用于加强和刺激植物天然防御系统的方法

专利名称：用于加强和刺激植物天然防御系统的方法
技术领域：
本发明包含一种用于加强和刺激植物，特别是谷物(尤其是小麦)、马铃薯和葡萄的天然防御系统的方法。
激活植物的天然防御能力是一个紧迫的问题，也是许多研究工作的对象。
例如，本领域技术人员知道在存在已知的可作为诱导剂的物质的条件下培养植物能够激活以下类型的防御反应—天然抗生素(更常称为植物抗毒素)的积累—防御蛋白质(又称为PRP，致病相关蛋白质)，例如几丁质酶或葡聚糖酶的合成—通过合成木质素或交联蛋白质加固细胞壁—合成第二信使，如乙烯、过氧化氢或水杨酸。
诱导剂包括寡聚果胶；它们能在多种农作物中诱导上述防御反应；通常在浓度为100mg/l时产生最强的反应，并且直至4g/l都维持同等水平。
在这方面，并且作为一个例子，根据已公开的日本专利申请No.HEI3-339080(1991年12月20日，申请人为Fushimi SeiyakushoK.K)，通过将含有浓度为100到1000mg/l的DP6、DP8、DP10和DP12果胶寡聚体的水溶液处理小麦的叶片，从而制备和累积了植物抗毒素(本例中是在小麦中制备和积累了avenaluminum-1)。
这个方法在没有任何病原菌的情况下，产生了防御反应，但它有很多缺点，包括不容忽视的植物的能量消耗。
本发明最重要的目的是祢补已有技术的缺陷，并给使用者提供在需要时激活植物天然防御力的手段，换句话说，当病原菌攻击植物时，这种手段使植物因此对病原菌具有免疫力。
随着研究的深入，本申请公司发现，令人非常惊奇和出乎意料的是，一旦将含有1种或多种由150个糖单元以下(优选为3到50个，更优选3到20个糖单元)组成的寡聚果胶的组合物(所述寡聚果胶在组合物中的浓度不直接诱导防御反应，即其浓度为1到20mg/l，优选2到10mg/l，更优选5到10mg/l)施用给植物，不仅能取得以上的效果，而且还加强了植物的天然防御能力。
本申请公司能证明以组合物的形式使用上述寡聚果胶(所述寡聚果胶在组合物中一窄的浓度范围，即从1～10mg/l)时，它们仅从被处理植物受到病原菌的攻击时才开始产生加强植物天然防御力的效果。
它的优点是植物的代谢不会被引入歧途，即在没有必要时，开始防御性反应；而是只在植物成为攻击目标时，代谢才处于备战状态，动员防御力，并且比没有经任何处理时强烈得多。
因此本发明包含用含有1种或多种由150个糖单元以下(优选3到50个，更优选3到20个糖单元)组成的寡聚果胶的组合物(所述寡聚果胶在组合物中的浓度不直接诱导防御反应，即其浓度为1到20mg/l，优选2到10mg/l，更优选5到10mg/l)来加强和激活植物特别是谷物(尤其是小麦)、马铃薯和葡萄的天然防御力的用途。
本发明的一个有益实施方案中，所述植物植物检疫组合物包含，与寡聚果胶相结合使用的至少一种其它选自杀真菌剂的植物检疫制品。
本发明还包括一种处理植物(特别是谷物，尤其是小麦、马铃薯和葡萄)来加强和激活它们的天然防御力，即保证植物对病原菌具有预防性保护的方法，该方法的特征在于它包括对具体说是叶子或种子施用包含1种或多种由150个糖单元以下(优选3到50个，更优选3到20个糖单元)组成的寡聚果胶的组合物，所述寡聚果胶在组合物中的浓度不直接诱导防御反应，即其浓度为1到20mg/l，优选2到10mg/l，更优选5到10mg/l。
在依照本发明所述方法的有益实施方案中，应用上述组合物处理植物，其每公顷的使用量为不直接诱导防御反应，即其用量为每公顷使用10到1000g，优选20到500g，更优选50到200g。
本发明还包括液态、粉末或颗粒状的浓缩物，在用适当量的溶剂(特别是水)将其稀释时，能提供依照本发明使用的组合物。
应当注意术语“寡聚果胶”是指果胶的水解产物。
