专利名称：一种利用黑曲霉生产β－甘露聚糖酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种以麸皮、玉米粉和菜籽饼粉等农副产品为主原料，利用黑曲霉WA9024菌株固态发酵生产β-甘露聚糖酶的方法，属酶工程技术领域。
背景技术：
β-1，4-D-甘露聚糖甘露糖水解酶(β-1，4-D-mannan mannohydrolase，EC3.2.1.78)是一类从甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖等的主链内部随机切割β-1，4-D-甘露糖苷键的水解酶，简称β-甘露聚糖酶(β-mannanase)，属于半纤维素酶类，广泛存在于低等动物、豆类植物、海洋生物及微生物中。
随着人类对自然界半纤维素酶的开发利用，以及对β-甘露聚糖抗营养因子的深入了解和甘露低聚糖生理功能的不断发现，为β-甘露聚糖酶的研究和开发提供了广阔的发展空间。目前，关于β-甘露聚糖酶的研究和生产主要来源于微生物。微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活性高、成本低、来源稳定、提取方便以及比动植物更广的作用pH、温度范围和底物专一性等显著特点。因此，被广泛的应用于食品、医药、饲料、造纸、石油开采和生物科学研究等领域。
近年来，关于β-甘露聚糖酶的研究和开发进入了一个新的高潮。在食品工业中，由于甘露低聚糖保健价值的不断发现，使β-甘露聚糖酶在食品加工中有了更为广泛的应用。例如，在速溶咖啡生产中添加β-甘露聚糖酶，不仅能提高速溶咖啡的品质还能增加其保健价值；在果蔬汁的生产过程中加入β-甘露聚糖酶能降低原料浆汁的粘稠度，不仅大大降低了生产能耗还提高了果蔬汁的营养保健功能。饲料工业中，随着β-甘露聚糖酶许多功能(如促进动物生长，提高动物饲料转化率；促进营养成分消化，改善动物肠道微生物生态；降低肠道内溶物的粘稠度，减少粪便排放，减轻环境污染；提高微量元素的生物利用，等)的发现，它以一种饲料添加剂的形式广泛的应用于各种动物饲料的生产。随着β-甘露聚糖酶的功能在各个行业中的不断发现，其需求量将会不断增加，为其进一步的研究生产提供了广阔的发展和市场前景。
目前，在国内外文献报道中，关于微生物β-甘露聚糖酶的研究主要包括产β-甘露聚糖酶微生物(包括真菌、细菌、放线菌等)的筛选和诱变育种，产酶发酵工艺条件(包括固态或液体发酵培养基和培养条件等)的优化，酶的分离纯化和性质(包括酶的组分数、分子量、等电点、最适作用温度和pH稳定性、酶动力学特性和底物专一性等)的测定，以及酶基因的克隆和表达等。进入20世纪90年代以来，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，越来越多的工作集中与β-甘露聚糖酶基因的克隆、表达和活性位点的研究等方面，但目前成熟的报道并不多，有关β-甘露聚糖酶固态发酵产业化生产方法则尚未见报道。
李剑芳等利用紫外和亚硝基胍诱变育种，获得了一株黑曲霉突变株L-76-1，其液体发酵产酸性β-甘露聚糖酶活性为320U/mL；柴萍萍等优化了芽孢杆菌WY45的液体发酵条件，β-甘露聚糖酶活性达2800U/mL；李江华等利用紫外诱变育种，获得了一株黑曲霉突变株WA9024，其固态发酵产β-甘露聚糖酶活性达8940U/g。Heck等对Bacillus circulans BL53菌株的固态发酵培养基进行了优化，其最高产β-甘露聚糖酶活性为560U/g；Juhasz等报道了不同碳源对Trichodermareesei产纤维素和半纤维素酶的影响，其最高产β-甘露聚糖酶活性为4500U/g。虽然国内外已有许多利用微生物液体或固态发酵生产β-甘露聚糖酶的文献报道，但发酵酶活性普遍较低，限制了该酶的广泛应用，尤其是在饲料工业和甘露低聚糖生产等领域中的应用。
