专利名称：冷冻过程中酶的稳定化的制作方法
技术领域：
本发明涉及稳定的酶制剂的制备。特别是，本发明涉及在冷冻过程中稳定酶的方法。
如果要制备液体形式的试剂，保持稳定性就成为主要问题，原因是通常需要储存和运输试剂。
液体形式的有市售的试剂实例是那些包括葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的酶，它们需要用比色方法(已知的Trinder方法(Barham和Trinder，Analyst，1972；97142))测定葡萄糖。需要稳定葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶以保证在其贮存期限内酶的功能。典型地，用磷酸酯或Tris(羟甲基)氨基甲烷缓冲液来配制这些酶以保持试剂在储存和反应期间的pH。遇到的一个困难是在运输过程中或在储存时液体制剂经常被冷冻，在这些情况下，酶将失活。
因此，需要提供在储存时能有效稳定诊断试剂、并且如果发生冷冻能提供进一步的保护的组合物。
US 607106公开了含有αGST酶和两性离子缓冲液的组合物，其可以储存于-20℃下。目的是保留αGST的免疫反应性，但其中没有提及保留酶活性。文中提到了辣根过氧化物酶，但仅在用于免疫测定的酶标记的抗-αGST IgG内容中出现。在磷酸缓冲盐溶液中进行该酶在溶解状态中的稳定化。
US 5910422和US 4465770中都描述了采用多糖或长链低聚糖(例如山梨醇)对特定的酶(分别为α-淀粉酶和尿酶)在溶解状态中的稳定化过程。两性离子缓冲液可用来帮助酶在溶解状态中的稳定化。
通常，尽管对于不同的酶在溶解状态中的稳定化存在各种不同的方法，仍然需要一种在冷冻过程中或之后稳定酶活性、尤其是诊断试剂的酶活性的有用方法。
发明概述根据本发明，在冷冻中过程中稳定酶活性的方法包含在两性离子缓冲液中提供酶。
两性离子缓冲液具有有效稳定液态酶的能力，并且如果终溶液因意外或其它原因冷冻其还可以提供保护。
在优选的实施方案中，酶为葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶。
根据本发明的第二个方面，酶的冷冻溶液处于两性离子缓冲液中。
不受理论的限制，两性离子缓冲液稳定酶活性的能力可以是缓冲液防止冷冻过程中pH明显移动能力的结果。已知磷酸缓冲液可以引起冷冻过程中大的pH移动(Rose等人Arch.Biochem.Biophys.，1959；81319-329)，并且认为这会引起酶的变性。典型地，在缓冲液组合物中，水会首先冷冻，然后冰晶会生长。当温度接近存在的盐的低共熔点时，盐结晶析出。缓冲液中溶解度较小的盐将首先从溶液中结晶出来，在冷冻固体形成之前，这会引起pH值的大幅度变化。然而，两性离子缓冲液可以防止这种pH移动，因此能够使酶稳定。
可以用于本发明的合适缓冲液包括Mops(3-〔N-吗啉代〕丙磺酸)，Mopso(3-[N-吗啉代]-2-羟基丙磺酸)和Hepes(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸])。这些缓冲液均有市售。其它两性离子缓冲液对本领域的技术人员来说是已知的。
制备带有酶的缓冲液对本领域的技术人员来说是很容易的，典型地，制备的缓冲液的浓度为20-250mmol/l。优选地，所制备的缓冲液的pH为7。
尽管缓冲液可以防止冷冻时酶的失活，优选的是将溶液储存在4℃下。
缓冲液可以用来稳定任何酶以抵抗冷冻的作用。在优选的实施方案中，酶为葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶。酶可以是存在于缓冲液中的唯一的活性分子。例如，溶液不含某些时候存在于一些需要过氧化物酶的诊断试剂盒中的甘油三酯或胆固醇。溶液中也可以不含多糖或低聚糖，即蔗糖。
下列实施例将说明本发明。
20KU/l葡萄糖氧化酶1.6KU/l过氧化物酶11.0mmol/l苯酚0.05％叠氮化钠0.03％聚乙烯吡咯烷0.77mmol/l 4-氨基安替比林用氢氧化钠和/或盐酸将pH调节至7。配方C50mmol/l Mops缓冲液19.5mmol/l磷酸二氢钠30.5mmol/l正磷酸氢二钠19.20KU/l葡萄糖氧化酶1.6KU/l过氧化物酶11.0mmol/l苯酚0.04％叠氮化钠0.03％聚乙烯吡咯烷0.77mmol/l 4-氨基安替比林用氢氧化钠和/或盐酸将pH调节至7。
配方D(不含Mops缓冲液的对照)39mmol/l磷酸二氢钠61mmol/l正磷酸氢二钠20KU/l葡萄糖氧化酶1.6KU/l过氧化物酶11.0mmol/l苯酚0.04％叠氮化钠0.03％聚乙烯吡咯烷0.77mmol/l 4-氨基安替比林用氢氧化钠和/或盐酸将pH调节至7。