果胶是陆生植物的初生壁的主要多糖组分；是分子量在100000到150000的多糖；它们主要含有通过糖苷键连接的被部分甲基化的半乳糖醛酸；是每分子约有2千糖单位的线性多糖。
果胶有三种主要类型，称为同聚半乳糖醛酸、I型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖和II型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖。
同聚半乳糖醛酸或多聚半乳糖醛酸(经常以PGA表示)是半乳糖醛酸的线性聚合物，其聚合度可高达2000，该分子的结构单元是通过α-1，4-糖苷键连接的。
在这些多糖中，α-1，4-半乳糖醛酸骨架可以包括基于木糖的分支或者插入了α-1，2-鼠李糖残基，它们给分子的三维结构导入了“肘部”。如果鼠李糖与半乳糖醛酸的摩尔比接近1∶1，该物质是I型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖，通常以RGI表示。
如果多糖还有阿拉伯糖和半乳糖侧链，它就是II型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(通常以RGII表示)；在II型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖中，半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖醛酸残基的排布比前面的更复杂。
由以下的附加说明和关于本发明有益实施方案的非限制性实施例可以更好地理解本发明。
采用以下方法或等同的方法来激活所述植物的天然防御力，换句话说，就是赋予它们对病原菌的预防性免疫能力。
用组合物处理以上确定的其天然防御能力在受到病原菌的攻击时被激活的植物，其中是将组合物施用给叶子或种子，除了这类组合物的标准媒介物和组分外，该组合物还包括1种或多种有150个以下糖单元(优选3到50个，更优选3到20个糖单元)的寡聚果胶，并且寡聚果胶在组合物中的浓度不直接诱导防御反应，即其浓度为1到20mg/l，优选2到10mg/l，更优选5到10mg/l。
通常从植物的第一营养阶段开始施用处理剂，可以经几次连续施用，并以喷洒为宜。
施用的准确时间要根据受处理植物的特性具体选择。
所述媒介物或载体通常是水。
但是，除了水，载体还可以选自矿物油、植物油、所有的液态脂肪和醇类，特别是乙二醇或甘油。
根据受处理植物的特性可以改变所述组合物的必要标准组分；它们通常选自溶剂、表面活性剂、分散剂和/或固体填充剂。
可以通过从梨果榨渣或柑橘类果皮(特别是柠檬皮)提取得到的果胶的酶或酸解产物来制备组成所述组合物活性物质的寡聚果胶。
以相对干物质的重量百分比表示，果胶在上述四种物质中的浓度是—在梨果榨渣中是15wt.％—在橙子或葡萄果皮中是25wt.％—在柠檬皮中是35wt.％—在酸橙果皮中是50wt.％。
在实际操作中，果胶是从果汁行业的副产品中提取的；可以用无机酸(例如盐酸)pH值在1到2.5，于60到80℃处理2到10小时。
将提取物例如通过过滤和离心纯化；中和并浓缩提取介质，然后用醇(如乙醇或异丙醇)将果胶沉淀，随后干燥并获得其粉末形态。
可以用从黑曲霉中提取的果胶水解酶(具体说是EC4.2.2.1.0)或果胶酶(又称为多聚半乳糖醛酸酶，具体说是EC3.2.1.15)将果胶以酶法降解成寡聚果胶。
以下的实施例描述了—通过酶法降解制备组成三种水解物(分别命名为H18、H19和H21)的原材料的果胶，每种水解物含有至少一种寡聚果胶，后者构成符合本发明的组合物的活性物质，—依照本发明的两种组合物，和—阐述本发明的实验实施例1制备水解物H18和H19原材料是从Sigma购买的部分甲基化的多聚半乳糖醛酸形式的苹果果胶，商品代码是P-2157。
