专利名称：一种昆虫病原线虫的液体培养方法
技术领域：
本发明涉及液体培养方法大量生产作为生物杀虫剂的昆虫病原线虫。
昆虫病原斯氏科Steinernematidae与异小杆科Heterorhabditidae线虫是新型生物杀虫剂。这类线虫具有广泛的寄主范围；对寄主具主动搜寻能力，特别是对土栖性及钻蛀性害虫；对人畜、环境安全。近年来，已广泛应用于防治农、林、牧草及卫生等害虫，受到国内外学者及商业部门的高度重视，并走向商品化。
这类线虫是以感染期虫态(infective juveniles,IJ)随寄主食物或从昆虫的自然开口(如肛门、气孔)、节间膜进入昆虫体内，随后释放肠腔中携带的Xenorhabdus属(目前与斯氏科线虫共生)或Photorhabdus属(目前与异小杆科线虫共生)的共生细菌。线虫以及共生细菌分泌的毒素(毒性因子)导致昆虫死亡。
昆虫病原线虫的大面积田间应用要求线虫的生产走向商业化。目前，线虫的工业化培养系统是通过无菌操作技术于各种人工培养基中加入单一共生细菌和无菌线虫完成的，即线虫的单菌体外培养系统。根据培养基质可分为固体培养[Bedding,R.A.(1984)Annals of Applied Biology 104,117-120；Wouts,W.M.(1981)Journal of Nematology 13,467-469]和液体培养[Pace et al.(1986)PCT Patent Application No.86/01074；Friedman et al.(1991)PCT PatentApplication No.89/04602；Surrey & Davies(1996)Journal of InvertebratePathology 67,92-99；Han,R.C.(1996)Nematologica 42,546-553；Ehlerset al.(1998)Biocontrol 43:77-86；Tachibana et al.(1997)US patent,Application No.403879]。固体培养方法技术含量相对较低，容易操作，可适应多种线虫。但需要大量人力、空间，派放大量废物。液体培养克服了固体培养的不足，是线虫产业化生产的主要方法。
昆虫病原线虫的生活史包括卵、一至四龄幼虫和成虫阶段。此类线虫均具有一个三龄的感染期虫态。该龄期的线虫不取食，于土壤中能存活一段较长时间，随时可入侵可能存在的寄主昆虫。在线虫的单菌体外培养系统中，线虫的典型发育模式如下。当线虫和共生细菌接入培养基后，由共生细菌产生的化学信息物质(Food signal)诱导感染期线虫发育，从感染期变为三龄期(L3)，四龄期(L4)至成虫。卵孵化后，从一龄幼虫(L1)，二龄幼虫(L2)，如营养条件良好，继续发育至L3,L4和新一代成虫；如营养条件恶化，L2可发育为感染期线虫。新一代感染期线虫仍可继续发育为L3，进行新的生活周期。斯氏线虫采用雌雄异体的繁殖方式；而异小杆线虫从感染期幼虫发育的第一代成虫为严格的雌雄同体，第二代成虫可存在雌雄异体和雌雄同体的混合个体。昆虫病原线虫的感染期幼虫是能侵染昆虫寄主的虫龄。在应用上，只有感染期线虫对环境因子具有一定的忍耐性，且对昆虫有感染力。因此，线虫体外液体培养时，感染期线虫占其它虫龄的比例以及培养周期至关重要。
一般地说，在营养丰富的培养基中加入高密度的线虫将有利于在最短的时间内获得最大数目的感染期线虫。但加入高密度的线虫将降低线虫的繁殖倍数，并且在经济上不合算。如果线虫能在第一代中达到最大数量的感染期虫态，将会缩短培养时间和降低培养成本。Pace et al.(1986)(PCT Patent Application No.86/01074)报道，以无菌蒸馏水稀释培养液并将培养液温度降至15℃，可得到60-90％的感染期线虫。但该方法操作时，既不方便又增加费用。Friedman et al.(1989)Tachibana et al.(1997)的专利中描述了线虫的培养基，以及根据线虫不同的龄期控制搅拌速率的方法，但未提及控制感染期线虫形成的方法。
本发明的目的是提出一种能控制并提高感染期线虫产量的昆虫病原线虫的液体培养方法。
本发明所提供的昆虫病原线虫的液体培养方法，其内容包括在常用的人工细菌培养基中，于无菌条件下接入初生期线虫的共生细菌和线虫，在搅拌、供氧的条件下，例如在在摇床震荡培养或供氧发酵罐中进行线虫液体培养，其特点是在线虫的发育期，主要是在线虫的关键发育龄期加入抗菌物质(即抗菌素)。使用的抗菌素包括所有对线虫共生菌株有抑制作用的种类，如金霉素(Chlorotetracycline)，链霉素(Streptomycin)，氯霉素(Chloramphenicol)，氨苄青霉素(Ampicillin),Nalidixic acid等，优先选择的是链霉素。抗菌素剂量范围为0.01-1μg/ml，依不同共生菌株和抗菌素种类而异。这一剂量范围的抗菌素可使部分菌株(＜20％CFU；CFU=colony forming unit)发生型变。所述的线虫的关键发育龄期一般选择在新一代一龄线虫L1出现后。
本发明方法中所述在常用的人工细菌培养基中所接入的线虫可以是各种龄期的线虫，而以接入感染期线虫为最佳。
