前处理：将待检样品烟草花瓣研磨、冷冻干燥后置于1~4°C保存备用； B、 供试品溶液的制备：准确称取10.0 mg的前处理后的样品，加入1ml的甲醇-氯仿-水 提取溶液和200 μ 1的内标溶液，内标溶液为黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水溶液，浓度 为I. 0 μ g/mL，经超声处理、离心后取上清液作为供试品溶液； C、 对照品溶液的制备：分别精密称定各标准化合物，即14个标准样品和3个内标物黄 豆苷元、染料木苷和橙皮苷，加甲醇制成每1ml含Img的溶液，得到lmg/ml的类黄酮单标 溶液，分别移取100 μ I lmg/ml的低浓度类黄酮单标溶液以及10mg/ml的高浓度类黄酮单 标溶液于100mL容量瓶中，以样品提取溶液，即甲醇-氯仿-水提取溶液定容制备得到标 准混合溶液，以样品提取溶液逐级稀释标准混合溶液，制成低浓度类黄酮物质浓度为1000、 600、400、100、60、40、10、6、4、1 ng/mL，体积为I mL的标准溶液梯度；此梯度对应的高浓度 标准溶液梯度为100、60、40、10、6、4、1、0. 6、0. 4、0.1 yg/mL ;在上述所有浓度梯度的溶液 中加入200 μ 1的内标溶液得到对照品溶液，内标溶液为黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水 溶液，浓度为I. 0 μ g/mL ; D、 测定：经色谱质谱分析，以待测14个类黄酮化合物的含量为横坐标，以其对应的色 谱峰面积与内标化合物的色谱峰面积的比值为纵坐标，建立工作曲线，对校正数据进行线 性回归，求得类黄酮物质的回归方程，试样中类黄酮物质的含量按下式进行计算：
式中：C为烟草花瓣样品中类黄酮物质的含量，单位μ g/g; X为仪器测得的萃取液的浓度，单位为ug/mL。
2. 根据权利要求1所述的定量分析烟草花瓣中14种类黄酮物质的检测方法，其特征在 于A步骤中所述的研磨是将待检样品烟草花瓣放入研钵，加液氮冷冻，研磨粉碎。
3. 根据权利要求1所述的定量分析烟草花瓣中14种类黄酮物质的检测方法，其特征在 于A步骤中所述的甲醇-氯仿-水提取溶液的体积配比为5:2:2。
4. 根据权利要求1所述的定量分析烟草花瓣中14种类黄酮物质的检测方法，其特征 在于D步骤中所述的色谱分析条件为：色谱柱，Waters BEH C18 (15 cm X 2.1 mm，1.7 μπι 粒径）；Α相，水；B相，乙腈，两相均添加0. 1%的甲酸和0. 2 mmol/L的醋酸铵；流动性梯 度，0-lmin，10%B ;l-9min，10%B-90%B ;9-llmin，90%B-100%B ; 11-11.lmin，100%B-10%B ; 11.1-131^11，保持10%8;柱温30°〇，进样量2 4 1^，流速0.25 111171^11。
5. 根据权利要求1所述的定量分析烟草花瓣中14种类黄酮物质的检测方法，其特征 在于D步骤中所述的质谱分析条件为：离子源，电喷雾电离离子源；喷雾电压，-4000 V ;帘 气压力，40 psi ;离子源温度，700 °C ;辅助气1，60 psi ;辅助气2, 50 psi ;去簇电压，-100 V ;化合物定量离子及能量见表1， 表1类黄酮物质分析质谱定量离子及碰撞能量
【专利摘要】本发明公开了一种定量分析烟草花瓣中14种类黄酮物质的检测方法，包括样品前处理、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和测定步骤。本发明基于发明人2014年从烟草的叶和花中鉴定出17种类黄酮物质，其中9种为烟草中首次被鉴定出来，使得建立了其中14种类黄酮物质的定量分析方法，本发明方法的建立对于开展烟草花瓣中类黄酮物质的相关研究具有重要意义。
【IPC分类】G01N30-88
【公开号】CN104865337
【申请号】CN201510314816
【发明人】李勇, 逄涛, 师君丽, 陈萍
【申请人】云南省烟草农业科学研究院
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月10日