所用的酶是从Sigma购买的P-7052果胶水解酶，它是得自黑曲霉。
制备pH5的20mM磷酸-柠檬酸缓冲液。
将25g所述果胶溶于5升所述缓冲液，定期加入足量的0.2M二碱基磷酸盐以便将pH维持在5(随着果胶被溶解，pH会下降)。
将20单位所述果胶水解酶加入到2升保持于40℃恒温的上述溶液中。
将所得溶液在40℃下维持30分钟。
然后在装有孔径为10000道尔顿的Millipore PELLICONTM切向流超滤装置中将溶液在500到1000ml/h的流速下连续超滤。输入压力为1巴。
在超滤过程中，通过自动加入3升果胶溶液使待超滤溶液的体积维持在2升。
第一次超滤操作后得到4升含有分子量小于10000道尔顿的寡聚果胶的超滤液；假设一个糖单位的分子量约为200，超滤液中的寡聚果胶包含最多50个糖单位。
将超滤液在相同的仪器中再作切向流超滤，这次所装的滤膜盘的孔径是500道尔顿。
第二次超滤将前次的超滤液脱盐，并清除了分子量小于500道尔顿的寡聚果胶(即含有最多2个糖单位)；进行第二次超滤的输入压力小于2巴，流速为2到3l/h。
将这样得到的4升超滤液用5升蒸馏水洗两次，用ROTOVAPOR仪器于55℃通过蒸发浓缩到50ml，用稀释的苏打溶液中和，然后冻干。
依照Spino等描述的技术(“碳水化合物研究”247(1993)，9-20)，通过偶联电流计和采用DIONEXTM离子交换树脂(DionenChemical Crop.，Dow的子公司)所进行的离子层析分析表明所得粉末状寡聚果胶实际上有3到10个糖单位，平均聚合度在4到6。
得到15g奶油色的粉末；该粉末组成水解物H19。
将来自第一次超滤操作的残基在相同的仪器中进行第三次超滤，这次所配备的滤膜盘的孔径为30000道尔顿。
结果这样得到的超滤液所含有的寡聚果胶的分子量小于30000道尔顿(即最多有150个糖单位)，并且由于第一次超滤操作，分子量还大于10000道尔顿(即超过50个糖单位)。
将这样得到的超滤液0.75升用5升蒸馏水洗两次，用所述ROTOVAPOR仪器于55℃通过蒸发浓缩到50ml，用稀释的苏打溶液中和，然后冻干。
得到5g奶油色的粉末，该粉末组成水解物H18。
用Blumenkrantz & Asboe-Hansen在“分析化学”(54，484-489页，(1973))中描述的方法和间位-羟苯法，发现糖醛酸含量为100％。
通过偶联电流计和采用DIONEXTM离子交换树脂(DionesChemical Crop.，Dow的子公司)所进行的离子层析分析表明所得粉末状寡聚果胶实际上有8到30个糖单位，平均聚合度在10到20。实施例2制备水解物H21将25g实施例1中使用的果胶溶于5升水中。
持续加入0.5N苏打将pH保持在10。
完全溶解后，将温度升至70℃，并保持30分钟。
这使聚合物脱去甲氧基。
用1N HCl中和去甲氧的聚合物溶液，并用实施例1中使用的配备有孔径为10000道尔顿的滤膜盘的仪器通过切向流超滤进行脱盐。
获得4升残余物，用蒸馏水补至5升。用20mM的乙酸钠缓冲液将pH调到4.5。
于室温加入350个单位的得自黑曲霉的Sigma P-9179果胶水解酶。
将得到的混合溶液放置30分钟。
将这样得到的水解产物在配备有相同滤膜盘的同一仪器中进行连续超滤；在超滤期间水解继续进行并且用上述缓冲液将水解液的体积维持在5升；水解2小时后，再加入350个单位的果胶水解酶。
经过5小时水解和4.5小时的同步超滤，得到约12升超滤液。
用所述配备有孔径为500道尔顿的滤膜盘的超滤仪器处理超滤液(流速2到3l/h，压力低于2巴)。
这样可以从中除去有两个糖单位的寡聚果胶，并使它脱盐。