现在，市场上也有作为商品用的β-甘露聚糖酶，主要有美国ChemGen公司生产的和美酵素和国内的华芬酶等。但由于价格昂贵，阻碍了β-甘露聚糖酶的大范围应用。本发明获得了一种简单、易操作、成本低、收益大的产业化生产β-甘露聚糖酶的固态发酵方法，其β-甘露聚糖酶发酵酶活性高于目前国内水平，适用于低能耗、低成本的现代酶制剂生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种以麸皮、玉米粉和菜籽饼粉等农副产品为发酵基料，利用黑曲霉WA9024菌株固态发酵生产β-甘露聚糖酶的方法。
本发明的技术方案固态发酵实验室小试生产β-甘露聚糖酶菌株黑曲霉(4spergillus niger)WA9024，由江南大学医学院分子生物学研究室筛选和保藏。该菌种巳在《无锡轻工大学学报》第23卷第5期，2004年9月公开。
斜面种子培养基及培养条件去皮马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH；121℃灭菌20min，放置斜面；冷却后接种WA9024菌株，置32℃培养96h。此斜面培养基用于菌种活化、保藏和试管斜面种子等。
发酵培养基及发酵条件250mL三角瓶装10g基料(其中麸皮6～8g，玉米粉1～2g，菜籽饼粉1～2g)，魔芋粉0.3～0.5g，玉米浆0.3～0.5g，(NH4)2SO450～100mg，KH2PO430～50mg，CaCl25～10mg，CuSO4·2H2O 0.5～1mg，KI 0.5～1mg，MnSO4·H2O 0.5～1mg，自来水16～18mL，pH 6.0。121℃灭菌40min，冷却后接种一菌耳WA9024试管斜面种子，于31～33℃培养84～96h，期间分别于24～28h和44～48h各翻曲1次并各补加无菌水1.6～1.8mL。
三角瓶麸曲种子的制备250mL三角瓶装10g基料(即麸皮10.0g)，(NH4)2SO450mg，自来水13mL，pH 6.0。121℃灭菌40min，冷却后接种WA9024斜面种子，32℃培养96h，期间分别于24h和44h各翻曲1次。
曲盘麸曲种子的制备称取3.0kg基料(即麸皮3.0kg)，(NH4)2SO415g，自来水3.9L，pH 6.0，混匀，装入8层纱布袋中，121℃灭菌40min，冷却后放入曲盘(100cm×50cm×10cm)中，接种1只三角瓶麸曲种子，于32℃曲房中培养96h，期间分别于24h和44h各翻曲1次，并同时各补加无菌水390mL。
固态发酵产业化生产β-甘露聚糖酶接种物WA9024曲盘麸曲种子。
发酵培养基配方1000kg基料(其中麸皮700～800kg，玉米粉100～150kg，菜籽饼粉100～150kg)，并添加魔芋粉30～50kg，玉米浆30～50kg，(NH4)2SO45～10kg，KH2PO43～5kg，CaCl20.5～1.0kg，CuSO4·2H2O 0.05kg，KI 0.05kg，MnSO4·H2O 0.05kg，自来水1800～2000kg，pH 6.0。
固态发酵条件在6M3蒸煮锅内加入固态发酵培养基，混匀，用直接蒸汽加热至121℃，保温灭菌40min，冷却至38～40℃后，接种3kg WA9024曲盘麸曲种子，混匀，置于30M3固态发酵罐内，32～36℃间断通风培养72～84h，期间分别于20～24h和36～40h各翻曲1次并各补加无菌水180～200kg。
分析方法β-甘露聚糖酶活性测定于25mL具塞试管A、B中，各加入用pH 4.8、乙酸-乙酸钠缓冲液配置的质量浓度为0.5％的角豆胶溶液2.4mL，50℃预热10min后，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应10min；立即分别加入2.5mL 3’，5’-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，煮沸7min；冷却后各加水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度，并从甘露糖标准曲线上查出相应的还原糖(以甘露糖计)含量并折算成酶单位。酶活性定义在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖的酶量定义为1个β-甘露聚糖酶活性单位(IU)。