所有的制剂均在-20℃下冷冻2周，在融化后测定每种酶的活性。采用Theorell Acta.Chem.Scand.，1950；4；22的方法测定过氧化物酶的活性。采用Bergmeyer等人，酶促分析，1974；1457(Academic Press)的方法测定葡萄糖氧化酶的活性。
将这些结果与用在4℃下储存2周的同样试剂得到的结果进行比较。在500nm下测定试剂的吸收度，在使试剂与100mmol/l的葡萄糖标准进行反应后，获得了从吸收度测定的因子。
使制剂也经受冷冻和提高温度的条件，以模仿在试剂装运过程中可能发生的条件。
使试剂经受两套试验条件；储存于-20℃或+37℃下。在-20℃或+37℃下，每个试验周期均为3天，接着在正常的储存温度4℃下保持3天。使试剂在每个试验条件下经过3个循环。
完成后，通过评价线性度以及获得一套质量控制物质的正确值的能力来测定每种试剂的稳定性。
所有的葡萄糖和酶测定均采用自动分析仪进行。结果1)酶活性2周后，在-20℃下对葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶在所有试剂中的浓度进行了测定。结果列于表1。不含Mops缓冲液的试剂D未发现有可检测到的葡萄糖氧化酶活性存在，并且在冷冻和融化后过氧化物酶的水平降低。其它3个或仅含有两个不同浓度Mops缓冲液或含有组合的Mops和磷酸缓冲液的试剂在冷冻和融化后保留了它们的葡萄糖氧化酶活性和过氧化物酶活性。
表1
2)线性度(表2，3和4)当储存于+4℃下时，所有的配方对22mmol/l葡萄糖均显示出线性度。所有含有Mops缓冲液的配方在-20℃下3个循环后均保持了它们的22mmol/l的线性度。不含Mops缓冲液的配方D在3个循环后失活，并且无法测定葡萄糖的浓度。所有配方在+37℃下3个循环后均保持了它们的线性度。
表2(+4℃下3个周期的运输研究)
表3(-30℃下3个周期的运输研究)
表4(+37℃下3个周期的运输研究)
3)质量控制血清中葡萄糖的回收(表5，6和7)相对于对照血清样品对配方进行了试验。在表中，Precie-Path以及Precie-Norm可从Roche Diagnostics得到，并且多血清样品可从Randox Laboratories得到。
当储存于4℃下时，所有的配方给出了可接受的值。-20℃下3个周期后，所有的含有Mops的配方给出的值均在范围之内，与储存于4℃下的对照试剂相比有小于3％的偏差。+37℃下3个周期后，对于每一个对照血清来说，所有的配方均给出可接受的值。
表5(+4℃下的稳定性)
表6(2周时-20℃下的稳定性)
表7(2周时+37℃下的稳定性)
总之，使用作为单独的缓冲液或与磷酸缓冲液结合的Mops缓冲液在冷冻和融化后可保持酶的活性。
权利要求
1.在冷冻过程中稳定酶活性的方法，其中的酶处于两性离子缓冲液中。
2.权利要求1中所述的方法，其中的酶为葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶。
3.权利要求1或2中所述的方法，其中的两性离子缓冲液为Mops、Mopso或Hepes。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中的缓冲液以20-250mmol/l的浓度存在。
5.任意前述权利要求所述的方法，其中溶液的pH为7。
6.任意前述权利要求所述的方法，其中的溶液储存于4℃。
7.任意前述权利要求所述的方法，其中的溶液处于冷冻状态。
8.任意前述权利要求所述的方法，其中的溶液不含任何其它活性成分。
9.包含葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶以及两性离子缓冲液的组合物。
10.处于两性离子缓冲液中的酶的冷冻溶液。
11.权利要求10中所述的冷冻溶液，其中的酶为葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶。
全文摘要
一种在冷冻过程中稳定酶的方法,其中的酶处于两性离子缓冲液中。两性离子缓冲液可以在冷冻和融化过程中保持酶的活性。
文档编号C12N9/04GK1344794SQ0114067
公开日2002年4月17日 申请日期2001年9月20日 优先权日2000年9月20日
发明者S·P·菲茨格拉德, J·坎贝尔, J·V·拉蒙特, M·金 申请人:兰道克斯实验有限公司