将残余物用5升蒸馏水洗两次，用实施例1中使用的ROTOVAPOR仪器于55℃通过蒸发浓缩到50ml，接着进行中和并冻干。
得到20g白色粉末，其中的寡聚果胶的分子量在500到10000道尔顿，即有3到50个糖单位。
相对于组成原材料的果胶，产率为50到60％。
用Blumenkrantz & Asboe-Hansen在分析化学(54，484-489页，(1973))中描述的方法和间位-羟苯法，发现糖醛酸含量为85％。
通过偶联电流计和采用DIONEXTM离子交换树脂(DionesChemical Crop.，Dow的子公司)所进行的离子层析分析表明所述粉末中的寡聚果胶实际上有3到9个糖单位，平均聚合度在4到6。
可以用无机酸，特别是盐酸或硫酸将组成原材料的果胶化学降解。
在通过皂化使含有所述果胶的原材料去酯化后，将其在有强酸(0.5M-1M)存在的条件下，于高温(具体说是90-110℃)温育3到6小时。
然后中和反应介质，并通过实施例1和2中描述的切向超滤方法分离出与分子量在500到10000道尔顿的寡聚果胶相应的组分以及与分子量在10000到30000道尔顿的寡聚果胶相应的组分。实施例3基于寡聚果胶的农用液体浓缩物寡聚果胶H190.200kgTween80 0.005kg羟苯甲酸甲酯的钠盐0.005kg水0.790kg总量 1.000kg优选在将10到50g，更优选25到50g的液体浓缩物稀释在1000升水中后再使用。
该稀释液可提供一种组合物，其中寡聚果胶H19的浓度为每1000升水中有2到10g，优选为5到10g。实施例4含有水解物H19作为活性物质和添加剂的可溶性浓缩物粉末每1kg粉末的重量组成如下寡聚果胶H19 0.150kg高岭土0.500kg甘露糖0.050kg羟苯甲酸甲酯的钠盐 0.005kg纯化淀粉 0.295kg总量 1.000kg
将浓缩粉末在足量水中稀释后使用，以此得到其中的寡聚果胶H19浓度为每1000升水中有2到10g，优选为5到10g的组合物。
在感染了壳针孢霉病的小麦上试验水解物H18和H19的效果；引起壳针孢霉病的病原菌是小麦壳针孢Septoria tritici。
在实施例5中描述了相应的实验。实施例5水解物H18和H19对感染了小麦壳针孢的小麦的效果的研究本实验使用300株已知对小麦壳针孢敏感的“Tendral”冬小麦的幼苗。
将幼苗种植在30个容器中，每个含有10株苗。
分成5组(A、B、C、D、E)，每组6个容器，换句话说，有6批每批10株幼苗。
每组中—通过在2-叶期(在Zadecks分级上的GS12期)向叶片喷洒含有0.1％的TWEEN20的蒸馏水来处理构成对照组的第一和第二批苗，—通过在2-叶期(在Zadecks分级上的GS12期)向叶片喷洒5ml包含水解物H18作为活性物质的第一种组合物来处理第三和第五批苗，—通过在2-叶期(在Zadecks分级上的GS12期)向叶片喷洒5ml包含水解物H19作为活性物质的第二种组合物来处理第四和第六批苗。
第一种和第二种组合物在有TWEEN20的蒸馏水中含有
—1mg/l水解物H18或H19(A组实验)—2mg/l水解物H18或H19(B组实验)—10mg/l水解物H18或H19(C组实验)—100mg/l水解物H18或H19(D组实验)—1000mg/l水解物H18或H19(E组实验)经以上喷洒处理后，将每组的6批苗于室温保持4小时以便将叶子表面的产物液滴干燥。然后将它们放置到人工气候室中，该室在12小时的照明期间维持在19℃，在12小时的黑暗期维持17℃，相对湿度为65％。
以上处理后48小时，通过喷洒每ml含有105小麦壳针孢性孢子的水悬液(有0.1％TWEEN20)将每组的第一、第三和第五批接种。