还原糖测定采用DNS法，以甘露糖为标准。
水分测定称取一定量的麸曲，105℃烘干至恒重。
本发明的有益效果本发明突出的优点是利用廉价的麸皮、玉米粉和菜籽饼粉等农副产品作为发酵主原料，是一种充分利用自然界可再生资源的生产方法。同时，本发明所采用的菌株黑曲霉是公认安全(GRAS)的微生物，因此利用黑曲霉发酵生产酶制剂具有安全、可靠和不产生毒素等优点；利用黑曲霉(Aspergillus niger)WA9024菌株固态发酵法生产β-甘露聚糖酶，符合生态系统中的自然法则，是一种绿色环保且可持续的生产方法。本发明利用黑曲霉(Aspergillus niger)WA9024菌株，实验室小试生产β-甘露聚糖酶的酶活性可达18912～22185IU/g干曲，比WA9024菌株原固态发酵的酶活性(8984IU/g干曲)提高了2.11～1.47倍；产业化生产β-甘露聚糖酶的酶活性为12678～15921IU/g干曲。
具体实施例方式
以下是以麸皮、玉米粉和菜籽饼粉等农副产品为发酵主原料，并添加适量的魔芋粉、玉米浆、无机盐和自来水等，利用黑曲霉(Aspergillus niger)WA9024菌株固态发酵生产β-甘露聚糖酶的实施例，但本发明并不限于所列的几个实施例。
实施例1菌株黑曲霉WA9024。
三角瓶固态发酵培养基250mL三角瓶装10g基料(其中麸皮6.4g，玉米粉1.6g，菜籽饼粉2.0g)，魔芋粉0.4g，玉米浆0.5g，(NH4)2SO4100mg，KH2PO430mg，CaCl210mg，CuSO4·2H2O 0.5mg，KI 0.5mg，MnSO4·H2O 0.5mg，自来水17mL，pH 6.0。
三角瓶固态发酵条件将培养基在121℃灭菌40min，冷却后接种一菌耳WA9024斜面种子，于32℃静置培养84h，期间分别于24h和44h各翻曲1次并同时各补加1.7mL无菌水。
重复5批次的上述三角瓶试验结果表明，成熟发酵曲料的β-甘露聚糖酶平均酶活性达到22185IU/g干曲。
实施例2菌株黑曲霉WA9024。
产业化生产固态发酵设备30M3固态发酵罐，带自动控温鼓风装置、机械翻曲装置、机械补水装置和机械出料装置等。罐体直径4.5m，罐体高度2.0m，实装1000kg基料(以干物料计)，发酵培养基堆积厚度30cm。
产业化生产固态发酵培养基1000kg基料(其中麸皮800kg，玉米粉100kg，菜籽饼粉100kg)，魔芋粉40kg，玉米浆50kg，(NH4)2SO410kg，KH2PO43kg，CaCl21.0kg，CuSO4·2H2O 0.05kg，KI 0.05kg，MnSO4·H2O 0.05kg，自来水2000kg，pH 6.0。
产业化生产固态发酵条件将上述发酵培养基加入6M3高压蒸煮锅，用蒸汽加热至121℃，保温40min，冷却至38～40℃后，接种3kg WA9024曲盘麸曲种子，混匀，置于30M3固态发酵罐内，采用间断通风将温度控制在32℃，恒温培养84h，期间分别于24h和40h各翻曲1次，并同时各补加无菌水200kg。
重复3批次的上述产业化生产试验结果表明，成熟发酵曲料经45～50℃热风烘干(干曲含水量8％左右)，β-甘露聚糖酶平均酶活性达到12678IU/g干曲。
实施例3为了有利于菌体的生长，达到缩短发酵周期和控制杂菌污染的目的，本实施例采用固态发酵温度前高后低的变温控制模式，固态发酵培养基配方同实施例2。
固态发酵培养基经灭菌、冷却、接种后，置于30M3固态发酵罐内。(1)发酵前期(0～20h)0～8h将进风口和出风口全部关闭，温控仪设置在36℃；8～12h将进风口和出风口开启1/3，随后12～20h逐渐开大进风口和出风口，直至全部开启，温度仍控制在36℃。(2)发酵中期(20～56h)20h翻曲一次并同时补加无菌水200kg，并将设定温度调低至35℃；36h再翻曲一次并同时补加无菌水200kg，将设置温度调低至34℃；36～56h将温度逐渐调低至32℃。(3)发酵后期(56～72h)将32℃一直保持到72h发酵结束。