本发明在线虫液体培养的发育龄期，利用抗菌物质于培养液中降低细菌密度和诱导共生细菌的变异型，降低了菌液的营养信息，改变部分共生细菌的生理状态，以控制和提高感染期线虫的形成，使线虫幼虫向感染期线虫方向发育，此外，还控制了业已形成的感染期线虫的进一步发育。本发明能大大提高培养液中感染期线虫的比例，缩短培养时间，提高昆虫病原线虫的液体培养效果。本方法可使线虫于8-16天内(依线虫种类而异)达到高比例的感染期虫态(＞95％)。
下列实验及操作实例是进一步对本发明的说明。应该指出，这些范例都是解说性的，不应该当作对本发明的限制。实例中仅描述S.carpocapsae A24线虫和H.bacteriophora H06线虫，但本专利的方法适用于所有线虫种和品系。
实施例一于500ml三角瓶中加入100ml液体培养基(2％黄豆粉，1％面粉，0.5％酵母膏，1.2％蛋粉，3％玉米油和92.3％水)，121℃下高压消毒30分钟。然后接入从S.carpocapsae A24线虫中分离出的X.nematophilus初生型共生菌(5×108菌体)，置于25℃、150rpm下摇床培养48小时，再接入5000条/ml S.carpocapsae感染期线虫，接入线虫后第二天起取样于解剖镜下检查线虫的发育情况，培养4天后于培养瓶中加入0.05μg/ml硫酸链霉素。48小时后，取样于解剖镜下检查线虫的发育情况，接虫后第8,10,12和16天计数线虫产量和感染期线虫比例。
实施例二于500ml三角瓶中加入100ml液体培养基(2％黄豆粉，1％面粉，0.5％酵母膏，1.2％蛋粉，3％玉米油和92.3％水)，121℃下高压消毒30分钟。然后接入从H.bacteriophora线虫中分离出的P.luminescens初生型共生菌(5×108菌体)，置于25℃、150rpm下摇床培养48小时，再接入5000条/mlH.bacteriophora感染期线虫，接入线虫后第二天起取样于解剖镜下检查线虫的发育情况，培养6天后于培养瓶中加入0.05μg/ml硫酸链霉素。48小时后，取样于解剖镜下检查线虫的发育情况，接虫后第8,10,12和16天计数线虫产量和感染期线虫比例。
上述实施例一和实施例二所述的Xenorhabdus和Photorhabdus初生型共生细菌的分离的方法如下从昆虫病原线虫感染的大蜡螟末龄(七龄)幼虫Galleria mellonella，置于25℃下，昆虫死亡后(一般2至4天)，以70％酒精体表消毒死虫，然后用无菌剪刀剪开虫体，取血淋巴划NBTA,NA和麦康凯平板。根据Akhurst(1980)(Journal of General Microbiology 121,303-309)描述的方法鉴定线虫共生细菌。从S.carpocapsae A24线虫中分离出X.nematophilus共生菌；从H.bacteriophora线虫中分离出P.luminescens共生菌。
实施例一和实施例二所述的昆虫病原线虫液体培养方法与常规方法(即未加抗菌物质的)比较结构显示加入硫酸链霉素后，S.carpocapsae线虫于8天时的感染期线虫比例达到95％，感染期线虫产量为267×1000/ml；而未加硫酸链霉素的培养瓶的感染期线虫比例为6％，感染期线虫产量为18×1000/ml，虽然线虫总产量为304×1000/ml。12天后，加入硫酸链霉素的培养瓶的感染期线虫比例达到97％，而未加硫酸链霉素的培养瓶的感染期线虫比例为32％。可见，加入硫酸链霉素后，使线虫向感染期虫态发育，缩短了培养时间。
H.bacteriophora线虫培养液中加入硫酸链霉素后，于10天时的感染期线虫比例达到96％，感染期线虫产量为197×1000/ml；而未加硫酸链霉素的培养瓶的感染期线虫比例为84％，感染期线虫产量为178×1000/ml。16天后，加入硫酸链霉素的培养瓶的感染期线虫比例达到98％，而未加硫酸链霉素的培养瓶的感染期线虫比例为89％。可见，加入硫酸链霉素后，也使线虫向感染期虫态发育，缩短了培养时间。
权利要求
1．一种昆虫病原线虫的液体培养方法，包括在人工培养基中，于无菌条件下接入初生型线虫共生细菌和线虫，在通气、搅拌的培养环境下进行线虫液体培养，其特征在于在线虫的发育期加入抗菌物质。
2．根据权利要求1所述的昆虫病原线虫的液体培养方法，其特征在于所述的抗菌物质的加入时间为线虫新一代一龄幼虫L1出现后的发育关键龄期。
3．根据权利要求1所述的昆虫病原线虫的液体培养方法，其特征在于所述的抗菌物质的加入量为每毫升培养基0.01～1μg。
4．根据权利要求1或2或3所述的昆虫病原线虫的液体培养方法，其特征在于所述的抗菌物质为链霉素。
5．根据权利要求1所述的昆虫病原线虫的液体培养方法，其特征在于培养中在人工培养基中所接入的线虫的感染期线虫。
全文摘要
本发明提供一种用作生物杀虫剂的昆虫病原线虫的液体培养方法,该方法是在昆虫病原线虫液体单菌培养系统中,于线虫发育的关键龄期加入抗菌物质,以改变菌体密度和诱导共生菌产生变异型,控制感染期线虫的形成,提高感染期线虫的产量,本方法可使线虫于8～16天内,达到比例高达95%以上的感染期虫态。
文档编号A01N63/00GK1300817SQ9911729
公开日2001年6月27日 申请日期1999年12月17日 优先权日1999年12月17日
发明者韩日畴, 李丽英 申请人:广东省昆虫研究所