每组的第二、第四和第六批在用水解物H18和H19处理72小时后，用病原菌进行同样的接种。
将对照组的幼苗和接种了小麦壳针孢的几批苗放置到人工气候室中，该室在12小时的照明期间维持在19℃，在12小时的黑暗期维持17℃，前96小时的相对湿度为100％，随后为85％。
用小麦壳针孢进行第一和第二轮接种后过21天，检查4个组中的6批小麦苗。
通过保护百分比PP和感染强度II(均用百分比表示)来确定产品效果。
两个测量值均为相对对照组的定义。
“保护百分比”是用以下公式计算的
“感染强度”是用以下公式计算的
表1列出上述测定的结果。
表1
表1列出的结果表明—实验中检测的寡聚果胶的平均聚合度对结果影响很小—必须在病原菌感染前尽可能快地进行处理，从处理后72小时接种获得的结果比处理后48小时接种的结果好，并且
—所用组合物的浓度以大约2mg/l到约10mg/l为宜。
应特别注意到寡聚果胶在100mg/l时取得的保护显著低于10mg/l时的结果。还有最重要的是，对1000mg/l的剂量(即以为该剂量的防御反应最强烈)，无论是标记还是受研究的植物，被感染植物的数量和损伤大小并没有显著低于在未处理的对照组中所观察到的。实施例6表明水解物H18和H19加强植物天然防御力的实验进行了三项实验。
在第一个实验中，为了研究水解物H18和H19的直接诱导剂效果，将H18和H19浓度逐渐增加的一系列组合物施加给BY烟草细胞培养物，即—组合物中的H18浓度相继地为2mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l和200mg/l，以及—组合物中的H19浓度相继地为2mg/l和200mg/l。
对每种组合物检测四个防御反应标记，即—苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)活性，这是植物中合成植物抗毒素的关键酶，—O-甲基转移酶(OMT)活性，这个酶参与合成木质素，—脂肪氧化酶(LOX)活性，这个酶参与产生茉莉酮酸甲酯(即导致防御基因被激活的信号级联放大过程中的成分)，和—水杨酸(SA)浓度，该酸是参与防御反应的另一个第二信使。
将结果表示为表示所研究标记的诱导产生的因子，该因子代表在被诱导细胞和未被诱导的对照细胞中测量到的数值的比率。
上述在接种开始后4到48小时测量到的结果列于下表II。
表II
*NS＝不显著以上结果表明水解物H18和H19在被处理细胞中可诱导出防御反应，当使用浓度为20到200mg/l所述水解物时，标记的积累反映出这一点；另一方面，当诱导剂(即水解物H18和H19)浓度为2mg/l或10mg/l时，同一标记不会被诱导而产生显著量的积累。
在第二项实验中，在挑选出相同的BY烟草细胞培养物后，用水解物H18浓度等于2mg/l和10mg/l的组合物进行预处理。
7天后，用含有40mg/l水解物H18的组合物处理上述培养物和未处理的对照培养物。
在这种情况下模拟病原菌的攻击。
在处理后监测水杨酸(SA)积累的动力学达4到48小时。
测量表明受处理培养物细胞中积累的SA浓度不超过50ng/克干重。
测量还表明用H18进行的预处理，再在7天后用水解物诱导植物非常强烈地刺激了水杨酸的积累，这是完全没有预料到的；在以这样的方式处理的烟草细胞中，当H18预处理的浓度为2mg/l时，积累量达到700ng/克干重，当H18预处理的浓度为10mg/l时，积累量达到1200ng/克干重。
这证明了根据本发明的用途的加强防御力的效果。
在第三项实验中，使用了水解物H19和小麦叶片，在8天龄切下小麦苗的第一片叶子，用细砂纸摩擦并切成1cm的片段，使片段在适当的缓冲液中漂浮1小时。
制备21份，将其中的7份构成对照组。