重复3批次的上述产业化生产试验结果表明，成熟发酵曲料经45～50℃热风烘干(干曲含水量8％左右)，β-甘露聚糖酶平均酶活性达到14028IU/g干曲。
实施例4改变固态发酵基料中麸皮与菜籽饼粉的比例，其余同实施例3。
1000kg基料(其中麸皮750kg，玉米粉100kg，菜籽饼粉150kg)，并添加魔芋粉40kg，玉米浆50kg，(NH4)2SO410kg，KH2PO43kg，CaCl21.0kg，CuSO4·2H2O 0.05kg，KI 0.05kg，MnSO4·H2O 0.05kg，自来水2000kg，pH 6.0。发酵培养基经灭菌、冷却、接种后，置于30M3固态发酵罐内，发酵条件同实施例3。
重复3批次的上述产业化生产试验结果表明，成熟发酵曲料经45～50℃热风烘干(干曲含水量8％左右)，β-甘露聚糖酶平均酶活性达到15921IU/g干曲。
权利要求
1.一种小试生产β-甘露聚糖酶的方法，其特征是以麸皮、玉米粉和菜籽饼粉为固态发酵培养基的基料，并添加适量的魔芋粉、玉米浆、无机盐和自来水，在250mL三角瓶中，利用黑曲霉(Aspergillus niger)WA9024菌株固态发酵生产β-甘露聚糖酶；固态发酵培养基配方为250mL三角瓶装10g基料，其中麸皮6～8g，玉米粉1～2g，菜籽饼粉1～2g，并添加魔芋粉0.3～0.5g，玉米浆0.3～0.5g，(NH4)2SO450～100mg，KH2PO430～50mg，CaCl25～10mg，CuSO4·2H2O 0.5～1mg，KI 0.5～1mg，MnSO4·H2O 0.5～1mg，自来水16～18mL，pH 6.0；固态发酵条件为发酵培养基121℃灭菌40min，冷却后接种一菌耳WA9024斜面种子，于31～33℃培养84～96h，期间分别于24～28h和44～48h各翻曲1次并各补加无菌水1.6～1.8mL。
2.一种产业化生产β-甘露聚糖酶的方法，其特征是以麸皮、玉米粉和菜籽饼粉为固态发酵培养基的基料，并添加适量的魔芋粉、玉米浆、无机盐和自来水，在30M3固态发酵罐内，利用黑曲霉(Aspergillus niger)WA9024菌株固态发酵产业化生产β-甘露聚糖酶；固态发酵培养基配方1000kg基料，其中麸皮700～800kg，玉米粉100～150kg，菜籽饼粉100～150kg，并添加魔芋粉30～50kg，玉米浆30～50kg，(NH4)2SO45～10kg，KH2PO43～5kg，CaCl20.5～1.0kg，CuSO4·2H2O 0.05kg，KI 0.05kg，MnSO4·H2O 0.05kg，自来水1800～2000kg，pH 6.0；固态发酵培养条件为在6M3蒸煮锅内加入固态发酵培养基，混匀后，用直接蒸汽加热至121℃，保温灭菌40min，冷却至38～40℃后，接种3kg WA9024曲盘麸曲种子，混匀，置于30M3固态发酵罐内，32～36℃间断通风培养72～84h，期间分别于20～24h和36～40h各翻曲1次并各补加无菌水180～200kg。
全文摘要
一种利用黑曲霉生产β－甘露聚糖酶的方法，属于酶工程技术领域。本发明采用麸皮、玉米粉和菜籽饼粉等农副产品为基料，并添加适量的魔芋粉、玉米浆、无机盐和自来水等，利用黑曲霉(Aspergillus niger)WA9024菌株固态发酵生产β－甘露聚糖酶，提供了小试生产和产业化生产的发酵培养基配方和发酵条件，小试生产成熟发酵曲的β－甘露聚糖酶活性达18912～22185IU/g干曲，比WA9024菌株原小试生产固态发酵的酶活性(8984IU/g干曲)提高了2.11～2.47倍，高于目前国内水平；产业化生产产品酶活性为12678～15921IU/g干曲。本发明用廉价的麸皮、玉米粉和菜籽饼粉等为发酵主原料，是一种充分利用自然界可再生资源，又是一种绿色环保且可持续的生产方法。
文档编号C12N1/14GK101067130SQ20071002240
公开日2007年11月7日 申请日期2007年5月17日 优先权日2007年5月17日
发明者邬敏辰, 李剑芳, 张树飞, 李江华, 徐春梅, 盛金萍, 邓珊珊, 方诗月 申请人:江南大学