将10mg/l水解物H19加入14份非对照组缓冲液中的7份中；将100mg/l水解物H19加入另外7份中。
随后保温18小时。
保温结束时，用200mg/l酵母β-葡聚糖(已知该产物能强烈刺激植物中的防御反应)来诱导21份叶片片段。
这时研究的标记是加入诱导剂后的几分钟内的过氧化氢积累量，其浓度通过叶片的温育介质的照度监测。
与未进行预处理的份中的叶片片段比较，用浓度为100mg/l的H19所做的预处理没有诱导出更大的过氧化氢积累量。
相反，用浓度为10mg/l的H19所做的预处理使过氧化氢积累量增加了2到20倍。
以上实验表明，当用浓度为2或10mg/l的水解物H18(实验2)或H19(实验3)做预处理时(即不直接诱导防御反应的浓度)，它们分别在预处理18小时和7天后，强烈地过诱导由诱导引发的防御反应，这是完全出乎人们意料的，另人惊讶。
还应注意，将水解物H19以100mg/l的浓度用于预处理时，没有加强效果。
权利要求
1.一种植物检疫组合物用于加强和刺激植物，特别是谷类(尤其是小麦)、马铃薯和葡萄的天然防御力的用途，该组合物包含1种或多种由150个以下糖单元(优选3到50，更优选3到20个糖单元)组成的寡聚果胶，所述寡聚果胶在组合物中的浓度为不直接诱导防御反应的浓度，即该浓度为1到20mg/l，优选2到10mg/l，更优选5到10mg/l。
2.处理植物，特别是谷物(尤其是小麦)、马铃薯和葡萄来增强和刺激它们的天然防御力的方法，即保证所述植物获得抗病原菌的预防性保护的方法，该方法的特征在于它包括对具体说是叶子或种子施用包含1种或多种由150个以下糖单元(优选3到50个，更优选3到20个糖单元)组成的寡聚果胶的组合物，所述寡聚果胶在组合物中的浓度为不直接诱导防御反应的浓度，即该浓度为1到20mg/l，优选2到10mg/l，更优选5到10mg/l。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于将包含1种或多种寡聚果胶的组合物施用给被处理的植物，其每公顷的施用量为不直接诱导防御反应的用量，即其用量为10到1000g，优选20到500g，更优选50到200g。
4.液态、粉末或颗粒状的浓缩物，在用适当量的溶剂(特别是水)将其稀释时，能提供依照权利要求1要求保护的用途来应用的组合物。
5.依照权利要求1要求保护的用途来应用的组合物，其中除了含有标准媒介物和组分外还包含1种或多种有150个以下糖单元(优选3到50个，更优选3到20个糖单元)的寡聚果胶，并且所述寡聚果胶在组合物中的浓度为不直接诱导防御反应的浓度，即该浓度为1到20mg/l，优选2到10mg/l，更优选5到10mg/l。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述载体是水或选自矿物油、植物油、所有的液态脂肪和醇类，特别是乙二醇或甘油；其中所述的标准组分选自溶剂、表面活性剂、分散剂和/或固体填充剂。
全文摘要
本发明涉及一种用于加强和刺激植物,特别是谷物(尤其是小麦)及马铃薯和葡萄的天然防御系统的方法,该方法使用含有1种或多种有150个以下糖单元(优选3到50,更优选3到20个糖单元)的寡聚果胶化合物的植物检疫组合物,所述寡聚果胶在组合物中的浓度不直接诱导防御反应,即其浓度为1到20mg/l,优选2到10mg/l,更优选5到10mg/l。
文档编号A01N43/02GK1253476SQ9880431
公开日2000年5月17日 申请日期1998年4月20日 优先权日1997年4月18日
发明者让-克洛德·伊温, 弗洛朗斯·克鲁兹, 让－马里耶·茹贝尔, 贝尔纳·克洛阿雷克, 克里斯托夫·理查德, 贝特朗·普莱兹, 玛格丽特·科普, 贝尔纳·弗里蒂格 申请人:格玛实验室股份有限公司